人紅細胞生成素(EPO)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒使用說明書本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于測定大血清，血漿及相關(guān)液體樣本中紅細胞生成素(EPO)的含量。實驗原理：本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人紅細胞生成素(EPO)水平。用純化的紅細胞生成素(EPO)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入紅細胞生成素(EPO)，再與HRP標記的紅細胞生成素(EPO)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的紅細胞生成素(EPO)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標準曲線計算樣品中人紅細胞生成素(EPO)濃度。試劑盒組成:試劑盒組成48孔配置96孔配置保存說明書1份1份封板膜2片(48)2片(96)密封袋1個1個酶標包被板1X481X962-8℃保存標準品：54IU/L0.5mlX1瓶0.5mlX1瓶2-8℃保存標準品稀釋液1.5mlX1瓶1.5mlX1瓶2-8℃保存酶標試劑3mlX1瓶6mlX1瓶2-8℃保存樣品稀釋液3mlX1瓶6mlX1瓶2-8℃保存顯色劑A液3mlX1瓶6mlX1瓶2-8℃保存顯色劑B液3mlX1瓶6mlX1瓶2-8℃保存終止液3mlX1瓶6mlX1瓶2-8℃保存濃縮洗滌液(20mlX20倍)*1瓶(20mlX30倍)X1瓶2-8℃保存樣本處理及要求：.血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。.血漿：應根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。.尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。.細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。.組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。.標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融..不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。操作步驟.標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標準品100此然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液50此混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100m分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50詛，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50詛棄掉，再各取50m分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50m分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50m，混勻后從第七、第八孔中分別取50詛加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50m，混勻后從第九第十孔中各取50m棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50m，濃度分別為36IU/L，24IU/L，12IU/L，6IU/L，3IU/L）。.加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40吐然后再加待測樣品10m（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。.配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用。.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。.加酶：每孔加入酶標試劑50m，空白孔除外。.溫育：操作同3。.洗滌：操作同5。.顯色：每孔先加入顯色劑A50|il，再加入顯色劑B50|il，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘..終止：每孔加終止液50巾終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。.測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。注意事項：.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。.濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。.各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。.請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標準品孔第一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)（XnX5）。

.封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。.底物請避光保存。.嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。.本試劑不同批號組分不得混用。.如與英文說明書有異，以英文說明書為準。計算：以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。試劑盒性能：.樣品線性回歸與預期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.92以上。.批內(nèi)與批見應分別小于9%和15%檢測范圍：2IU/L-40IU/L保存條件及有效期：.試劑盒保存:；2-8℃。.有效期：6個月FORRESEARCHUSEONLYHumanErythropoietinDrugNamesGenericName：HumaErythropoietin(EPO)ELISAKit.PurposeThiskitallowsforthedeterminationofEPOconcentrationsinHumanserum,bloodplasma,andotherbiologicalfluids.PrincipleoftheassayThekitassayHumanEPOlevelinthesample,usePurifiedHumanEPOantibodytocoatmicrotiterplatewells,makesolid-phaseantibody,thenaddEPOtowells,CombinedEPOantibodywhichWithHRPlabeled,becomeantibody-antigen-enzyme-antibodycomplex,afterwashingCompletely,AddTMBsubstratesolution,TMBsubstratebecomesbluecolorAtHRPenzyme-catalyzed,reactionisterminatedbytheadditionofasulphuricacidsolutionandthecolorchangeismeasuredspectrophotometricallyatawavelengthof450nm.TheconcentrationofEPOinthesamplesisthendeterminedbycomparingtheO.D.ofthesamplestothestandardcurve.MaterialsprovidedwiththekitMaterialsprovidedwiththekit48determinations96determinationsStorageUsermanual11Closureplatemembrane22Sealedbags11Microelisastripplate112-8℃Standard：54IU/L0.5mlx1bottle0.5mlx1bottle2-8℃Standarddiluent1.5mlx1bottle1.5mlx1bottle2-8℃HRP-Conjugatereagent3mM1bottle6mlx1bottle2-8℃Samplediluent3mM1bottle6mlx1bottle2-8℃ChromogenSolutionA3mM1bottle6mlx1bottle2-8℃ChromogenSolutionB3mM1bottle6mlx1bottle2-8℃StopSolution3mM1bottle6mlx1bottle2-8℃washsolution(20mlX20fold)xibottle(20mlX30fold)X1bottle2-8℃Specimenrequirementsserum-coagulationatroomtemperature10-20mins,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifugalagain.plasma-usesuitedEDTAorcitrateplasmaasananticoagulant,mix10-20mins,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifugalagain.Urine-collectsueasterilecontainer,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifugalagain.TheOperationofHydrothoraxandcerebrospinalfluidReferencetoit.cellculturesupernatant-detectsecretorycomponents,collectsueasterilecontainer,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,detectthecompositionofcells,DilutcellsuspensionwithPBS(PH7.2-7.4),Cellconcentrationreached1million/ml,repeatedfreeze-thawcycles,damagecellsandreleaseofintracellularcomponents,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifugalagain.TissuesampleAftercuttingsamples,checktheweight,addPBS(PH7.2-7.4),Rapidlyfrozenwithliquidnitrogen,maintainsamplesat2-8℃aftermelting,addPBS(PH7.4),HomogenizedbyhandorGrinders,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant.extractassoonaspossibleafterSpecimencollection,andaccordingtotherelevantliterature,andshouldbeexperimentassoonaspossibleaftertheextraction.Ifitcan't,specimencanbekeptin-20℃topreserve,Avoidrepeatedfreeze-thawcycles.Can'tdetectthesamplewhichcontainNaN3,becauseNaN3inhibitsHRPactive.Assayprocedure.DiluteandaddsampletoStandard:set10StandardwellsontheELISAplatescoated,addStandard100pltothefirstandthesecondwell,thenaddStandarddilution50pltothefirstandthesecondwell,mix;takeout100plformthefirstandthesecondwellthenaddittothethirdandtheforthwellseparately.thenaddStandarddilution50pltothethirdandtheforthwell,mix;thentakeout50plfromthethirdandtheforthwelldiscard,add50pltothefifthandthesixthwell,thenaddStandarddilution50pltothefifthandthesixthwell,mix;takeout50plfromthefifthandthesixthwellandaddtotheseventhandtheeighthwell,thenaddStandarddilution50pltotheseventhandtheeighthwell,mix;takeout50plfromtheseventhandtheeighthwellandaddtotheninthandthetenthwell,addStandarddilution50pltotheninthandthetenthwell,mix,takeout50plfromtheninthandthetenthwelldiscard(addSample50pltoeachwellafterDiluting,(density:36IU/L,24IU/L,12IU/L,6IU/L,3IU/L).addsample：Setblankwellsseparately(blankcomparisonwellsdon'taddsampleandHRP-Conjugatereagent,othereachstepoperationissame).testingsamplewell.addSampledilution40pltotestingsamplewell,thenaddtestingsample10pl(samplefinaldilutionis5-fold),addsampletowells,don'ttouchthewellwallasfaraspossible,andGentlymix..Incubate:AfterclosingplatewithClosureplatemembrane,incubatefor30minat37℃.4.Configurateliquid:30-fold(or20-fold)washsolutiondiluted30-fold(or20-fold)withdistilledwaterandreserve..washing：UncoverClosureplatemembrane,discardLiquid,drybyswing,addwashingbuffertoeverywell,stillfor30sthendrain,repeat5times,drybypat..addenzyme：AddHRP-Conjugatereagent50pltoeachwell,exceptblankwell.7.incubate：Operationwith3.8.washing：Operationwith5.9.color：AddChromogenSolutionA50ulandChromogenSolutionBtoeachwell,evadethelightpreservationfor15minat37℃10.Stopthereaction:AddStopSolution50pltoeachwell,Stopthereaction(thebluecolorchangetoyellowcolor).Il.assay：takeblankwellaszero,Readabsorbanceat450nmafterAddingStopSolutionandwithin15min.ImportantnotesThekittakesoutfromtherefrigerationenvironmentshouldbebalanced15-30minutesintheroomtemperature,ELISAplatescoatedifhasnotuseupafteropened,theplateshouldbestoredinSealedbag.washingbufferwillCrystallizationseparation,itcanbeheatedthewaterhelpsdissolvewhendilute.Washingdoesnotaffecttheresult.addSamplewithsamplerEachstep,Andproofreaditsaccuracyfrequently,avoidstheexperimentalerror.addsamplewithin5mins,ifthenumberofsampleismuch,recommendtouseVolley.ifthetestingmaterialcontentisexcessivelyhigher(ThesampleODisbiggerthanthefirststandardwell),pleasediluteSample(n-fold),Pleasediluenteandmultipliedbythedilutionfactor.(xnx5).Closureplatemembraneonlylimitsthedisposableuse,toavoidcross-contamination.Thesubstrateevadethel