疏水層析的概念疏水層析的原理疏水層析過程影響疏水層析的因素疏水層析的應(yīng)用疏水層析的發(fā)展趨勢(shì)內(nèi)容簡(jiǎn)介第1頁(yè)/共31頁(yè)疏水層析的概念內(nèi)容簡(jiǎn)介第1頁(yè)/共31頁(yè)1疏水層析的概念疏水層析亦稱疏水作用層析從分離純化生命物質(zhì)的機(jī)制來(lái)看，它也屬于吸附層析一類。疏水層析（HIC）是利用蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域與固定相上疏水性基團(tuán)相互作用力的差異，對(duì)蛋白質(zhì)組分進(jìn)行分離的層析方法。該方法基于的是蛋白質(zhì)的疏水差異，在高鹽溶液中，蛋白質(zhì)會(huì)與疏水配基相結(jié)合（鹽濃度降低時(shí)蛋白質(zhì)疏水作用減弱），而其他的雜蛋白則沒有此種性質(zhì)，利用此種性質(zhì)，可以將蛋白質(zhì)初步的分離，用于鹽析之后的蛋白質(zhì)進(jìn)一步提純。

第2頁(yè)/共31頁(yè)疏水層析的概念疏水層析亦稱疏水作用層析從分離純化生命物質(zhì)的機(jī)疏水層析原理：特點(diǎn)：利用樣品與介質(zhì)疏水性大小進(jìn)行分離，樣品不必脫鹽。利用被分離組分分子表面的疏水微區(qū)、（可逆）變性后暴露出的疏水殘基，或在高鹽環(huán)境下暴露于分子表面的疏水殘基與固定相的疏水性配體之間的作用強(qiáng)弱，依次用從高至低離子強(qiáng)度洗脫液可將疏水作用由弱到強(qiáng)的組分分離開。*洗脫：鹽濃度高，疏水弱的Pr先流出；

鹽濃度低，疏水強(qiáng)的Pr后流出。第3頁(yè)/共31頁(yè)疏水層析原理：第3頁(yè)/共31頁(yè)三、疏水層析過程

凝膠處理

裝柱加樣平衡洗滌洗脫再回收第4頁(yè)/共31頁(yè)三、疏水層析過程凝膠處理裝柱加樣平衡洗滌洗脫再回收第4

一、層析柱的制備1．層析柱規(guī)格所使用層析柱之規(guī)格與普通層析的相似2．固定相在進(jìn)行常壓疏水層析時(shí)，大多數(shù)是選用苯基(或辛基)-SepharoseCl-4B吸附劑作固定相。苯基-SepharoseCl-4B適合于分離純化與芳香族化合物具有親和力的物質(zhì)。辛基-SepharoseCl-4B則適用于分離純化親脂性較強(qiáng)的物質(zhì)。第5頁(yè)/共31頁(yè)一、層析柱的制備第5頁(yè)/共31頁(yè)5

3．裝柱將選定的親水性吸附劑如苯基-SepharoseC1-4B懸浮于乙醇溶液中，浸泡一段時(shí)間；采用離心(或過濾)方法，棄上清液，收集沉淀物；并以50％(m／V)濃度懸浮于樣品緩沖液中；爾后，按常規(guī)方法裝入層析柱，經(jīng)洗滌、平衡完畢，即可加樣。

第6頁(yè)/共31頁(yè)3．裝柱第6頁(yè)/共31頁(yè)6二、加樣與洗脫

加樣前，在樣品溶液中要補(bǔ)加適量的鹽類。

(如上所述，加1mol／L(NH2)2SO4或2mol／LNaCl，以使樣品中的有效成分變性，并能與固定相很好地相互吸附。)把此樣品溶液徐徐加入固定相(使有效成分與固定相之間作用0.5-1h)后，先用平衡緩沖液洗滌，再用降低鹽濃度的平衡緩沖溶液洗脫，與此同時(shí)，要用部分收集器分段收集洗脫下來(lái)的溶液，并對(duì)收集的每部分溶液進(jìn)行檢測(cè)。固定相進(jìn)行再生處理后可重復(fù)使用。第7頁(yè)/共31頁(yè)二、加樣與洗脫第7頁(yè)/共31頁(yè)7疏水作用層析過程的參數(shù)

固定相類型：包括基質(zhì)的類型、配基的種類和取代程度流動(dòng)相組成：鹽的種類和濃度、流動(dòng)相的pH、以及其他添加劑的影響層析條件：溫度、流速等第8頁(yè)/共31頁(yè)疏水作用層析過程的參數(shù)固定相類型：包括基質(zhì)的類型、配基的種8疏水層析的影響因素：1、鹽類和鹽組成鹽的摩爾表面張力增大，蛋白質(zhì)在疏水層析柱內(nèi)的吸附能力相應(yīng)增大。各種鹽離子和離子對(duì)具有破壞周圍水分子有序排列的能力。流動(dòng)相中鹽的組成對(duì)蛋白質(zhì)在疏水層析介質(zhì)上的吸附能力具有最為重大的影響。選擇合適的鹽對(duì)保證蛋白質(zhì)的分離以及分離后蛋白質(zhì)的活性都很重要。硫酸銨、醋酸銨、氯化鈉和磷酸鹽是疏水層析分離常用的幾種鹽。第9頁(yè)/共31頁(yè)疏水層析的影響因素：第9頁(yè)/共31頁(yè)92、離子強(qiáng)度

離子強(qiáng)度的大小直接影響樣品組分在固定相的保留值。一般增加離子強(qiáng)度來(lái)增加組分的保留值，降低離子強(qiáng)度來(lái)提高組分的解析附能力。

HIC實(shí)驗(yàn)中，改變離子強(qiáng)度進(jìn)行洗脫的方式，一般宜采用梯度洗脫法，可提高分離的選擇性。3、溶液的酸堿度

溶液的pH值主要考慮能維持生物大分子生物活性的pH環(huán)境。一般情況，溶液的pH接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，其疏水性增加，有利于與固定相配基相互作用；遠(yuǎn)離其等電點(diǎn)，其疏水性減少，不利于與固定相配基結(jié)合，但有利于蛋白質(zhì)洗脫。因此通過改變?nèi)芤旱膒H也可以改變蛋白質(zhì)的疏水性。4、柱溫

一般柱溫升高，生物大分子的構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化，疏水作用增加，吸附能力增加，有利于提高層析柱的分離度，所以有時(shí)可以通過提高柱溫來(lái)增加疏水基團(tuán)與配基間的相互作用，分離性質(zhì)相近的化合物，如對(duì)分離一些小分子是非常有效的。但是對(duì)于具有生物活性的物質(zhì)或酶類，在高溫條件下易變性失活，因此不宜在高溫條件下進(jìn)行分離。一般都在常溫或低溫下操作。第10頁(yè)/共31頁(yè)2、離子強(qiáng)度第10頁(yè)/共31頁(yè)10排在最左邊的離子，鹽析作用（蛋白質(zhì)溶解度低）最強(qiáng)，洗脫能力最弱；即疏水作用強(qiáng)排在最右邊的離子，洗脫能力最強(qiáng)，鹽析作用最弱。第11頁(yè)/共31頁(yè)排在最左邊的離子，鹽析作用（蛋白質(zhì)溶解度低）最強(qiáng)，洗脫能力最11技術(shù)

介質(zhì)的選擇樣品的準(zhǔn)備層析條件的優(yōu)化層析介質(zhì)的再生、清洗和貯存

第12頁(yè)/共31頁(yè)技術(shù)介質(zhì)的選擇第12頁(yè)/共31頁(yè)12介質(zhì)（基質(zhì)+配基）基質(zhì)主要有多糖類如瓊脂糖、纖維素和人工合成聚合物類如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯類。其中，半剛性的瓊脂糖類凝膠仍是應(yīng)用最廣泛的疏水介質(zhì)；

近年來(lái)研制超大瓊脂糖(superporous)，在擴(kuò)散孔的基礎(chǔ)上增加了對(duì)流孔，在流速較高的條件下獲較好的分辨率；殼聚糖具有良好的生物相容性和化學(xué)穩(wěn)定性，近年來(lái)在疏水層析中也得到了應(yīng)用。

第13頁(yè)/共31頁(yè)介質(zhì)（基質(zhì)+配基）基質(zhì)主要有多糖類如瓊脂糖、纖維素和人工合成13

HIC介質(zhì)的疏水配基主要為烷基和芳香基，與反相層析介質(zhì)相比，其烷基通常在C8以下，芳香基多為苯基。

R代表疏水配基，M代表基質(zhì)。調(diào)節(jié)兩種反應(yīng)物的比例可控制介質(zhì)的配基密度。

第14頁(yè)/共31頁(yè)HIC介質(zhì)的疏水配基主要為烷基和芳香基，與反相層析介14偶聯(lián)至基質(zhì)的常見配基類型（A）丁基，（B）辛基，（C）苯基，（D）新戊基

第15頁(yè)/共31頁(yè)偶聯(lián)至基質(zhì)的常見配基類型第15頁(yè)/共31頁(yè)15對(duì)某些蛋白而言，上述有些配基與其結(jié)合力太強(qiáng)，為洗脫有時(shí)需用有機(jī)溶劑，有變性風(fēng)險(xiǎn)；具中等疏水的高分子配基(如聚乙二醇和聚丙二醇等)不僅可提供足夠的結(jié)合力，且避免了上述缺點(diǎn)。第16頁(yè)/共31頁(yè)對(duì)某些蛋白而言，上述有些配基與其結(jié)合力太強(qiáng)，為洗脫有時(shí)需用有16介質(zhì)的選擇：在HIC中，應(yīng)選機(jī)械強(qiáng)度較大的剛性基質(zhì)；若待分離物質(zhì)分子量很大，且樣品量較大，則應(yīng)選大孔基質(zhì)，如瓊脂糖凝膠；若待分離物質(zhì)較小，或樣品量很小，但分辨率的要求高，則可選孔徑小的基質(zhì)甚至非孔型基質(zhì)。HIC介質(zhì)中，烷基配基的鏈長(zhǎng)大多在C4～C8之間，苯基的疏水性大致與戊基相當(dāng)，因與溶質(zhì)發(fā)生π-π相互作用，它與戊基有不同的選擇性，而寡聚乙二醇固定相的疏水性介于丁基與苯基之間。第17頁(yè)/共31頁(yè)介質(zhì)的選擇：在HIC中，應(yīng)選機(jī)械強(qiáng)度較大的剛性基質(zhì)；若待分離17樣品的準(zhǔn)備：往樣品中添加足夠濃度的鹽，使樣品溶液中的鹽濃度達(dá)到與流動(dòng)相A（平衡液）中基本一致，并調(diào)節(jié)樣品溶液的pH使其滿足吸附條件，同時(shí)選擇適當(dāng)濃度及pH的緩沖液。HIC的樣品體積受樣品中組分濃度和介質(zhì)的結(jié)合容量的影響，對(duì)于稀釋樣品無(wú)需濃縮可以直接加樣第18頁(yè)/共31頁(yè)樣品的準(zhǔn)備：往樣品中添加足夠濃度的鹽，使樣品溶液中的鹽濃度達(dá)18層析條件的優(yōu)化：優(yōu)化目標(biāo)：目標(biāo)分子達(dá)所需純度的基礎(chǔ)上，獲得盡可能高的回收率，同時(shí)力求縮短分離所需時(shí)間、降低分離成本。

HIC中，層析條件包括流動(dòng)相A，流動(dòng)相B，洗脫方式，層析柱的柱長(zhǎng)，流速，溫度等第19頁(yè)/共31頁(yè)層析條件的優(yōu)化：優(yōu)化目標(biāo)：第19頁(yè)/共31頁(yè)19流動(dòng)相A與流動(dòng)相B

流動(dòng)相A的緩沖液的種類、pH，鹽的種類和濃度的選擇：緩沖液種類據(jù)所需的pH選擇，注意目標(biāo)物的穩(wěn)定性，濃度一般在0.01--0.05mol/L；不同鹽類對(duì)疏水作用的強(qiáng)度有影響，層析中的選擇性也不盡相同；鹽濃度也隨目標(biāo)分子的疏水性而異，(NH4)2SO4常用0.75～2mol/L，NaCl為1～4mol/L；流動(dòng)相B為含鹽量較低的緩沖液，緩沖液類型與流動(dòng)相A一致。第20頁(yè)/共31頁(yè)流動(dòng)相A與流動(dòng)相B流動(dòng)相A的緩沖液的種類、pH，鹽的種類20洗脫的方式：

采用降低流動(dòng)相中鹽濃度的方式洗脫（最常用）；通過往流動(dòng)相中添加有機(jī)溶劑，如：乙二醇、丙醇、異丙醇等，降低流動(dòng)相極性的方式洗脫（溶劑中穩(wěn)定性良好的物質(zhì)）往流動(dòng)相中添加去污劑等，去污劑本身能與介質(zhì)發(fā)生強(qiáng)烈吸附，從而將結(jié)合在其上的目標(biāo)組分置換下來(lái)（分離膜蛋白）第21頁(yè)/共31頁(yè)洗脫的方式：第21頁(yè)/共31頁(yè)21層析介質(zhì)的再生、貯存：再生：常規(guī)用蒸餾水清洗，如有疏水性很強(qiáng)的物質(zhì)如脂類、變性蛋白等牢固結(jié)合在介質(zhì)上，則需合適的清洗劑進(jìn)行清洗，NaOH溶液是其中常用的一種清洗劑，它在清洗層析柱的同時(shí)還能使微生物鈍化滅活起到消毒的效果。此外，促溶鹽類的水溶液也是良好的清洗劑。貯存：一般懸浮在20%的乙醇中，如在水溶液體系中保存，則需添加一定量的防腐劑，以防止微生物的生長(zhǎng)。

第22頁(yè)/共31頁(yè)層析介質(zhì)的再生、貯存：再生：常規(guī)用蒸餾水清洗，如有疏水性很22應(yīng)用蛋白類（包括酶）、肽類的分離純化（廣泛）重組蛋白的分離與復(fù)性活性蛋白與非活性蛋白的區(qū)分第23頁(yè)/共31頁(yè)應(yīng)用蛋白類（包括酶）、肽類的分離純化（廣泛）第23頁(yè)/共3123

近年來(lái)，隨著層析技術(shù)的發(fā)展，與HIC相關(guān)的其它層析技術(shù)也得到了發(fā)展，主要有以下兩種：

1）親硫性疏水層析(thio—philicchromatography)2）疏水電荷誘導(dǎo)層析(HCIC)五、發(fā)展趨勢(shì)第24頁(yè)/共31頁(yè)五、發(fā)展趨勢(shì)第24頁(yè)/共31頁(yè)24親硫性疏水層析該技術(shù)主要在疏水作用的基礎(chǔ)上增加了硫元素的相互作用。利用層析介質(zhì)與含硫蛋白質(zhì)和非硫蛋白質(zhì)的親硫性差異，對(duì)蛋白質(zhì)加以分離。具體應(yīng)用條件和HIC類似。通常這類介質(zhì)通過硫醚鍵將配基和基質(zhì)聯(lián)接，如Butyl—S-Sepharose6FastFlow，已用于乙肝病毒表面抗原的分離純化。第25頁(yè)/共31頁(yè)親硫性疏水層析該技術(shù)主要在疏水作用的基礎(chǔ)上增加了硫元素的相互25疏水電荷誘導(dǎo)層析(HCIC)

HCIC是近幾年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一類不同于HIC的新技術(shù)，由Burton等1998年提出；HCIC與蛋白質(zhì)的作用除了疏水作用，還有電荷間的相互作用；HCIC與蛋白質(zhì)的結(jié)合是由疏水作用推動(dòng)的，與HIC不同的是，這一過程通常是在不改變離子強(qiáng)度的條件下實(shí)現(xiàn)的；洗脫時(shí)也不像HIC那樣通過改變鹽的濃度而是由pH值的改變來(lái)實(shí)現(xiàn)的。第26頁(yè)/共31頁(yè)疏水電荷誘導(dǎo)層析(HCIC)HCIC是近幾年來(lái)發(fā)展起來(lái)的26通常HCIC的配基中含有吡啶環(huán)，中性時(shí)不會(huì)帶有電荷，而隨著pH值的降低，吡啶環(huán)中的氮原子會(huì)帶有正電荷，這樣和帶同樣電荷的蛋白質(zhì)發(fā)生排斥，從而實(shí)現(xiàn)解吸（機(jī)理如圖）；另外，為了能在低鹽濃度甚至無(wú)鹽時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行吸附，其配基密度比HIC要高；同時(shí)為了增加其選擇性，配基結(jié)構(gòu)中還常常含有硫。第27頁(yè)/共31頁(yè)第27頁(yè)/共31頁(yè)27

HCIC主要用于抗體的分離純化，具有價(jià)格低、效率高、化學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng)(可用lmol／LNaOH清洗)、適用范圍廣(可用于IgG，IgA，IgE，IgM和抗體片段的分離)的特點(diǎn)，目前，已有商品化的介質(zhì)，如Ciphergen公司生產(chǎn)的MEPHyperCell；由于HCIC比HIC、IEC擁有更溫和的吸附和洗脫條件，在蛋白質(zhì)類的分離上應(yīng)用前景廣闊。

第28頁(yè)/共31頁(yè)HCIC主要用于抗體的分離純化，具有價(jià)格低、效率高28總結(jié)離子交換層析之后是最后一步純化，疏水作用層析(hydrophobicInteractionChromatography,HIC)。蛋白質(zhì)表面有一些疏水區(qū)域，如果在蛋白質(zhì)樣品溶液里面加足夠的鹽，就會(huì)與這些疏水區(qū)域爭(zhēng)奪水分子。沒有了足夠的分子，這些疏水區(qū)域傾向于與其他疏水區(qū)域結(jié)合。HIC的吸附劑上衍生有非極性基團(tuán)，可以與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域結(jié)合，這樣蛋白質(zhì)就能綁到柱子上。要想把蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)，則要用低鹽緩沖液沖洗，鹽濃度下降之后蛋白質(zhì)與柱子的疏水相互作用也被削弱，所以能被沖洗下來(lái)。由于HIC要求樣品的起始鹽濃度很高，所以特別適于作為硫酸銨沉淀或者離子交換層析后續(xù)步驟。因?yàn)榱蛩徜@沉淀（無(wú)論是上清還是沉淀）和離子交換層析的產(chǎn)物，鹽濃度都非常高，如果直接再跑HIC，不但省了透析脫鹽的一步，還進(jìn)一步純化了蛋白?，F(xiàn)在常用的HIC樹脂上的疏水基團(tuán)有兩種，一種是苯基另一種是辛基。比較而言，辛基group更加疏水一些。我們這一次的實(shí)驗(yàn)中用的是苯基sepharose。值得強(qiáng)調(diào)的是，對(duì)于HIC而言，樹脂的衍生基團(tuán)并不是越疏水就越好的。因?yàn)槿绻杷脑?，與蛋白質(zhì)的結(jié)合會(huì)十分緊密，以至于要加入有機(jī)溶劑，才能沖洗下來(lái)。但是有機(jī)溶劑同時(shí)又有可能使蛋白變性。第29頁(yè)/共31頁(yè)總結(jié)離子交換層析之后是最后一步純化，疏水作用層析(hydro29謝謝！第30頁(yè)/共31頁(yè)謝謝！第30頁(yè)/共31頁(yè)30感謝您的觀看！第31頁(yè)/共31頁(yè)感謝您的觀看！第31頁(yè)/共31頁(yè)31疏水層析的概念疏水層析的原理疏水層析過程影響疏水層析的因素疏水層析的應(yīng)用疏水層析的發(fā)展趨勢(shì)內(nèi)容簡(jiǎn)介第1頁(yè)/共31頁(yè)疏水層析的概念內(nèi)容簡(jiǎn)介第1頁(yè)/共31頁(yè)32疏水層析的概念疏水層析亦稱疏水作用層析從分離純化生命物質(zhì)的機(jī)制來(lái)看，它也屬于吸附層析一類。疏水層析（HIC）是利用蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域與固定相上疏水性基團(tuán)相互作用力的差異，對(duì)蛋白質(zhì)組分進(jìn)行分離的層析方法。該方法基于的是蛋白質(zhì)的疏水差異，在高鹽溶液中，蛋白質(zhì)會(huì)與疏水配基相結(jié)合（鹽濃度降低時(shí)蛋白質(zhì)疏水作用減弱），而其他的雜蛋白則沒有此種性質(zhì)，利用此種性質(zhì)，可以將蛋白質(zhì)初步的分離，用于鹽析之后的蛋白質(zhì)進(jìn)一步提純。

第2頁(yè)/共31頁(yè)疏水層析的概念疏水層析亦稱疏水作用層析從分離純化生命物質(zhì)的機(jī)疏水層析原理：特點(diǎn)：利用樣品與介質(zhì)疏水性大小進(jìn)行分離，樣品不必脫鹽。利用被分離組分分子表面的疏水微區(qū)、（可逆）變性后暴露出的疏水殘基，或在高鹽環(huán)境下暴露于分子表面的疏水殘基與固定相的疏水性配體之間的作用強(qiáng)弱，依次用從高至低離子強(qiáng)度洗脫液可將疏水作用由弱到強(qiáng)的組分分離開。*洗脫：鹽濃度高，疏水弱的Pr先流出；

鹽濃度低，疏水強(qiáng)的Pr后流出。第3頁(yè)/共31頁(yè)疏水層析原理：第3頁(yè)/共31頁(yè)三、疏水層析過程

凝膠處理

裝柱加樣平衡洗滌洗脫再回收第4頁(yè)/共31頁(yè)三、疏水層析過程凝膠處理裝柱加樣平衡洗滌洗脫再回收第35

一、層析柱的制備1．層析柱規(guī)格所使用層析柱之規(guī)格與普通層析的相似2．固定相在進(jìn)行常壓疏水層析時(shí)，大多數(shù)是選用苯基(或辛基)-SepharoseCl-4B吸附劑作固定相。苯基-SepharoseCl-4B適合于分離純化與芳香族化合物具有親和力的物質(zhì)。辛基-SepharoseCl-4B則適用于分離純化親脂性較強(qiáng)的物質(zhì)。第5頁(yè)/共31頁(yè)一、層析柱的制備第5頁(yè)/共31頁(yè)36

3．裝柱將選定的親水性吸附劑如苯基-SepharoseC1-4B懸浮于乙醇溶液中，浸泡一段時(shí)間；采用離心(或過濾)方法，棄上清液，收集沉淀物；并以50％(m／V)濃度懸浮于樣品緩沖液中；爾后，按常規(guī)方法裝入層析柱，經(jīng)洗滌、平衡完畢，即可加樣。

第6頁(yè)/共31頁(yè)3．裝柱第6頁(yè)/共31頁(yè)37二、加樣與洗脫

加樣前，在樣品溶液中要補(bǔ)加適量的鹽類。

(如上所述，加1mol／L(NH2)2SO4或2mol／LNaCl，以使樣品中的有效成分變性，并能與固定相很好地相互吸附。)把此樣品溶液徐徐加入固定相(使有效成分與固定相之間作用0.5-1h)后，先用平衡緩沖液洗滌，再用降低鹽濃度的平衡緩沖溶液洗脫，與此同時(shí)，要用部分收集器分段收集洗脫下來(lái)的溶液，并對(duì)收集的每部分溶液進(jìn)行檢測(cè)。固定相進(jìn)行再生處理后可重復(fù)使用。第7頁(yè)/共31頁(yè)二、加樣與洗脫第7頁(yè)/共31頁(yè)38疏水作用層析過程的參數(shù)

固定相類型：包括基質(zhì)的類型、配基的種類和取代程度流動(dòng)相組成：鹽的種類和濃度、流動(dòng)相的pH、以及其他添加劑的影響層析條件：溫度、流速等第8頁(yè)/共31頁(yè)疏水作用層析過程的參數(shù)固定相類型：包括基質(zhì)的類型、配基的種39疏水層析的影響因素：1、鹽類和鹽組成鹽的摩爾表面張力增大，蛋白質(zhì)在疏水層析柱內(nèi)的吸附能力相應(yīng)增大。各種鹽離子和離子對(duì)具有破壞周圍水分子有序排列的能力。流動(dòng)相中鹽的組成對(duì)蛋白質(zhì)在疏水層析介質(zhì)上的吸附能力具有最為重大的影響。選擇合適的鹽對(duì)保證蛋白質(zhì)的分離以及分離后蛋白質(zhì)的活性都很重要。硫酸銨、醋酸銨、氯化鈉和磷酸鹽是疏水層析分離常用的幾種鹽。第9頁(yè)/共31頁(yè)疏水層析的影響因素：第9頁(yè)/共31頁(yè)402、離子強(qiáng)度

離子強(qiáng)度的大小直接影響樣品組分在固定相的保留值。一般增加離子強(qiáng)度來(lái)增加組分的保留值，降低離子強(qiáng)度來(lái)提高組分的解析附能力。

HIC實(shí)驗(yàn)中，改變離子強(qiáng)度進(jìn)行洗脫的方式，一般宜采用梯度洗脫法，可提高分離的選擇性。3、溶液的酸堿度

溶液的pH值主要考慮能維持生物大分子生物活性的pH環(huán)境。一般情況，溶液的pH接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，其疏水性增加，有利于與固定相配基相互作用；遠(yuǎn)離其等電點(diǎn)，其疏水性減少，不利于與固定相配基結(jié)合，但有利于蛋白質(zhì)洗脫。因此通過改變?nèi)芤旱膒H也可以改變蛋白質(zhì)的疏水性。4、柱溫

一般柱溫升高，生物大分子的構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化，疏水作用增加，吸附能力增加，有利于提高層析柱的分離度，所以有時(shí)可以通過提高柱溫來(lái)增加疏水基團(tuán)與配基間的相互作用，分離性質(zhì)相近的化合物，如對(duì)分離一些小分子是非常有效的。但是對(duì)于具有生物活性的物質(zhì)或酶類，在高溫條件下易變性失活，因此不宜在高溫條件下進(jìn)行分離。一般都在常溫或低溫下操作。第10頁(yè)/共31頁(yè)2、離子強(qiáng)度第10頁(yè)/共31頁(yè)41排在最左邊的離子，鹽析作用（蛋白質(zhì)溶解度低）最強(qiáng)，洗脫能力最弱；即疏水作用強(qiáng)排在最右邊的離子，洗脫能力最強(qiáng)，鹽析作用最弱。第11頁(yè)/共31頁(yè)排在最左邊的離子，鹽析作用（蛋白質(zhì)溶解度低）最強(qiáng)，洗脫能力最42技術(shù)

介質(zhì)的選擇樣品的準(zhǔn)備層析條件的優(yōu)化層析介質(zhì)的再生、清洗和貯存

第12頁(yè)/共31頁(yè)技術(shù)介質(zhì)的選擇第12頁(yè)/共31頁(yè)43介質(zhì)（基質(zhì)+配基）基質(zhì)主要有多糖類如瓊脂糖、纖維素和人工合成聚合物類如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯類。其中，半剛性的瓊脂糖類凝膠仍是應(yīng)用最廣泛的疏水介質(zhì)；

近年來(lái)研制超大瓊脂糖(superporous)，在擴(kuò)散孔的基礎(chǔ)上增加了對(duì)流孔，在流速較高的條件下獲較好的分辨率；殼聚糖具有良好的生物相容性和化學(xué)穩(wěn)定性，近年來(lái)在疏水層析中也得到了應(yīng)用。

第13頁(yè)/共31頁(yè)介質(zhì)（基質(zhì)+配基）基質(zhì)主要有多糖類如瓊脂糖、纖維素和人工合成44

HIC介質(zhì)的疏水配基主要為烷基和芳香基，與反相層析介質(zhì)相比，其烷基通常在C8以下，芳香基多為苯基。

R代表疏水配基，M代表基質(zhì)。調(diào)節(jié)兩種反應(yīng)物的比例可控制介質(zhì)的配基密度。

第14頁(yè)/共31頁(yè)HIC介質(zhì)的疏水配基主要為烷基和芳香基，與反相層析介45偶聯(lián)至基質(zhì)的常見配基類型（A）丁基，（B）辛基，（C）苯基，（D）新戊基

第15頁(yè)/共31頁(yè)偶聯(lián)至基質(zhì)的常見配基類型第15頁(yè)/共31頁(yè)46對(duì)某些蛋白而言，上述有些配基與其結(jié)合力太強(qiáng)，為洗脫有時(shí)需用有機(jī)溶劑，有變性風(fēng)險(xiǎn)；具中等疏水的高分子配基(如聚乙二醇和聚丙二醇等)不僅可提供足夠的結(jié)合力，且避免了上述缺點(diǎn)。第16頁(yè)/共31頁(yè)對(duì)某些蛋白而言，上述有些配基與其結(jié)合力太強(qiáng)，為洗脫有時(shí)需用有47介質(zhì)的選擇：在HIC中，應(yīng)選機(jī)械強(qiáng)度較大的剛性基質(zhì)；若待分離物質(zhì)分子量很大，且樣品量較大，則應(yīng)選大孔基質(zhì)，如瓊脂糖凝膠；若待分離物質(zhì)較小，或樣品量很小，但分辨率的要求高，則可選孔徑小的基質(zhì)甚至非孔型基質(zhì)。HIC介質(zhì)中，烷基配基的鏈長(zhǎng)大多在C4～C8之間，苯基的疏水性大致與戊基相當(dāng)，因與溶質(zhì)發(fā)生π-π相互作用，它與戊基有不同的選擇性，而寡聚乙二醇固定相的疏水性介于丁基與苯基之間。第17頁(yè)/共31頁(yè)介質(zhì)的選擇：在HIC中，應(yīng)選機(jī)械強(qiáng)度較大的剛性基質(zhì)；若待分離48樣品的準(zhǔn)備：往樣品中添加足夠濃度的鹽，使樣品溶液中的鹽濃度達(dá)到與流動(dòng)相A（平衡液）中基本一致，并調(diào)節(jié)樣品溶液的pH使其滿足吸附條件，同時(shí)選擇適當(dāng)濃度及pH的緩沖液。HIC的樣品體積受樣品中組分濃度和介質(zhì)的結(jié)合容量的影響，對(duì)于稀釋樣品無(wú)需濃縮可以直接加樣第18頁(yè)/共31頁(yè)樣品的準(zhǔn)備：往樣品中添加足夠濃度的鹽，使樣品溶液中的鹽濃度達(dá)49層析條件的優(yōu)化：優(yōu)化目標(biāo)：目標(biāo)分子達(dá)所需純度的基礎(chǔ)上，獲得盡可能高的回收率，同時(shí)力求縮短分離所需時(shí)間、降低分離成本。

HIC中，層析條件包括流動(dòng)相A，流動(dòng)相B，洗脫方式，層析柱的柱長(zhǎng)，流速，溫度等第19頁(yè)/共31頁(yè)層析條件的優(yōu)化：優(yōu)化目標(biāo)：第19頁(yè)/共31頁(yè)50流動(dòng)相A與流動(dòng)相B

流動(dòng)相A的緩沖液的種類、pH，鹽的種類和濃度的選擇：緩沖液種類據(jù)所需的pH選擇，注意目標(biāo)物的穩(wěn)定性，濃度一般在0.01--0.05mol/L；不同鹽類對(duì)疏水作用的強(qiáng)度有影響，層析中的選擇性也不盡相同；鹽濃度也隨目標(biāo)分子的疏水性而異，(NH4)2SO4常用0.75～2mol/L，NaCl為1～4mol/L；流動(dòng)相B為含鹽量較低的緩沖液，緩沖液類型與流動(dòng)相A一致。第20頁(yè)/共31頁(yè)流動(dòng)相A與流動(dòng)相B流動(dòng)相A的緩沖液的種類、pH，鹽的種類51洗脫的方式：

采用降低流動(dòng)相中鹽濃度的方式洗脫（最常用）；通過往流動(dòng)相中添加有機(jī)溶劑，如：乙二醇、丙醇、異丙醇等，降低流動(dòng)相極性的方式洗脫（溶劑中穩(wěn)定性良好的物質(zhì)）往流動(dòng)相中添加去污劑等，去污劑本身能與介質(zhì)發(fā)生強(qiáng)烈吸附，從而將結(jié)合在其上的目標(biāo)組分置換下來(lái)（分離膜蛋白）第21頁(yè)/共31頁(yè)洗脫的方式：第21頁(yè)/共31頁(yè)52層析介質(zhì)的再生、貯存：再生：常規(guī)用蒸餾水清洗，如有疏水性很強(qiáng)的物質(zhì)如脂類、變性蛋白等牢固結(jié)合在介質(zhì)上，則需合適的清洗劑進(jìn)行清洗，NaOH溶液是其中常用的一種清洗劑，它在清洗層析柱的同時(shí)還能使微生物鈍化滅活起到消毒的效果。此外，促溶鹽類的水溶液也是良好的清洗劑。貯存：一般懸浮在20%的乙醇中，如在水溶液體系中保存，則需添加一定量的防腐劑，以防止微生物的生長(zhǎng)。

第22頁(yè)/共31頁(yè)層析介質(zhì)的再生、貯存：再生：常規(guī)用蒸餾水清洗，如有疏水性很53應(yīng)用蛋白類（包括酶）、肽類的分離純化（廣泛）重組蛋白的分離與復(fù)性活性蛋白與非活性蛋白的區(qū)分第23頁(yè)/共31頁(yè)應(yīng)用蛋白類（包括酶）、肽類的分離純化（廣泛）第23頁(yè)/共3154

近年來(lái)，隨著層析技術(shù)的發(fā)展，與HIC相關(guān)的其它層析技術(shù)也得到了發(fā)展，主要有以下兩種：

1）親硫性疏水層析(thio—philicchromatography)2）疏水電荷誘導(dǎo)層析(HCIC)五、發(fā)展趨勢(shì)第24頁(yè)/共31頁(yè)五、發(fā)展趨勢(shì)第24頁(yè)/共31頁(yè)55親硫性疏水層析該技術(shù)主要在疏水作用的基礎(chǔ)上增加了硫元素的相互作用。利用層析介質(zhì)與含硫蛋白質(zhì)和非硫蛋白質(zhì)的親硫性差異，對(duì)蛋白質(zhì)加以分離。具體應(yīng)用條件和HIC類似。通常這類介質(zhì)通過硫醚鍵將配基和基質(zhì)聯(lián)接，如Butyl—S-Sepharose6FastFlow，已用于乙肝病毒表面抗原的分離純化。第25頁(yè)/共31頁(yè)親硫性疏水層析該技術(shù)主要在疏水作用的基礎(chǔ)上增加了硫元素的相互56疏水電荷誘導(dǎo)層析(HCIC)

HCIC是近幾年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一類不同于HIC的新技術(shù)，由Burton等1998年提出；HCIC與蛋白質(zhì)的作用除了疏水作用，還有電荷間的相互作用；HCIC與蛋白質(zhì)的結(jié)合是由疏水作用推動(dòng)的，與HIC不同的是，這一