基于PCR的染色體步查技術(shù)措勢奴晃棵睡藕鄲眨淡擰籬膀瞇簿晰麻似瞥鉚比干燴浙暇試糠姜眶苦呻哩基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)措勢奴晃棵睡藕鄲眨淡擰籬膀瞇簿晰麻1染色體步查(Chromosomewalking)是指由生物基因組或基因組文庫中的已知序列出發(fā),逐步探知其旁鄰的未知序列或與已知序列呈線性關(guān)系的目的序列的核苷酸組成的方法和過程。

經(jīng)典的染色體步查方法比較煩瑣，適合于長距離步行，而基于PCR的染色體步行技術(shù)相對而言則比較簡便，適合于短距離步行。孺碎晴苗擰超曉鎂蚤替蝕貧雷班蓄母撰性氨丹絮芭刀寂咖務(wù)翅榔匪峻皖浙基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)染色體步查(Chromosomewalking)經(jīng)2基于PCR的染色體步查技術(shù)

典型的PCR反應(yīng)需要2個分別位于目的序列兩端的引物，而在染色體步行時目的序列只有一端是已知的，因此利用PCR技術(shù)進行染色體步行的關(guān)鍵在于提供PCR需要的另一個引物。利用載體或接頭的PCR技術(shù)利用引物錯配的染色體步查技術(shù)利用隨機引物的染色體步查技術(shù)(TAIL-PCR)

絳傣逼穎籽洗畜購虎深歹撒鷗預(yù)振蒜備冷列項幼咳精汗萬邀灌翼源倦釀弓基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)典型的PCR反應(yīng)需要2個分3利用載體或接頭的PCR技術(shù)

這類方法的第一步通常都是酶切基因組DNA，連接載體或接頭,以提供PCR需要的另一端引物.利用載體的PCR利用接頭的PCR寡聚盒介導(dǎo)的PCR環(huán)狀PCRI-PCR(InversePCR)P-PCR(PanhandlePCR)娘掂耳繪舌砧繁吵很繪草督巳局協(xié)箭紙泳恥桿微蓋蕪浮警酞懦蜀暑晝清匝基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)利用載體或接頭的PCR技術(shù)娘掂耳繪舌砧繁吵很繪草督巳局協(xié)箭紙4利用載體的PCR1989年，Shyamala等利用單特異引物PCR(singlespecificprimerPCR,SSP—PCR)以小鼠傷寒桿菌組氨酸轉(zhuǎn)運操縱子為起點進行連續(xù)步查。用PstI+AraIM酶切基因組DNA，PstI+XmaI酶切載體DNA,然后連接基因組片段和載體片段，用根據(jù)基因組DNA序列設(shè)計的特異引物和載體的通用引物進行擴增.由于非特異片段沒有特異引物的結(jié)合位點,即使有載體連接到非特異片段，它也不能得到大量擴增，而使特異片段得到有效擴增。在這種方法中，如果用合適的接頭代替載體效果也會一樣。這種方法原理簡單，實驗設(shè)計簡便，但操作較為繁瑣，特異性較低，即使用嵌套引物擴增也往往會造成非特異性擴增，產(chǎn)物仍需雜交進一步確定。之后出現(xiàn)了一些方法利用不同的技術(shù)增強PCR的特異性。菌恤婚齒李證靈皮該高來凌剩屎釋謠斥膘揖藤波雖冠吏葫諾毆瘡磨購達左基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)利用載體的PCR菌恤婚齒李證靈皮該高來凌剩屎釋謠斥膘揖藤波雖5利用接頭的PCR1995年，Siebert結(jié)合VectorettePCR和SuppressionPCR設(shè)計改進了利用接頭的PCR。主真頑鄂壽瓤匿鈕辱揍州娘囚豁成枚撮謂樞兌污氣贖伸謀柿迅捉廓娥侶蟹基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)利用接頭的PCR主真頑鄂壽瓤匿鈕辱揍州娘囚豁成枚撮謂樞兌污6(1)選擇合適的酶切位點酶切總基因組；(2)用連接反應(yīng)將人工合成的接頭連接在酶切片斷兩端；(3)S-PCR(suppressionPCR)

所連接的雙鏈接頭是反向重復(fù)序列。A,如果PCR產(chǎn)物的兩末端是雙鏈接頭序列，由于反向末端重復(fù)序列的存在，每條DNA鏈的末端就要形成panhandle結(jié)構(gòu)，故而阻止PCR的指數(shù)增加。B,如果PCR產(chǎn)物一端是特異引物序列，另一端是接頭序列時形不成panhandle結(jié)構(gòu)，PCR擴增正常進行。耀墩卵殃鬼沼牟攀宗戶卞諒蕾蟹疊跡竟乒蔗隙堡蛻途煎述像漂船暑厄藤啥基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)(1)選擇合適的酶切位點酶切總基因組；(2)用連接反應(yīng)將人工7(4)'vectorette’接頭由一條長鏈和一條短鏈組成;短鏈3‘端用-NH2封閉,使接頭中的短鏈不會在PCR開始時自身延長;在第一個延伸反應(yīng)中,接頭引物無模板配對,只有特異引物起作用延伸出一條單鏈;在第二個延伸反應(yīng)中,接頭引物才能以第一個反應(yīng)中延伸出的單鏈為模板開始擴增.NH2NH2閩犯然慕咬餅注權(quán)花欠誹貿(mào)妒謙坯納老疹單茨老拔船遞輔欺捌堡籠巢似硒基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)NH2NH2閩犯然慕咬餅注權(quán)花欠誹貿(mào)妒謙坯納老疹單茨老拔船遞8GelelectrophoresisanalysisoftherepresentativePCRproductsderivedfromL.borgpeterseniigenomicDNA.ThePCRwalkingtemplateswerepreparedfromEcoRV-digestedDNAorfromPvuIIdigestedL.borgpeterseniigenomicDNA.Lane1,DNAmarker;lane2,primaryPCRproductsfromprimersAP1andP12;lane3,secondaryPCRproductsfromprimersAP2andP13.ThearrowindicatesthePCRfragmentthatwasclonedforsequencing.刨竅疇嶄撞雁漫常賤運錦饋賣堪主恕抬招泡魄悼深評鞘纓渝鎂禽紛背貍滬基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)Gelelectrophoresisanalysiso92000年，MogensKilstrup進一步改進此方法.不要求接頭的兩條寡核苷酸鏈一長一短，而使接頭兩端均為-OH,不含磷酸基團。在第一個變性反應(yīng)時，和接頭引物配對的接頭寡核苷酸鏈會游離出來；在第二個延伸反應(yīng)中,接頭引物才能以第一個反應(yīng)中延伸出的單鏈為模板開始擴增.念茁滄眠老饑賀鐮機呼丙鈉沒見攘傲弊兼敬烤頻浸子摳吊蘊鈉壩甲娛閡播基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)2000年，MogensKilstrup進一步改進此方法10A,B,CEcoRI酶切基因組的擴增產(chǎn)物D,E,FHindIII酶切基因組的擴增產(chǎn)物A,D只加接頭引物B,C,E,F不同的特異引物和接頭引物命縱衡烯棄堿梢麗愉秀獵衍臍靈假菠痘模卿剿錯又吵躁服釉搪腮盜次骸宵基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)A,B,CEcoRI酶切基因組的擴增產(chǎn)物命縱衡烯棄堿梢麗愉11寡聚盒介導(dǎo)的PCR

寡聚盒介導(dǎo)PCR是利用雙鏈接頭進行染色體步行的方法，為了增加反應(yīng)的特異性他們在一個特異引物上增加了便于選擇特異產(chǎn)物的生物素標記。寡聚盒介導(dǎo)PCR在第一次PCR反應(yīng)中用帶有生物素標記的特異引物進行單引物PCR，合成含有目的序列和接頭序列的單鏈DNA產(chǎn)物，而后用鏈霉親和素覆蓋的磁珠在反應(yīng)混合物中捕捉分離帶有生物素標記的單鏈產(chǎn)物，以回收的單鏈產(chǎn)物為模板用無標記的嵌套特異引物和接頭引物進行第二次PCR擴增，終產(chǎn)物純化后直接進行測序。由于在特異引物上增加了有利于選擇特異產(chǎn)物的生物素標記，這種技術(shù)的特異性比較高。茨哥值盔韌摯池縫刮禍葦狂鮮誘木睬芯瀉契鴨鄉(xiāng)吐晦割粵三饞命琢盅筋闌基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)寡聚盒介導(dǎo)的PCR茨哥值盔韌摯池縫刮禍葦狂鮮誘木睬芯瀉契鴨鄉(xiāng)12環(huán)狀PCR

環(huán)狀PCR是能夠根據(jù)已知序列設(shè)計兩對嵌套PCR引物進行染色體步行的方法。包括I-PCR(InversePCR)P-PCR(PanhandlePCR)

I-PCR與P-PCR的不同之處在于前者用DNA連接酶使酶切片段自連產(chǎn)生環(huán)狀模板，而后者則利用末端反向重復(fù)序列與已知序列互補配對形成環(huán)狀單鏈模板。澇年霄沽傘礎(chǔ)浚騙輔砂抬僅揚淮湛蛀教甄凳薄垂濺賢曲蓄幾販屏崗爭趣讕基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)環(huán)狀PCR澇年霄沽傘礎(chǔ)浚騙輔砂抬僅揚淮湛蛀教甄凳薄垂濺賢曲蓄13I-PCR(InversePCR):基因組DNA經(jīng)酶切后自連成環(huán)狀分子;再用另外一種限制性內(nèi)切酶在已知序列處切開，又成線狀DNA;根據(jù)兩端序列設(shè)計引物進行PCR擴增。I-PCR被用于從酵母基因組DNA中分離YAC克隆末端，也被成功的應(yīng)用于從植物基因組DNA中分離轉(zhuǎn)座子側(cè)翼的特異區(qū)域。主要缺點:需控制酶切片段長度,長度太長會使擴增效率下降;環(huán)化反應(yīng)難以控制，有線狀串聯(lián)體成為副產(chǎn)物甚至是主要產(chǎn)物，導(dǎo)致非特異性擴增.碑束躊伴避菜圖綽估楷變溪淤叛末咖窯拜修搖幸剛帆撒淖碳苫瘓局畢何葫基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)I-PCR(InversePCR):碑束躊伴避菜圖綽估14P-PCR(PanhandlePCR）與I－PCR相比，P－PCR是利用末端反向重復(fù)序列與已知序列互補配對形成環(huán)狀單鏈模板。糊柔禾曝屢幌牡躁蹤鎊咯林武歡讓屠夯疾鎳嗓矮懈祖挾使能鋁虐皮趙房知基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)P-PCR(PanhandlePCR）與I－PC15墅茍藻亥坐踴槐屈原鍬要遇銅賞磚硯典牽拋棍資賞鹿優(yōu)曼搔挖乖忱藐挫摻基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)墅茍藻亥坐踴槐屈原鍬要遇銅賞磚硯典牽拋棍資賞鹿優(yōu)曼搔挖乖忱藐16嵌套PCR(NestedPCR)黨嫡圃攬贓九縷巒狗阿陵找樓盞呈脅犁礁純婿啪訂柜翅櫻膨悉諒痕騁卻固基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)嵌套PCR黨嫡圃攬贓九縷巒狗阿陵找樓盞呈脅犁礁純婿啪訂柜翅櫻17利用引物錯配的染色體步查技術(shù)在PCR過程中總有或多或少的產(chǎn)物是由錯配的引物延伸而生成的，這本來是影響PCR反應(yīng)特異性的不利因素．但是PCR是一種相當靈活的技術(shù)，Screaton等和Parker等報道的染色體步查技術(shù)就是根據(jù)PCR的這一性質(zhì)而設(shè)計的。馴走渤訣廓鉚銳毀止濺贈爛鍵靶辜祭測恭優(yōu)揉授籮憑團較屏冶砌污咯佛爽基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)利用引物錯配的染色體步查技術(shù)在PCR過程中總有或多或18Screaton等發(fā)現(xiàn)只用一個引物的PCR反應(yīng)也能生成少量雙鏈DNA產(chǎn)物，這是由于在不嚴格的反應(yīng)條件下引物發(fā)生錯配引起的。引物的錯配可以產(chǎn)生多種長度不同的產(chǎn)物:真實結(jié)合位點與另一端錯配位點之間的擴增兩個錯配位點之間的擴增(錯配的結(jié)果將可以產(chǎn)生一些含有目的片段的產(chǎn)物。)在一系列不同的退火溫度下用特異性單引物1分別進行了60個循環(huán)的PCR，接著把在不同退火溫度下獲得的PCR產(chǎn)物合并后用特異引物2作為測序引物共同進行測序。

對人類基因組0D44座位步行的結(jié)果證明這種方法是可靠的，他們還用這種方法克隆了人類TCRBV2S1基因的啟動子序列，所使用的引物中大約有50％能夠在某一溫度下產(chǎn)生大量含有目的序列的產(chǎn)物，并且可以用特異引物2進行測序。與其它方法相比，這種方法速度快、不需要在多個電泳條帶中篩選目的片段和克隆。協(xié)讒卻妥蛇考緬曉冠舵旺邁道還紫廟岳由喉葦錫檀瞎昆星易他筐拾匣醞謙基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)Screaton等發(fā)現(xiàn)只用一個引物的PCR反應(yīng)也能生成少量雙19Parker等發(fā)現(xiàn)只要在3’末端最后2個堿基可以正確配對并且3’末端具有部分的同源性，引物不但可以在特異的靶序列而且也可以在非特異序列啟動PCR，一個符合上述要求的引物即使有50％的堿基發(fā)生錯配仍然可以有效的誘導(dǎo)延伸反應(yīng)。他們根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)設(shè)計了TGW—PCR(TargetedGeneWalkingPCR).在TGW—PCR中除了兩個特異性的嵌套引物外，還需要一組已知與模板DNA有多個雜交位點的步查引物。先以完整的基因組DNA為模板，用特異引物分別與不同的步行引物配對進行一組平行的PCR反應(yīng)。之后以上述每個反應(yīng)的產(chǎn)物為模板，用帶有放射性標記的嵌套引物和相應(yīng)的步查引物進行嵌套PCR。反應(yīng)產(chǎn)物進行電泳，經(jīng)放射自顯影檢測后從凝膠中回收帶有標記的條帶,再一次擴增，產(chǎn)物直接測序.紛刊衙腿眩晝汗呆愿磷術(shù)碟柵惟蔽辜控貝庸桿適瓦蹤喬摻巨薄粱遼胳容柯基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)Parker等發(fā)現(xiàn)只要在3’末端最后2個堿基可以正確20利用隨機引物的染色體步查技術(shù)很早就有用隨機引物進行染色體步查的技術(shù)，但是由于無法有效地控制由隨機引物引發(fā)的非特異產(chǎn)物的產(chǎn)生，這類方法末得到廣泛應(yīng)用.劉耀光等提出的TAIL-PCR(ThermalAsymmetricInterlacedPCR)巧妙的解決了這個問題。朽具輥稗炳遠鍛志諒碑粗號墊嗡逼眩才揖圾動魚去車迭邁靖榷茍傈南嫡絨基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)利用隨機引物的染色體步查技術(shù)很早就有用隨機引物進行染21在利用特異引物和隨機引物進行的PCR中一般有3種產(chǎn)物生成：由特異引物和隨機引物共同延伸產(chǎn)生的I型產(chǎn)物由特異引物單獨延伸生成的II型產(chǎn)物兩端由隨機引物延伸生成的III型產(chǎn)物。其中I、II型產(chǎn)物中的非特異性產(chǎn)物可以用嵌套特異引物進行嵌套PCR除去。III型產(chǎn)物則不能，因此是PCR中主要的背景。TAIL-PCR用特殊的熱循環(huán)程序使PCR反應(yīng)有利于I型產(chǎn)物的擴增，而抑制III型非特異性產(chǎn)物。這種策略的關(guān)鍵是TAIL-PCR中使用的較長的高退火溫度的嵌套特異引物和較短的低退火溫度的隨機簡并引物，由于兩種引物的退火溫度有明顯的差異，這樣就可以通過控制PCR循環(huán)中的退火溫度決定在PCR反應(yīng)中何種引物能夠占優(yōu)勢，從而控制不同類型產(chǎn)物的生成。遏墮容毖敷浩值擊入篆弊李帝越類翱鋤喲甭絹蔭插逐撼速恿鋪戎鋁升玩囪基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)在利用特異引物和隨機引物進行的PCR中一般有3種產(chǎn)物生成：其22在之后的擴增中高嚴謹度和中嚴謹度循環(huán)交錯進行，如此重復(fù)這樣的交錯循環(huán)，可以使目的序列的擴增大大超過非特異性產(chǎn)物，從而控制持異產(chǎn)物和非特異產(chǎn)物的生成比例。兩端都由特異引物延伸而成的II型產(chǎn)物是由特異引物的錯配產(chǎn)生的，這種產(chǎn)物雖然極具競爭性，但是在第二和第三次反應(yīng)中可以用嵌套特異引物剔除。淫肌澗夜?jié)i槐尼壹鋸褥廂誣驕外棠箔臥遙毆億挖云肥碴美喪醇癱糞省槳紐基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)在之后的擴增中高嚴謹度和中嚴謹度循環(huán)交錯進行，如此重復(fù)這樣的23雍事澳疾久擒屎琶肄強萄屆收癰閏帆擯薯耪戊蒜防吸或湘榮浪耗振慫莽切基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)雍事澳疾久擒屎琶肄強萄屆收癰閏帆擯薯耪戊蒜防吸或湘榮浪耗振慫24誹擎擎丫與散浸扁虎買賀俗始疫揖稼脆督坑害蛹疼卸柄旋短蠕棺微塵冶磷基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)誹擎擎丫與散浸扁虎買賀俗始疫揖稼脆督坑害蛹疼卸柄旋短蠕棺微塵25一般的說，進行兩次TAIL-PCR反應(yīng)就可以把背景降的很低，如果在第二次反應(yīng)后仍然有明顯的III型產(chǎn)物就有必要進行第三次反應(yīng).TAIL-PCR的關(guān)鍵是選擇合適的特異引物和隨機簡并引物，一套合適的引物可以使反應(yīng)表現(xiàn)很高的特異性.鈔嚨蓄為瑤脖溫劉胡改停八銹羊球徽柴激癌謅怯脯岡里歸文職雞迭但尊檸基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)一般的說，進行兩次TAIL-PCR反應(yīng)就可以把背景降26基于PCR的染色體步查技術(shù)措勢奴晃棵睡藕鄲眨淡擰籬膀瞇簿晰麻似瞥鉚比干燴浙暇試糠姜眶苦呻哩基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)措勢奴晃棵睡藕鄲眨淡擰籬膀瞇簿晰麻27染色體步查(Chromosomewalking)是指由生物基因組或基因組文庫中的已知序列出發(fā),逐步探知其旁鄰的未知序列或與已知序列呈線性關(guān)系的目的序列的核苷酸組成的方法和過程。

經(jīng)典的染色體步查方法比較煩瑣，適合于長距離步行，而基于PCR的染色體步行技術(shù)相對而言則比較簡便，適合于短距離步行。孺碎晴苗擰超曉鎂蚤替蝕貧雷班蓄母撰性氨丹絮芭刀寂咖務(wù)翅榔匪峻皖浙基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)染色體步查(Chromosomewalking)經(jīng)28基于PCR的染色體步查技術(shù)

典型的PCR反應(yīng)需要2個分別位于目的序列兩端的引物，而在染色體步行時目的序列只有一端是已知的，因此利用PCR技術(shù)進行染色體步行的關(guān)鍵在于提供PCR需要的另一個引物。利用載體或接頭的PCR技術(shù)利用引物錯配的染色體步查技術(shù)利用隨機引物的染色體步查技術(shù)(TAIL-PCR)

絳傣逼穎籽洗畜購虎深歹撒鷗預(yù)振蒜備冷列項幼咳精汗萬邀灌翼源倦釀弓基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)典型的PCR反應(yīng)需要2個分29利用載體或接頭的PCR技術(shù)

這類方法的第一步通常都是酶切基因組DNA，連接載體或接頭,以提供PCR需要的另一端引物.利用載體的PCR利用接頭的PCR寡聚盒介導(dǎo)的PCR環(huán)狀PCRI-PCR(InversePCR)P-PCR(PanhandlePCR)娘掂耳繪舌砧繁吵很繪草督巳局協(xié)箭紙泳恥桿微蓋蕪浮警酞懦蜀暑晝清匝基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)利用載體或接頭的PCR技術(shù)娘掂耳繪舌砧繁吵很繪草督巳局協(xié)箭紙30利用載體的PCR1989年，Shyamala等利用單特異引物PCR(singlespecificprimerPCR,SSP—PCR)以小鼠傷寒桿菌組氨酸轉(zhuǎn)運操縱子為起點進行連續(xù)步查。用PstI+AraIM酶切基因組DNA，PstI+XmaI酶切載體DNA,然后連接基因組片段和載體片段，用根據(jù)基因組DNA序列設(shè)計的特異引物和載體的通用引物進行擴增.由于非特異片段沒有特異引物的結(jié)合位點,即使有載體連接到非特異片段，它也不能得到大量擴增，而使特異片段得到有效擴增。在這種方法中，如果用合適的接頭代替載體效果也會一樣。這種方法原理簡單，實驗設(shè)計簡便，但操作較為繁瑣，特異性較低，即使用嵌套引物擴增也往往會造成非特異性擴增，產(chǎn)物仍需雜交進一步確定。之后出現(xiàn)了一些方法利用不同的技術(shù)增強PCR的特異性。菌恤婚齒李證靈皮該高來凌剩屎釋謠斥膘揖藤波雖冠吏葫諾毆瘡磨購達左基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)利用載體的PCR菌恤婚齒李證靈皮該高來凌剩屎釋謠斥膘揖藤波雖31利用接頭的PCR1995年，Siebert結(jié)合VectorettePCR和SuppressionPCR設(shè)計改進了利用接頭的PCR。主真頑鄂壽瓤匿鈕辱揍州娘囚豁成枚撮謂樞兌污氣贖伸謀柿迅捉廓娥侶蟹基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)利用接頭的PCR主真頑鄂壽瓤匿鈕辱揍州娘囚豁成枚撮謂樞兌污32(1)選擇合適的酶切位點酶切總基因組；(2)用連接反應(yīng)將人工合成的接頭連接在酶切片斷兩端；(3)S-PCR(suppressionPCR)

所連接的雙鏈接頭是反向重復(fù)序列。A,如果PCR產(chǎn)物的兩末端是雙鏈接頭序列，由于反向末端重復(fù)序列的存在，每條DNA鏈的末端就要形成panhandle結(jié)構(gòu)，故而阻止PCR的指數(shù)增加。B,如果PCR產(chǎn)物一端是特異引物序列，另一端是接頭序列時形不成panhandle結(jié)構(gòu)，PCR擴增正常進行。耀墩卵殃鬼沼牟攀宗戶卞諒蕾蟹疊跡竟乒蔗隙堡蛻途煎述像漂船暑厄藤啥基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)(1)選擇合適的酶切位點酶切總基因組；(2)用連接反應(yīng)將人工33(4)'vectorette’接頭由一條長鏈和一條短鏈組成;短鏈3‘端用-NH2封閉,使接頭中的短鏈不會在PCR開始時自身延長;在第一個延伸反應(yīng)中,接頭引物無模板配對,只有特異引物起作用延伸出一條單鏈;在第二個延伸反應(yīng)中,接頭引物才能以第一個反應(yīng)中延伸出的單鏈為模板開始擴增.NH2NH2閩犯然慕咬餅注權(quán)花欠誹貿(mào)妒謙坯納老疹單茨老拔船遞輔欺捌堡籠巢似硒基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)NH2NH2閩犯然慕咬餅注權(quán)花欠誹貿(mào)妒謙坯納老疹單茨老拔船遞34GelelectrophoresisanalysisoftherepresentativePCRproductsderivedfromL.borgpeterseniigenomicDNA.ThePCRwalkingtemplateswerepreparedfromEcoRV-digestedDNAorfromPvuIIdigestedL.borgpeterseniigenomicDNA.Lane1,DNAmarker;lane2,primaryPCRproductsfromprimersAP1andP12;lane3,secondaryPCRproductsfromprimersAP2andP13.ThearrowindicatesthePCRfragmentthatwasclonedforsequencing.刨竅疇嶄撞雁漫常賤運錦饋賣堪主恕抬招泡魄悼深評鞘纓渝鎂禽紛背貍滬基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)Gelelectrophoresisanalysiso352000年，MogensKilstrup進一步改進此方法.不要求接頭的兩條寡核苷酸鏈一長一短，而使接頭兩端均為-OH,不含磷酸基團。在第一個變性反應(yīng)時，和接頭引物配對的接頭寡核苷酸鏈會游離出來；在第二個延伸反應(yīng)中,接頭引物才能以第一個反應(yīng)中延伸出的單鏈為模板開始擴增.念茁滄眠老饑賀鐮機呼丙鈉沒見攘傲弊兼敬烤頻浸子摳吊蘊鈉壩甲娛閡播基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)2000年，MogensKilstrup進一步改進此方法36A,B,CEcoRI酶切基因組的擴增產(chǎn)物D,E,FHindIII酶切基因組的擴增產(chǎn)物A,D只加接頭引物B,C,E,F不同的特異引物和接頭引物命縱衡烯棄堿梢麗愉秀獵衍臍靈假菠痘模卿剿錯又吵躁服釉搪腮盜次骸宵基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)A,B,CEcoRI酶切基因組的擴增產(chǎn)物命縱衡烯棄堿梢麗愉37寡聚盒介導(dǎo)的PCR

寡聚盒介導(dǎo)PCR是利用雙鏈接頭進行染色體步行的方法，為了增加反應(yīng)的特異性他們在一個特異引物上增加了便于選擇特異產(chǎn)物的生物素標記。寡聚盒介導(dǎo)PCR在第一次PCR反應(yīng)中用帶有生物素標記的特異引物進行單引物PCR，合成含有目的序列和接頭序列的單鏈DNA產(chǎn)物，而后用鏈霉親和素覆蓋的磁珠在反應(yīng)混合物中捕捉分離帶有生物素標記的單鏈產(chǎn)物，以回收的單鏈產(chǎn)物為模板用無標記的嵌套特異引物和接頭引物進行第二次PCR擴增，終產(chǎn)物純化后直接進行測序。由于在特異引物上增加了有利于選擇特異產(chǎn)物的生物素標記，這種技術(shù)的特異性比較高。茨哥值盔韌摯池縫刮禍葦狂鮮誘木睬芯瀉契鴨鄉(xiāng)吐晦割粵三饞命琢盅筋闌基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)寡聚盒介導(dǎo)的PCR茨哥值盔韌摯池縫刮禍葦狂鮮誘木睬芯瀉契鴨鄉(xiāng)38環(huán)狀PCR

環(huán)狀PCR是能夠根據(jù)已知序列設(shè)計兩對嵌套PCR引物進行染色體步行的方法。包括I-PCR(InversePCR)P-PCR(PanhandlePCR)

I-PCR與P-PCR的不同之處在于前者用DNA連接酶使酶切片段自連產(chǎn)生環(huán)狀模板，而后者則利用末端反向重復(fù)序列與已知序列互補配對形成環(huán)狀單鏈模板。澇年霄沽傘礎(chǔ)浚騙輔砂抬僅揚淮湛蛀教甄凳薄垂濺賢曲蓄幾販屏崗爭趣讕基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)環(huán)狀PCR澇年霄沽傘礎(chǔ)浚騙輔砂抬僅揚淮湛蛀教甄凳薄垂濺賢曲蓄39I-PCR(InversePCR):基因組DNA經(jīng)酶切后自連成環(huán)狀分子;再用另外一種限制性內(nèi)切酶在已知序列處切開，又成線狀DNA;根據(jù)兩端序列設(shè)計引物進行PCR擴增。I-PCR被用于從酵母基因組DNA中分離YAC克隆末端，也被成功的應(yīng)用于從植物基因組DNA中分離轉(zhuǎn)座子側(cè)翼的特異區(qū)域。主要缺點:需控制酶切片段長度,長度太長會使擴增效率下降;環(huán)化反應(yīng)難以控制，有線狀串聯(lián)體成為副產(chǎn)物甚至是主要產(chǎn)物，導(dǎo)致非特異性擴增.碑束躊伴避菜圖綽估楷變溪淤叛末咖窯拜修搖幸剛帆撒淖碳苫瘓局畢何葫基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)I-PCR(InversePCR):碑束躊伴避菜圖綽估40P-PCR(PanhandlePCR）與I－PCR相比，P－PCR是利用末端反向重復(fù)序列與已知序列互補配對形成環(huán)狀單鏈模板。糊柔禾曝屢幌牡躁蹤鎊咯林武歡讓屠夯疾鎳嗓矮懈祖挾使能鋁虐皮趙房知基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)P-PCR(PanhandlePCR）與I－PC41墅茍藻亥坐踴槐屈原鍬要遇銅賞磚硯典牽拋棍資賞鹿優(yōu)曼搔挖乖忱藐挫摻基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)墅茍藻亥坐踴槐屈原鍬要遇銅賞磚硯典牽拋棍資賞鹿優(yōu)曼搔挖乖忱藐42嵌套PCR(NestedPCR)黨嫡圃攬贓九縷巒狗阿陵找樓盞呈脅犁礁純婿啪訂柜翅櫻膨悉諒痕騁卻固基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)嵌套PCR黨嫡圃攬贓九縷巒狗阿陵找樓盞呈脅犁礁純婿啪訂柜翅櫻43利用引物錯配的染色體步查技術(shù)在PCR過程中總有或多或少的產(chǎn)物是由錯配的引物延伸而生成的，這本來是影響PCR反應(yīng)特異性的不利因素．但是PCR是一種相當靈活的技術(shù)，Screaton等和Parker等報道的染色體步查技術(shù)就是根據(jù)PCR的這一性質(zhì)而設(shè)計的。馴走渤訣廓鉚銳毀止濺贈爛鍵靶辜祭測恭優(yōu)揉授籮憑團較屏冶砌污咯佛爽基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)利用引物錯配的染色體步查技術(shù)在PCR過程中總有或多或44Screaton等發(fā)現(xiàn)只用一個引物的PCR反應(yīng)也能生成少量雙鏈DNA產(chǎn)物，這是由于在不嚴格的反應(yīng)條件下引物發(fā)生錯配引起的。引物的錯配可以產(chǎn)生多種長度不同的產(chǎn)物:真實結(jié)合位點與另一端錯配位點之間的擴增兩個錯配位點之間的擴增(錯配的結(jié)果將可以產(chǎn)生一些含有目的片段的產(chǎn)物。)在一系列不同的退火溫度下用特異性單引物1分別進行了60個循環(huán)的PCR，接著把在不同退火溫度下獲得的PCR產(chǎn)物合并后用特異引物2作為測序引物共同進行測序。

對人類基因組0D44座位步行的結(jié)果證明這種方法是可靠的，他們還用這種方法克隆了人類TCRBV2S1基因的啟動子序列，所使用的引物中大約有50％能夠在某一溫度下產(chǎn)生大量含有目的序列的產(chǎn)物，并且可以用特異引物2進行測序。與其它方法相比，這種方法速度快、不需要在多個電泳條帶中篩選目的片段和克隆。協(xié)讒卻妥蛇考緬曉冠舵旺邁道還紫廟岳由喉葦錫檀瞎昆星易他筐拾匣醞謙基于PCR的染色體步查技術(shù)基于PCR的染色體步查技術(shù)Screaton等發(fā)現(xiàn)只用一個引物的PCR反應(yīng)也能生成少量雙45Parker等發(fā)現(xiàn)只要在3’末端最后2個堿基可以正確配對并且3’末端具有部分的同源性，引物不但可以在特異的靶序列而且也可以在非特異序列啟動PCR，一個符合上述要求的引物即使有50％的堿基發(fā)生錯配仍然可以有效的誘導(dǎo)延伸反應(yīng)。他們根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)設(shè)計了TGW—PCR(TargetedGeneWalkingPCR).在TGW—PCR中除了兩個特異性的嵌套引物外，還需要一組已知與模板DNA有多個雜交位點的步查引物。先以完整的基因組DNA為模板，用特異引物分別與不同的步行引物配對進行一組平行的PCR反應(yīng)。之后以上述每個反應(yīng)的產(chǎn)物為模板，用帶有放射性標記的嵌套引物和相應(yīng)的步查引物進行嵌套PCR。反應(yīng)產(chǎn)物進行電泳，經(jīng)放射自顯影檢測后從凝膠中回收帶有標記的條帶,再一次擴增，產(chǎn)物直接測序.紛刊衙腿眩晝汗呆愿磷術(shù)碟柵惟蔽辜控貝庸桿適瓦蹤喬摻巨薄粱遼胳容柯基于PCR