方澤民：蛋白質(zhì)表達(dá)技術(shù)DNA重組表達(dá)：在合適表達(dá)元件（如轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、終止子、翻譯調(diào)控序列、轉(zhuǎn)錄酶、翻譯因子等）調(diào)控下，目的基因表達(dá)成目的蛋白質(zhì)的技術(shù)。外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)：大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)：1、全基因組測(cè)序，共有4405個(gè)開(kāi)放型閱讀框架2、基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善3、繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定4、被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢(shì)：1、缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能2、缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)3、內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白4、細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類(lèi)繁多的內(nèi)毒素大腸桿菌表達(dá)載體分類(lèi)：按蛋白質(zhì)類(lèi)型分：?jiǎn)渭儽磉_(dá):pJLA系列,用NcoI/NdeI導(dǎo)入AUG的載體融合表達(dá):融合各種tag,GST,CBD,MAL,GFP,etc分泌表達(dá):pel/ompT分泌肽按啟動(dòng)子分：lac及衍生的tac,trc,pac,rac等啟動(dòng)子IPTG誘導(dǎo)lamdaphagePL和PR啟動(dòng)子熱誘導(dǎo)T7啟動(dòng)子IPTG誘導(dǎo)T5啟動(dòng)子IPTG誘導(dǎo)ara啟動(dòng)子阿拉伯糖誘導(dǎo)選擇表達(dá)系統(tǒng)：蛋白質(zhì)的大?。盒〉陌|(zhì)蛋白和多肽最好能與運(yùn)載序列連接，以融合蛋白的形式在大腸桿菌中表達(dá)。運(yùn)載序列能起到穩(wěn)定靶蛋白的作用，使其免受胞內(nèi)蛋白酶的降解，并能提供用于親和純化的配基結(jié)合位點(diǎn)。用蛋白酶在融合蛋白的適當(dāng)位置進(jìn)行切割，可以回收有活性的靶蛋白。2.蛋白質(zhì)的需要量：如果需要少量的靶蛋白、酶的活性可以用粗提物來(lái)分析，一般不需要進(jìn)行優(yōu)化表達(dá)。3.蛋白質(zhì)是否需要保留活性：（1）若只用于生產(chǎn)抗體，包涵體有利于分離。（2）若靶蛋白用于生物化學(xué)或細(xì)胞生物學(xué)研究，就要考慮活性，其次考慮純化問(wèn)題。（3）若要用于結(jié)構(gòu)研究，最好能以可溶性狀態(tài)表達(dá)。外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)：外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的原理：轉(zhuǎn)錄：?jiǎn)?dòng)子、終止子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)翻譯：密碼子、質(zhì)?？截悢?shù)啟動(dòng)子：Lac表達(dá)系統(tǒng)以大腸桿菌lac操縱子調(diào)控機(jī)理為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)、構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理：具有多順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)，基因排列次序?yàn)椋簡(jiǎn)?dòng)子（lacP）-操縱基因（lacO）-結(jié)構(gòu)基因（lacZ-lacY-lacA）、正調(diào)節(jié)因子CAP、負(fù)調(diào)節(jié)因子lacI正調(diào)節(jié)因子CAP：cAMP激活CAP，CAP–cAMP復(fù)合物與lac操縱子上專一位點(diǎn)結(jié)合后，能促進(jìn)RNA聚合酶與–35、–10序列的結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄?；蚬こ讨惺褂玫膌ac啟動(dòng)子均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型，即PlacUV5lacUV5突變體：PlacUV5突變體能夠在沒(méi)有CAP存在的情形下非常有效的起始轉(zhuǎn)錄，受它控制的基因在轉(zhuǎn)錄水平上只受lacI的調(diào)控，因此用它構(gòu)建的表達(dá)載體在使用時(shí)比野生型Plac更易操作。負(fù)調(diào)節(jié)因子lacI：在無(wú)誘導(dǎo)物情形下，lacI基因產(chǎn)物形成四聚體阻遏蛋白，與啟動(dòng)子下游的操縱基因緊密結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)錄的起始。Trp表達(dá)系統(tǒng)：以大腸桿菌trp操縱子調(diào)控機(jī)理為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)、構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理：色氨酸啟動(dòng)子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白復(fù)合物的阻遏，轉(zhuǎn)錄呈基底狀態(tài)。在培養(yǎng)系統(tǒng)中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的細(xì)菌培養(yǎng)體系中，除去色氨酸是困難的，因此基因工程中往往添加IAA誘導(dǎo)Ptrp介導(dǎo)的目的基因表達(dá)Tac表達(dá)系統(tǒng)：tac啟動(dòng)子是由trp的–35序列和lacUV5的–10序列拼接而成的雜合啟動(dòng)子調(diào)控模式與lacUV5相似，但mRNA轉(zhuǎn)錄水平更高于trp和lacUV5啟動(dòng)子（Ptac=3Ptrp=11Plac），因此在要求有較高基因表達(dá)水平的情況下，選用tac啟動(dòng)子比用lacUV5啟動(dòng)子更優(yōu)越。lac、tac啟動(dòng)子對(duì)宿主菌的要求：在普通大腸桿菌中，LacI阻遏蛋白僅能滿足細(xì)胞染色體上lac操縱子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的需要。當(dāng)多拷貝的lacO隨著帶有l(wèi)acUV5、tac啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌后，LacI阻遏蛋白與lacO的比例顯著下降，無(wú)法保證每一個(gè)lacO都能獲得足夠的LacI阻遏蛋白參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。表現(xiàn)為在無(wú)誘導(dǎo)物存在的情形下，lacUV5、tac啟動(dòng)子有較高的本底轉(zhuǎn)錄。為了使以Lac、Tac表達(dá)系統(tǒng)具有嚴(yán)緊調(diào)控外源基因轉(zhuǎn)錄的能力，一種能產(chǎn)生過(guò)量的LacI阻遏蛋白的lacI基因的突變體lacIq被應(yīng)用于表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌JM109等菌株的基因型均為lacIq，常被選用為L(zhǎng)ac、Tac表達(dá)系統(tǒng)的宿主菌。但是這些菌株也只能對(duì)低拷貝的表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)嚴(yán)緊調(diào)控，在使用高拷貝復(fù)制子構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，仍能觀察到較高水平的本底轉(zhuǎn)錄。需在表達(dá)載體中插入lacIq基因以保證有較多的LacI阻遏蛋白產(chǎn)生。lac、tac表達(dá)系統(tǒng)存在的問(wèn)題：IPTG用于誘導(dǎo)lac、tac啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，但由于IPTG本身具有一定的毒性。從安全角度，對(duì)表達(dá)和制備用于醫(yī)療目的的重組蛋白并不適合。一些國(guó)家規(guī)定在生產(chǎn)人用重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)工藝中不能使用IPTG解決方法：lac和tac啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄受溫度嚴(yán)緊調(diào)控乳糖替代IPTG誘導(dǎo)lac和tac啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄PL和PR表達(dá)系統(tǒng)：以l噬菌體早期轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子PL、PR為核心構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)在野生型l噬菌體中，PL、PR啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄與否決定了l噬菌體進(jìn)入裂解循環(huán)還是溶源循環(huán)。轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理：由l噬菌體PE啟動(dòng)子控制的cI基因的產(chǎn)物是PL、PR啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄阻遏物。cI基因的產(chǎn)物在大腸桿菌宿主中的濃度取決于一系列宿主與噬菌體因子之間的錯(cuò)綜復(fù)雜的平衡關(guān)系。由于通過(guò)細(xì)胞因子來(lái)控制cI基因產(chǎn)物的產(chǎn)生和消失是相當(dāng)困難的。因此PL、PR表達(dá)系統(tǒng)都選用溫度敏感突變體cI857(ts)的基因產(chǎn)物來(lái)調(diào)控PL、PR啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。在較低溫度（30℃在較高溫度（42℃宿主菌中沒(méi)有cI基因產(chǎn)物，PL、PR啟動(dòng)子的高強(qiáng)度直接轉(zhuǎn)錄，帶有PL或PR啟動(dòng)子的表達(dá)載體在普通大腸桿菌中相當(dāng)不穩(wěn)定。對(duì)宿主菌的要求：用溶源化l噬菌體的大腸桿菌作PL、PR啟動(dòng)子表達(dá)載體的宿主菌N4830-1，POP2136等菌株已經(jīng)溶源化cI857(ts)l噬菌體，可用作表達(dá)外源基因時(shí)的宿主菌。把cI857(ts)基因組裝在表達(dá)載體上宿主菌選擇范圍更大PL和PR表達(dá)系統(tǒng)存在的問(wèn)題：由于PL和PR表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)時(shí)不加化學(xué)誘導(dǎo)劑，成本又低廉，最初幾個(gè)在大腸桿菌中制備的藥用重組蛋白質(zhì)都采用PL或PR表達(dá)系統(tǒng)。缺陷：在熱脈沖誘導(dǎo)過(guò)程中，大腸桿菌熱休克蛋白的表達(dá)也會(huì)被激活，其中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表達(dá)的重組蛋白。在大體積發(fā)酵培養(yǎng)菌體時(shí)，通過(guò)熱平衡交換方式把培養(yǎng)溫度從30℃提高到42T7表達(dá)系統(tǒng)：大腸桿菌T7噬菌體具有一套專一性非常強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄體系，利用這一體系中的元件為基礎(chǔ)構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)稱為T(mén)7表達(dá)系統(tǒng)。含T7噬菌體啟動(dòng)子的表達(dá)載體：在pET系列載體中，外源基因的表達(dá)受T7噬菌體RNA聚合酶調(diào)控：帶有pBR322的大腸菌素E1（colE1）復(fù)制區(qū)，從而使宿主菌有氨芐青霉素或卡那霉素抗性。外源基因插入多克隆位點(diǎn)，置于天然T7RNA聚合酶啟動(dòng)子或T7lac啟動(dòng)子的控制之下。T7噬菌體基因1編碼的T7RNA聚合酶選擇性的激活T7噬菌體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。T7RNA聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以轉(zhuǎn)錄某些不能被大腸桿菌RNA聚合酶有效轉(zhuǎn)錄的序列在細(xì)胞中存在T7RNA聚合酶和T7噬茵體啟動(dòng)子的情形下，大腸桿菌宿主本身基因的轉(zhuǎn)錄競(jìng)爭(zhēng)不過(guò)T7噬菌體轉(zhuǎn)錄體系，最終受T7噬菌體啟動(dòng)子控制的基因的轉(zhuǎn)錄達(dá)到很高的水平。轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理：T7噬菌體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄完全依賴于T7RNA聚合酶，因此T7RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式就決定了表達(dá)系統(tǒng)的調(diào)控方式?；瘜W(xué)誘導(dǎo)型溫度誘導(dǎo)型雙質(zhì)粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理：化學(xué)誘導(dǎo)型：噬菌體DE3是l噬菌體的衍生株，一段含有l(wèi)acI、lacUV5啟動(dòng)子和T7RNA聚合酶基因DNA片段被插入其int基因中用噬菌體DE3的溶源菌作為表達(dá)載體的宿主菌，調(diào)控方式為化學(xué)誘導(dǎo)型，類(lèi)似于Lac表達(dá)系統(tǒng)。溫度誘導(dǎo)型：PL啟動(dòng)子控制T7RNA聚合酶基因，通過(guò)熱誘導(dǎo)方式激發(fā)T7噬菌體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。這種方式可以使本底轉(zhuǎn)錄降到很低的水平，尤其適用于表達(dá)對(duì)大腸桿菌宿主有毒性的重組蛋白質(zhì)。雙質(zhì)粒系統(tǒng)：一個(gè)質(zhì)粒帶有T7RNA聚合酶基因，另一個(gè)質(zhì)粒帶有T7啟動(dòng)子和目的基因兩個(gè)質(zhì)粒的復(fù)制子和抗性標(biāo)記不能相同調(diào)控方式為控制T7RNA聚合酶的啟動(dòng)子調(diào)控類(lèi)型T7表達(dá)系統(tǒng)存在的問(wèn)題：T7表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的基因的水平是目前所有表達(dá)系統(tǒng)中最高的，但也不可避免出現(xiàn)在相對(duì)較高的本底轉(zhuǎn)錄，如果目的基因產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌宿主有毒性，會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。解決辦法之一：在表達(dá)系統(tǒng)中低水平表達(dá)T7溶菌酶基因。因?yàn)門(mén)7溶菌酶除了作用于大腸桿菌細(xì)胞壁上肽聚糖外，還能與T7RNA聚合酶結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄的活性。目前T7溶菌酶基因都通過(guò)共轉(zhuǎn)化質(zhì)拉導(dǎo)入表達(dá)系統(tǒng)，它能明顯降低本底轉(zhuǎn)錄，但對(duì)誘導(dǎo)后目的基因的表達(dá)水平無(wú)明顯影響。其他表達(dá)系統(tǒng)：營(yíng)養(yǎng)調(diào)控型：采用大腸桿菌堿性磷酸酯酶基因phoA啟動(dòng)子或甘油3’-磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)ugp啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)載體。這兩個(gè)啟動(dòng)子受在培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)磷（Pi）濃度調(diào)控（Pi﹥時(shí)抑制，Pi﹤1mmol/L時(shí)激活)，具有較高的轉(zhuǎn)錄水平。糖原調(diào)控型：采用的有大腸桿菌半乳糖轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（mglBAEC)mgl啟動(dòng)子或沙門(mén)氏菌阿拉伯糖基因araB啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)載體。這兩個(gè)啟動(dòng)子受葡萄糖抑制，巖藻糖和阿拉伯糖是它們的誘導(dǎo)物。其調(diào)控機(jī)理類(lèi)似于Lac表達(dá)系統(tǒng).pH調(diào)控型：采用大腸桿菌賴氨酸脫羧酶基因cadA啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)載體。cadA啟動(dòng)子受培養(yǎng)基中H+濃度，即pH值調(diào)控。（在pH﹥8時(shí)抑制，pH﹤6時(shí)激活，pH=6時(shí)轉(zhuǎn)錄活力最高）。該表達(dá)系統(tǒng)要求菌體發(fā)酵溫度控制在27～30℃溶氧調(diào)控型：采用大腸桿菌丙酮酸甲酸裂解酶基因pfl啟動(dòng)子，硝基還原酶基因nirB啟動(dòng)子或透明顫菌血紅蛋白基因vgb啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)載體。這些啟動(dòng)子中都含有對(duì)氧響應(yīng)的調(diào)節(jié)因子fnr的作用位點(diǎn)。在富氧條件下轉(zhuǎn)錄被抑制，在貧氧或微氧條件下轉(zhuǎn)錄被激活。大腸桿菌GJ100有透明顫菌血紅蛋白基因（vgb）啟動(dòng)子控制下的T7RNA聚合酶基因表達(dá)質(zhì)粒，vgb基因的轉(zhuǎn)錄是受環(huán)境溶氧濃度調(diào)控的，在貧氧條件下vgb基因的啟動(dòng)子被激活。因此，用大腸桿菌GJ100作為宿主時(shí)，表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控方式為貧氧誘導(dǎo)型，菌體發(fā)酵時(shí)的溶氧濃度可以通過(guò)控制攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量加以調(diào)節(jié)，與其他調(diào)控模式相比更適合于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程。生物素調(diào)控型：用大腸桿菌生物素操縱子及其調(diào)控區(qū)構(gòu)建表達(dá)載體，菌體生長(zhǎng)過(guò)程中生物素會(huì)不斷消耗，當(dāng)濃度到達(dá)2ng/ml以下時(shí)啟動(dòng)子被激活。能夠在沒(méi)有外界的物理，化學(xué)信號(hào)的介入條件下自動(dòng)誘導(dǎo)表達(dá)目的基因是這類(lèi)表達(dá)載體的特點(diǎn)，其缺陷是不容易精確控制自動(dòng)誘導(dǎo)的時(shí)刻。終止子：強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄終止的必要性：外源基因在強(qiáng)啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過(guò)頭現(xiàn)象，即RNA聚合酶滑過(guò)終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的DNA序列，形成長(zhǎng)短不一的mRNA混合物，過(guò)長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會(huì)影響外源基因的表達(dá)，其原因如下：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長(zhǎng)，RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄一分子mRNA所需的時(shí)間就相應(yīng)增加，外源基因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降；如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或DNA功能區(qū)域，如選擇性標(biāo)記基因和復(fù)制子結(jié)構(gòu)等，則RNA聚合酶在此處的轉(zhuǎn)錄可能干擾質(zhì)粒的復(fù)制及其它生物功能，甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性；過(guò)長(zhǎng)的mRNA往往會(huì)產(chǎn)生大量無(wú)用的蛋白質(zhì)，增加工程菌無(wú)謂的能量消耗；更為嚴(yán)重的是，過(guò)長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄物往往不能形成理想的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而大大降低外源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率強(qiáng)終止子的選擇與使用：目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子是來(lái)自大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2以及T7噬菌體DNA上的Tf。對(duì)于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄終止作用核糖體結(jié)合位點(diǎn)：核糖體結(jié)合位點(diǎn)：外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關(guān)。大腸桿菌細(xì)胞中結(jié)構(gòu)不同的mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時(shí)可高達(dá)數(shù)百倍。mRNA翻譯的起始效率主要由其5‘端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)包括下列四個(gè)特征結(jié)構(gòu)要素：位于翻譯起始密碼子上游的6–8個(gè)核苷酸序列5’UAAGGAGG3’即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通過(guò)識(shí)別大腸桿菌核糖體小亞基中的16SrRNA3’端區(qū)域3’AUUCCUCC核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因表達(dá)的影響SD序列的影響一般來(lái)說(shuō)，mRNA與核糖體的結(jié)合程度越強(qiáng)，翻譯的起始效率就越高，而這種結(jié)合程度主要取決于SD（UAAGGAGG）序列與16SrRNA的堿基互補(bǔ)性，其中以GGAG四個(gè)堿基序列尤為重要。對(duì)多數(shù)基因而言，上述四個(gè)堿基中任何一個(gè)換成C或T，均會(huì)導(dǎo)致翻譯效率大幅度降低SD序列與起始密碼子之間的距離的影響SD序列與起始密碼子AUG之間的精確距離保證了mRNA在核糖體上定位后，翻譯起始密碼子AUG正好處于核糖體復(fù)合物結(jié)構(gòu)中的P位，這是翻譯啟動(dòng)的前提條件。在很多情況下，SD序列位于AUG之前大約七個(gè)堿基處，在此間隔中少一個(gè)堿基或多一個(gè)堿基，均會(huì)導(dǎo)致翻譯起始效率不同程度的降低起始密碼子及其后續(xù)若干密碼子的影響大腸桿菌中的起始tRNA分子可以同時(shí)識(shí)別AUG、GUG和UUG三種起始密碼子，但其識(shí)別頻率并不相同，通常GUG為AUG50%，而UUG只及AUG的25%。除此之外，從AUG開(kāi)始的前幾個(gè)密碼子堿基序列也至關(guān)重要，至少這一序列不能與mRNA的5’目前廣泛用于外源基因表達(dá)的大腸桿菌表達(dá)型質(zhì)粒上，均含有與啟動(dòng)子來(lái)源相同的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列，序列和間隔是最佳的。密碼子：生物體對(duì)密碼子的偏愛(ài)性不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對(duì)簡(jiǎn)并密碼子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛(ài)性，其決定因素是：生物基因組中的堿基含量在富含AT的生物（如單鏈DNA噬菌體φX174）基因組中，密碼子第三位上的U和A出現(xiàn)的頻率較高；在GC豐富的生物（如鏈霉菌）基因組中，第三位上含有G或C的簡(jiǎn)并密碼子占90%以上的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)密碼子與反密碼子相互作用的自由能中等強(qiáng)度規(guī)律如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多細(xì)胞內(nèi)tRNA的含量密碼子偏愛(ài)性對(duì)外源基因表達(dá)的影響：由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大程大的差異性，因此外源基因尤其是高等哺乳動(dòng)物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個(gè)重要因素是密碼子的正確選擇。一般而言，有兩種策略可以使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細(xì)胞中獲得最佳表達(dá)：外源基因全合成同步表達(dá)相關(guān)tRNA編碼基因質(zhì)?？截悢?shù)：質(zhì)?？截悢?shù)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)代謝的影響目前實(shí)驗(yàn)室里廣泛使用的表達(dá)型質(zhì)粒在每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中可達(dá)數(shù)百甚至上千個(gè)拷貝，質(zhì)粒的擴(kuò)增過(guò)程通常發(fā)生在受體細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)，而此時(shí)正是細(xì)菌生理代謝最旺盛的階段。質(zhì)粒分子的過(guò)度增殖以及其后目的基因的高效表達(dá)勢(shì)必會(huì)影響受體細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，進(jìn)而導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達(dá)水平的下降解決上述難題的一種有效策略是將重組質(zhì)粒的擴(kuò)增納入可控制的軌道外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)：目標(biāo)蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的主要優(yōu)點(diǎn)是：表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建比較簡(jiǎn)單；能夠達(dá)到很高的目標(biāo)蛋白表達(dá)量，一般可以達(dá)到占細(xì)胞總蛋白的20%～40%。目標(biāo)蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)的形式有二種：在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為不溶性的包涵體顆粒（存在于大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)）在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為可溶性的蛋白質(zhì)（存在于細(xì)胞質(zhì)中外，還可分泌到周質(zhì)空間）包涵體型異源蛋白的表達(dá)：包涵體及其性質(zhì)在某些生長(zhǎng)條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無(wú)膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體（InclusionBodies，IB）由高效表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的大腸桿菌工程菌大量合成非天然性的同源或異源蛋白質(zhì)，后者在一般情況下也以包涵體的形式存在于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。包涵體表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定能夠避免細(xì)胞內(nèi)蛋白水解酶的作用，有利于目標(biāo)蛋白的富集簡(jiǎn)化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離操作包涵體的水難溶性及其密度遠(yuǎn)大于其它細(xì)胞碎片和細(xì)胞成分，菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過(guò)高速離心即可將重組異源蛋白從細(xì)菌裂解物中分離出來(lái)能夠表達(dá)對(duì)大腸桿菌宿主有毒或有致死效應(yīng)的目標(biāo)蛋白包涵體表達(dá)形式的缺點(diǎn)以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過(guò)有效的變性復(fù)性操作，才能回收得到具有正確空間構(gòu)象（因而具有生物活性）的目標(biāo)蛋白經(jīng)過(guò)復(fù)性處理的目標(biāo)蛋白不一定能完全恢復(fù)原來(lái)的生物學(xué)活性，有時(shí)甚至完全得不到有活性的蛋白蛋復(fù)性處理工藝可使目標(biāo)蛋白的制備成本上升。分泌型異源蛋白的表達(dá)在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為可溶性的蛋白質(zhì)目標(biāo)蛋白以可溶性蛋白質(zhì)形式表達(dá)雖然可以避免包涵體復(fù)性帶來(lái)的問(wèn)題，但是也有一定的缺陷，主要表現(xiàn)為大腸桿菌本身存在于細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)往往只含有少量的，甚至沒(méi)有半胱氨酸殘基。富含半胱氨酸殘基，需要形成二硫鍵的蛋白質(zhì)大部份被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞的其他部位。這是因?yàn)榇竽c桿菌細(xì)胞質(zhì)微環(huán)境的氧化還原態(tài)勢(shì)不利于蛋白質(zhì)二硫鍵的形成，而且缺少一種形成二硫鍵所必須的體系。一些需要通過(guò)二硫鍵的形成來(lái)維持其構(gòu)象的目標(biāo)蛋白在大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)中往往不能正確折疊。解決這一問(wèn)題的途徑之一是用大腸桿菌氧硫還蛋白還原酶基因trxB缺陷株作為宿主菌表達(dá)目標(biāo)蛋白。研究表明trxB缺陷株細(xì)胞質(zhì)的氧化還原態(tài)勢(shì)發(fā)生了變化，蛋白質(zhì)在trxB缺陷株的細(xì)胞質(zhì)中能夠形成二硫鍵。這一菌株對(duì)于表達(dá)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)而言是一·個(gè)相當(dāng)重要的工具。在細(xì)胞質(zhì)中直接表達(dá)不帶有前導(dǎo)序列的成熟蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中直接表達(dá)不帶有前導(dǎo)序列的成熟蛋白質(zhì)需要起始密碼，通常為編碼甲硫氨酸的ATG。⑴在多數(shù)情況下，N端附加的甲硫氨酸對(duì)蛋白質(zhì)的性質(zhì)沒(méi)有特別的影響，但是也有附加的甲硫氨酸嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)生物學(xué)活力的報(bào)道。⑵另外，附加的甲硫氨酸也可能改變蛋白質(zhì)的免疫性質(zhì)和藥理性質(zhì)。從制備用于醫(yī)療目的的蛋白質(zhì)的角度來(lái)看，這是一個(gè)需要引起重視的問(wèn)題。去除附加的甲硫氨酸有二種方法：⑴在表達(dá)系統(tǒng)中共表達(dá)甲硫氨酸氨肽酶基因。⑵在分離純化后在體外用外肽酶處理。但它們都對(duì)與甲硫氨酸相鄰的氨基酸殘基類(lèi)型有一定要求，因此在使用上有一定的限制。目標(biāo)蛋白與有親合配基的序列融合表達(dá)與純化包涵體相比，細(xì)胞質(zhì)中以可溶性形式表達(dá)蛋白質(zhì)的分離純化過(guò)程比較復(fù)雜，一般要通過(guò)親合層析才能達(dá)到比較高的純度。目標(biāo)蛋白與有親合配基的序列融合表達(dá)既可以提高分離純化的效率，又能在融合蛋白切離的過(guò)程中得到?jīng)]有附加甲硫氨酸目標(biāo)蛋白。金黃色葡萄球菌蛋白G、A和衍生物Z，日本血吸蟲(chóng)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白，His-tag等是目前常用的與目標(biāo)基因融合表達(dá)的序列。目標(biāo)蛋白在周質(zhì)空間中表達(dá)目標(biāo)蛋白在周質(zhì)空間中表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)⑴大腸桿菌周質(zhì)空間中自身蛋白質(zhì)的數(shù)量約為100種，只占菌體總蛋白數(shù)量的4%。蛋白水解酶的含量與在細(xì)胞質(zhì)中相比也少得多，因此目標(biāo)蛋白在周質(zhì)空間中表達(dá)有利于分離純化和減少蛋白水解酶的降解。⑵目標(biāo)蛋白從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)空間過(guò)程中信號(hào)肽被加工切除，有效地避免了N端附加的甲硫氨酸的產(chǎn)生。⑶周質(zhì)空間中呈氧化型的氧化還原態(tài)勢(shì)使目標(biāo)蛋白能夠較好折疊，維持正確的構(gòu)象。高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù)：表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計(jì)共表達(dá)大腸桿菌稀有密碼子tRNA基因提高目標(biāo)基因mRNA和目標(biāo)基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性高密度發(fā)酵和工程化宿主細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計(jì)：在各種表達(dá)載體中，啟動(dòng)子和SD序列的下游都設(shè)計(jì)了一段含有各種限制性酶切位點(diǎn)的序列，用于目標(biāo)基因的插入。這一插入位點(diǎn)附近的序列將成為核糖體結(jié)合位點(diǎn)的一部分，因此它對(duì)于構(gòu)建高效表達(dá)質(zhì)粒是至關(guān)重要的。由于每一個(gè)基因都具有各自獨(dú)特的5’構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時(shí)首先要考慮使目標(biāo)基因的翻譯起始密碼ATG與SD序列之間的距離和堿基組成處于一個(gè)適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)。核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列的變化對(duì)mRNA的翻譯效率有顯著影響，具體表現(xiàn)為：SD序列UAAGGAGG的翻譯效率要比AAGGA高3～6倍翻譯起始密碼ATG與UAAGGAGG的最適距離是6～8個(gè)堿基長(zhǎng)度，與AAGAA的最適距離是5～7個(gè)堿基長(zhǎng)度ATG與UAAGGAGG至少相隔3～4個(gè)堿基，與AAGAA至少相隔5個(gè)堿基；mRNA的翻譯才能進(jìn)行ATG與SD序列之間的堿基組成為A，T堿基豐富時(shí)，mRNA翻譯效率較高。共表達(dá)大腸桿菌稀有密碼子tRNA基因表達(dá)水平高的基因呈現(xiàn)的密碼子偏愛(ài)性高于表達(dá)水平低的基因。共表達(dá)大腸桿菌稀有密碼子tRNA基因由于同義密碼子的使用頻率與細(xì)胞內(nèi)對(duì)應(yīng)的tRNA的豐度有正比關(guān)系稀有密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA的豐度很低，有可能在翻譯過(guò)程中發(fā)生中止和移碼突變。解決這一問(wèn)題的辦法：通過(guò)基因突變把稀有密碼子改變?yōu)槠渌褂妙l率高的同義密碼子。在表達(dá)系統(tǒng)中共表達(dá)稀有密碼子tRNA基因，以提高大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)稀有密碼子tRNA的豐度提高目標(biāo)基因mRNA和目標(biāo)基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性由于大腸桿菌防御體系的自身保護(hù)作用，大腸桿菌中的核酸酶和蛋白水解酶能夠降解目標(biāo)基因mRNA和目標(biāo)基因產(chǎn)物，這種降解作用程度對(duì)不同的基因或蛋白質(zhì)而言是不同的，具有一定的專一性和選擇性。蛋白水解酶的特點(diǎn)細(xì)胞質(zhì)是蛋白水解酶含量最多的區(qū)域，目標(biāo)蛋白在細(xì)胞質(zhì)中最容易受到蛋白水解酶的作用。通過(guò)對(duì)已知大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的半衰期進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)N末端為Arg、Lys、Leu、Phe、Tyr、Trp殘基的蛋白質(zhì)，含有Pro、Glu、Ser、Thr豐富區(qū)的蛋白質(zhì)容易降解，穩(wěn)定性較差在細(xì)胞內(nèi)有多肽碎片、突變的異常蛋白和外界物理因素的刺激的條件下，大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的蛋白水解酶活力往往能達(dá)到比較高的水平。提高目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性的措施主要有：利用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)把目標(biāo)蛋白最終累積在周質(zhì)空間，或分泌到培養(yǎng)基中采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作為宿主菌。對(duì)分子量較小的目標(biāo)基因進(jìn)行融合表達(dá)或串聯(lián)聚合表達(dá)。共表達(dá)能提高特定目標(biāo)蛋白穩(wěn)定性的輔助因子，如分子伴侶基因。對(duì)蛋白質(zhì)序列中的蛋白水解酶敏感區(qū)域和識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行改造。在較低的溫度下培養(yǎng)菌體和優(yōu)化發(fā)酵條件。大腸桿菌對(duì)分子量較大的目標(biāo)蛋白的較運(yùn)和分泌效率一般比較低，不能滿足大規(guī)饃制備的需要。蛋白水解酶含量低的菌株往往代謝不旺盛，生長(zhǎng)速率慢，使高密度發(fā)酵比較困難。融合表達(dá)使目標(biāo)蛋白的構(gòu)象與天然狀態(tài)不一樣，導(dǎo)致生物比活力降低，甚至沒(méi)有活性。融合蛋白和串聯(lián)聚合蛋白需要用酶或化學(xué)的方法切割出單體目標(biāo)蛋白。酶法成本比較高且加入的酶蛋白還必須分離去除?；瘜W(xué)法比酶法成本低，但不少裂解試劑有毒性。對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行改造需要有基本的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，而目前這方面的數(shù)據(jù)庫(kù)還不完整。高密度發(fā)酵和工程化宿主細(xì)胞大腸桿菌高密度發(fā)酵是大規(guī)模制備重組蛋白質(zhì)過(guò)程中不可缺少的工藝步驟。其目的是在單個(gè)菌體對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)水平基本不變的前提下，通過(guò)單位體積的菌體數(shù)量的成倍增加來(lái)實(shí)現(xiàn)總表達(dá)量的提高。目前常用的發(fā)酵方式有：恒定培養(yǎng)、流加補(bǔ)料培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)三種構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌：高密度發(fā)酵后期由于菌體的生長(zhǎng)密度較高，培養(yǎng)基中的溶氧飽和度往往比較低，氧氣的不足導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)速率降低和乙酸的累積，乙酸的存在對(duì)目標(biāo)基因的高效表達(dá)有明顯的阻抑作用。這是高密度發(fā)酵工藝研究中最迫切需要解決的問(wèn)題。雖然在發(fā)酵過(guò)程中可采取通氧氣，提高攪拌速度，控制補(bǔ)料速度等措施來(lái)控制溶氧飽和度，減少乙酸的產(chǎn)生。但從實(shí)際應(yīng)用上看，這些措施都有一定的滯后效應(yīng)，難以做到比較精確的控制。因此構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌，是從恨本上解決問(wèn)題的途徑之一。利用透明顫菌血紅蛋白能提高大腸桿菌在貧氧條件下對(duì)氧的利用率的生物學(xué)性質(zhì)，把透明顫菌血紅蛋白基因vgb導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)以增加其對(duì)溶氧的寬容度。從而降低菌體產(chǎn)生乙酸所要求的溶氧飽和度閥值。用基因敲除技術(shù)缺失大腸桿菌的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因pta1和乙酸激酶基因ackA，使從丙酮酸到乙酸的合成途徑被阻斷。改變代謝流的方向，通過(guò)共轉(zhuǎn)化把枯草桿菌、釀酒酵母的乙酰乳酸合成酶基因alsS，單胞菌的丙酮酸脫羧酶基因pdc1和乙醇脫氫酶基因adh2導(dǎo)入大腸桿菌，使丙酮酸的代謝有選擇地向生成3‘-羥基丁酮或乙醇的方向進(jìn)行。對(duì)于以可溶性或分泌形式表達(dá)的目標(biāo)蛋日而言，隨著發(fā)酵后期各種蛋白水解酶的累積，目標(biāo)蛋白會(huì)遭到蛋白水解酶的作用而被降解。為了使對(duì)蛋白水解酶比較敏感的目標(biāo)蛋白也能獲得較高水平的表達(dá)，需要構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌。rpoH基因編碼大腸桿菌RNA聚合酶的r32亞基，r32亞基對(duì)大腸桿菌中多種蛋白水解酶的活力有正調(diào)控作用。rpoH基因缺陷的突變株己經(jīng)被構(gòu)建，研究結(jié)果表明它能明顯提高目標(biāo)基因的表達(dá)水平。到目前為止，已知的大腸桿菌蛋白水解酶基因缺陷的突變株都巳被獲得，其中一部分具有實(shí)際應(yīng)用的潛力。甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)：甲醇酵母（methylotrophicyeast)指可利用甲醇作單一碳源的一類(lèi)酵母。畢赤酵母（Pichiapastoris)\漢森酵母（Hansenulaploymorpha)\假絲酵母（Candiaboidinii)甲醇氧化酶：A、甲醇代謝關(guān)鍵酶，占可溶蛋白的30%以上。B、名稱和拷貝數(shù)不同畢赤酵母/假絲酵母漢森酵母醇氧化酶甲醇氧化酶alcoholoxidase,AOXmethanoloxidase,MOXAOX1、AOX2MOX甲醇氧化酶啟動(dòng)子A、目前已發(fā)現(xiàn)的、最強(qiáng)的真核啟動(dòng)子B、嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控型啟動(dòng)子AOX1：葡萄糖和甘油脫阻遏、甲醇誘導(dǎo)。MOX：葡萄糖阻遏、甘油脫阻遏、甲醇誘導(dǎo)甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)A、表達(dá)水平高（最高水平的系統(tǒng)）B、產(chǎn)物可翻譯后修飾：糖基化、磷酸化、酰脂化C、過(guò)糖基化程度比釀酒酵母少（8-15個(gè)vs100-150個(gè)甘露糖）D、產(chǎn)物可正確折疊和高效分泌（最高分泌表達(dá)系統(tǒng)）E、可利用簡(jiǎn)單無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基高密度發(fā)酵，生物量大。F、實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)操作簡(jiǎn)單G、不能滿足結(jié)構(gòu)要求嚴(yán)格的糖基化甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)操作原理：宿主株與標(biāo)記基因、甲醇酵母系統(tǒng)的整合事件、胞內(nèi)表達(dá)與分泌表達(dá)甲醇酵母系統(tǒng)的整合事件：YRp型載體：漢森系統(tǒng)傳代不穩(wěn)定，傳代過(guò)程同源或非同源重組，高選擇壓力迫使高拷貝數(shù)整合，可達(dá)100拷貝。YIp型載體：A、在靶序列處線性化載體DNA，誘導(dǎo)同源重組B、有“插入”和“取代”二類(lèi)整合模式C、主要為單拷貝整合，1-10%為多拷貝整合甲醇酵母系統(tǒng)高效表達(dá)影響因素與對(duì)策：1、載體穩(wěn)定性同拷貝數(shù)時(shí)，整合型的比自主復(fù)制型的表達(dá)水平高YRp型載體的穩(wěn)定化：選擇—非選擇培養(yǎng)交替數(shù)十代可得穩(wěn)定的整合子，但費(fèi)時(shí)，整合位點(diǎn)不確定。采用YIp型載體:更易實(shí)現(xiàn)整合、整合位點(diǎn)清楚2、基因劑量外源基因表達(dá)存在基因劑量效應(yīng)3、篩選多拷貝整合子載體引入G418/Zeocin抗性標(biāo)記，整合子拷貝數(shù)與抗性成正相關(guān)，采用高G418/Zeocin抗性轉(zhuǎn)化子。體外串聯(lián)多個(gè)表達(dá)盒，直接獲多拷貝整合子采用YRp型載體穩(wěn)定化技術(shù)獲高拷貝整合子構(gòu)建高拷貝整合型表達(dá)載體4、整合位點(diǎn)外源基因表達(dá)盒整合于AOX/MOX或標(biāo)記基因處，均可高效表達(dá)畢赤酵母中個(gè)別情況整合于His4位點(diǎn)的比AOX1位點(diǎn)的低5、甲醇利用表型在分泌表達(dá)情況下，甲醇慢生長(zhǎng)型更利于表達(dá)6、mRNA5’端mRNA5’端非翻譯區(qū)（UTR）的組成與長(zhǎng)度應(yīng)盡量與AOX1/MOX的一致應(yīng)盡量避免在UTR區(qū)出現(xiàn)AUG和次級(jí)結(jié)構(gòu)7、AT含量分泌信號(hào)AT含量越高、越容易出現(xiàn)類(lèi)似于終止子的結(jié)構(gòu)；分泌表達(dá)效率與所用分泌信號(hào)高度相關(guān)可采用釀酒酵母來(lái)源的MFα、PHO或SUC等的信號(hào)肽，或野生型信號(hào)肽，但適用性要比較分析。表達(dá)蛋白的檢測(cè)：酶活力測(cè)定、SDS、Westernblotting肖亞中：RNA技術(shù)RNA分子特征：A/U/C/G構(gòu)成，核糖的2位子為-OH，在堿性條件下不穩(wěn)定；●為單鏈分子，內(nèi)部易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，普通電泳不能顯示其真實(shí)大小，應(yīng)使用甲醛變性電泳檢測(cè)；●胞內(nèi)外存在有多量RNA酶，該酶極穩(wěn)定，RNA易受其降解。RNA處理：RNA酶無(wú)處不在：RNA酶穩(wěn)定性極高，僅SDS或苯酚不能使其完全失活；酶活性也不依賴于金屬離子，EDTA無(wú)作用；RNA酶熱穩(wěn)定好，煮沸不能失活。避免RNA酶降解：創(chuàng)造不利于酶活性發(fā)揮的環(huán)境！使用專用試劑、器械；使用專用環(huán)境/臺(tái)柜；使用RNA酶活抑制劑。常用RNA酶活抑制劑：焦碳酸二乙酯(DEPC)：高活性的烷化劑，可不加選擇的修飾蛋白質(zhì)和RNA,用于滅活緩沖液和玻璃器皿中的RNA酶。分離和純化RNA過(guò)程不用。易揮發(fā)致癌，通風(fēng)櫥操作。酶的蛋白質(zhì)抑制劑(RNasiin)：從人胎盤(pán)組織分離的蛋白質(zhì)，分子量約50KD，單一多肽，可與多種RNA酶緊密結(jié)合形成非共價(jià)等摩爾復(fù)合物使其失活。使用時(shí)至少需要1mMDTT存在才有抑制活性，最適pH5-8。常-20C保存于5mMDTT的50%甘油中。不同公司產(chǎn)品商品名不同，易變性失活。氧釩核糖核苷復(fù)合物(VRC)：與多種RNA酶活性位點(diǎn)結(jié)合，幾乎全部抑制酶活性。不能共價(jià)修飾RNA酶，故在提取純化RNA的全過(guò)程都需添加，濃度10mM。器皿和試劑的處理：干熱滅菌：玻璃、金屬及耐熱品，用RNA酶去除劑洗滌后鋁箔包裹，180-200C4小時(shí)以上；濕熱滅菌：一次性塑料品等，滅1-2小時(shí)；無(wú)菌水也用此法滅，盛水器皿先干熱滅菌；DEPC處理水：用滅菌水配成0.1%濃度，室溫或37C12h處理，后打開(kāi)瓶口，高溫高壓20min滅菌處理2次；RNA酶去除劑：玻璃、塑料品用2%Absolve（Dupout公司）浸泡過(guò)夜，再無(wú)菌水漂洗、干燥。RNA質(zhì)量檢測(cè)：吸光度檢測(cè)：A260/A280在1.8-2.0范圍內(nèi)；電泳檢測(cè)：28S和18S條帶清晰，兩者亮度比值在2倍以上；保溫檢測(cè)：70C保溫1h，電泳檢測(cè)沒(méi)有新降解RNA制備（一）AGPC法（acid-guanidine-phenol-chloroform）：原理：核酸在酸性水溶液中親水性低，酸性酚抽提時(shí)，DNA溶于酚相，RNA溶于水相，據(jù)此用于少量RNA制備。RNA制備（二）NP-40法（NonidetP-40）：原理：細(xì)胞置于低滲壓下，吸水膨脹處于易裂解狀態(tài)，用表面活性劑(乙基苯基聚乙二醇)可提出胞質(zhì)RNA。適用于RNA少量制備，不易被RNA酶降解，也不易被基因組DNA污染。RNA制備（三）試劑盒法：QIAGENCo.RNeasy試劑盒RNA純化：前述提取的RNA為總RNA，rRNA占80-85%,tRNA占10-20%,mRNA僅2-5%，甚至更少;真核生物mRNA在被轉(zhuǎn)錄時(shí)，其3-端總是被添加一些腺苷酸，形成聚腺苷酸尾，而rRNA與tRNA不具有Poly(A)尾。oligo(T)磁珠法：poly(A)與poly(U)或poly(T)能退火配對(duì)，將后者固定，可用于吸附純化poly(A)+mRNA。oligo(dT)纖維素法純化poly(A)+mRNA復(fù)習(xí)思考題1.有哪些RNA提取方法？其主要原理是什么？RNA提取過(guò)程中如何防止RNase污染？2.如何進(jìn)行RNA的電泳檢測(cè)？如何通過(guò)電泳圖譜判定RNA質(zhì)量？3.簡(jiǎn)述純化poly(A)+RNA的基本原理？4.為何要純化poly(A)+RNA？操作過(guò)程中需要注意哪些問(wèn)題？1cDNA文庫(kù)通過(guò)一系列酶催化使總poly(A)mRNA制劑轉(zhuǎn)變成雙鏈cDNA群體，并重組于適當(dāng)?shù)妮d體分子，轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，便構(gòu)成了包含所有基因編碼序列的cDNA文庫(kù)。2cDNA克隆法運(yùn)用cDNA文庫(kù)技術(shù)，以mRNA為模板合成雙鏈DNA，并對(duì)真核生物基因進(jìn)行克隆的技術(shù)。3cDNA文庫(kù)構(gòu)建（1）細(xì)胞總RNA的制備及mRNA的純化是進(jìn)行cDNA文庫(kù)構(gòu)建的第一步。從供體細(xì)胞制備總RNA相對(duì)容易，但總RNA中含有大量的tRNA和rRNA，mRNA含量相對(duì)較少(一般占2-5%)，文庫(kù)構(gòu)建時(shí)一般需用純化的mRNA分子。mRNA純化方法：真核基因mRNA分子的3′-末端都有一段poly(A)尾巴，可用一段偶聯(lián)于惰性物質(zhì)(纖維素/瓊脂糖)的寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸[oligo(dT)]通過(guò)吸附層析進(jìn)行純化。純化程序：制備oligo(dT)纖維素層析柱，使總RNA流過(guò)纖維素柱，mRNA的Poly(A)尾巴與oligo(dT)序列雜交而吸附于柱上，rRNA和tRNA流過(guò)柱子，用100mMNaCl充分洗脫rRNA和tRNA分子，再用10mMTris/1mMEDTA洗下含有目的2）合成第一鏈cDNA通常有兩種方法：一種是oligo(dT)引導(dǎo)法；另一為隨機(jī)引物引導(dǎo)法(randomlyprimedcDNAsynthesis)目前普遍采用后一方法。①oligo(dT)引導(dǎo)法:利用真核生物mRNA分子具有poly(A)尾巴的特性，先用12-20個(gè)脫氧胸腺嘧啶核苷組成的oligo(dT)短片段，與上述制備的mRNA分子混合(雜交)，并以其作為引物，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下，以mRNA分子為模板合成cDNA第一鏈。該反應(yīng)產(chǎn)物為DNA/RNA雜交分子，此法有一定局限性，即：對(duì)于大分子的mRNA第一鏈cDNA合成效率低。因?yàn)檫@種方法進(jìn)行cDNA合成時(shí)，必須從3′-末端開(kāi)始，而逆轉(zhuǎn)錄酶較難有效到達(dá)長(zhǎng)的mRNA分子的5′-末端。②隨機(jī)引物引導(dǎo)cDNA合成法能克服上述方法不足。使用根據(jù)許多可能序列合成的寡聚核苷酸片段混合物(6-10bp)，作為合成第一鏈的引物，cDNA的合成可從mRNA模板的許多位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行，對(duì)于長(zhǎng)的mRNA分子也比較有效。（3）雙鏈cDNA分子的生成從mRNA/DNA雜交分子合成雙鏈cDNA分子也有多種方法：①自我引導(dǎo)法②RNaseH酶解取代法，等，其中①自我引導(dǎo)法是最經(jīng)典方法，現(xiàn)仍常用。①自我引導(dǎo)法實(shí)驗(yàn)程序：①先用堿處理，將mRNA模板水解，使第一鏈cDNA游離出來(lái)，并在其末端自發(fā)形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)(hairpinloop)；②再以此結(jié)構(gòu)為引物，引導(dǎo)cDNA第二鏈合成，產(chǎn)生含有一個(gè)完整發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的雙鏈cDNA；③之后用S1核酸酶切割處理，去除單鏈部分，得到雙鏈的cDNA分子。但該方法受S1核酸酶純度影響，往往會(huì)使得到的雙鏈cDNA丟失原有mRNA的5′-端的許多序列，目前已被下述方法所取代。②RNaseH酶解取代法RNaseH酶能識(shí)別mRNA/DNA中的mRNA組分，并將其降解成許多短碎片，這些片段仍能與第一鏈cDNA分子雜交，故可作為DNA聚合酶I活性的引物。因此，可利用原來(lái)的cDNA第一鏈合成第二鏈cDNA。當(dāng)然，此情況下合成的第二鏈cDNA分子是處于間斷不連續(xù)的狀態(tài)(存在有許多切口)，但通過(guò)DNA連接酶連接后，即可轉(zhuǎn)化為連續(xù)完整的雙鏈cDNA分子。RNaseH降解取代法合成雙鏈cDNA，基本上不丟失從mRNA分子5′-端開(kāi)始的全部核苷酸序列。（4）全長(zhǎng)cDNA合成的方法①oligo(dG)引導(dǎo)合成法在第一鏈cDNA分子未與mRNA模板分離前,先在其3′-端加上一段oligo(dC),堿性蔗糖梯度離心處理，使mRNA分子發(fā)生水解，收回cDNA第一鏈，再以互補(bǔ)的oligo(dG)作引物，引導(dǎo)第二鏈cDNA合成，可避免發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)和使用S1核酸酶引起的克隆序列部分缺失。②載體引導(dǎo)合成法因第一鏈cDNA由參入到載體分子的oligo(dT)作引物引導(dǎo)合成而得名。制備3′-末端具有oligo(dT)質(zhì)粒引物,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈,并在3′-端生成oligo(dG)；降解mRNA，富集全長(zhǎng)DNA分子，變性；另制備3′-末端具有oligo(dC)質(zhì)粒DNA，變性后與前者混合退火，經(jīng)聚合酶作用后轉(zhuǎn)化E.coli細(xì)胞。③置換合成法是有效的全長(zhǎng)cDNA合成法，分三步：第一步：制備質(zhì)粒引物(plasmidprimer)和具有oligo(dG)尾巴的接頭DNA(adaptorDNA)第二步：構(gòu)建質(zhì)粒cDNA重組體分子第三步：去除mRNA分子，合成第二鏈cDNA（5）cDNA文庫(kù)生成用載體(質(zhì)粒/噬菌體)將雙鏈cDNA重組，將重組體DNA轉(zhuǎn)入寄主細(xì)胞，獲得重組體細(xì)胞群體。cDNA片段與載體DNA連接方式：粘末端法平末端法末端加尾法人工合成接頭法，等。菠菜甜菜堿醛脫氫酶(BADH)基因的克隆甜菜堿是植物滲調(diào)劑之一，在植物處于干旱和鹽漬的災(zāi)害環(huán)境下能保護(hù)細(xì)胞質(zhì)免受損害，在植物抗鹽抗旱基因工程研究中受到重視。甜菜堿是由膽堿經(jīng)兩步酶促反應(yīng)合成，最后起關(guān)鍵作用的一步是由甜菜堿醛脫氫酶所催化。此前，對(duì)BADH已有許多研究：1990年Hanson從菠菜中克隆了BADHcDNA；1992年又從甜菜中克隆了BADHcDNA。二、RT-PCR(ReverseTranscription-PCR)RT-PCR是指在mRNA反轉(zhuǎn)錄之后進(jìn)行的PCR，以擴(kuò)增特定mRNA之DNA片段為目標(biāo)。用于mRNA之cDNA克隆及測(cè)定用模板DNA的制備等。還常用于RNA分子的檢測(cè)、分析不同組織，或相同組織不同發(fā)育階段mRNA表達(dá)狀況。通常情況下，細(xì)胞中某種mRNA的數(shù)量是其編碼基因活性的反映。某mRNA的數(shù)量隨不同時(shí)空狀態(tài)下編碼基因表達(dá)活性大小而不同：即存在有高豐度、中豐度及低豐度mRNART-PCR對(duì)于研究低豐度mRNA具有較好的敏感性，解決了常規(guī)方法中用Northern雜交才能分析檢測(cè)的問(wèn)題RT-PCR反應(yīng)分兩步：第一步：以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下合成與RNA互補(bǔ)的cDNA第二步：以cDNA為模板，像一般的PCR一樣對(duì)靶序列進(jìn)行擴(kuò)增在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)系統(tǒng)中，除了RNA樣品、PCR緩沖液和4×dNTP外，還包括RNA酶抑制劑(RNasin)，單引物和逆轉(zhuǎn)錄酶引物：一般為隨機(jī)6聚寡核苷酸(randomhexameroligonucleotides)；也可用下游引物(downstreamprimer)或寡聚dT(oligodT)常用的逆轉(zhuǎn)錄酶有兩種：①禽類(lèi)成髓細(xì)胞性白血病病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶②莫洛尼鼠類(lèi)白血病病毒(MO-MLV)逆轉(zhuǎn)錄酶模板RNA分子：必須是完整的，不能含有DNA、蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)。含有微量的DNA，經(jīng)PCR后可能會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。有RNA酶污染，會(huì)使模板RNA降解逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物：在42℃下溫育30-60min，結(jié)束后，反應(yīng)管在95℃水浴中加熱5-10min，使RNA/cDNA雙鏈變性，并滅活逆轉(zhuǎn)錄酶MO-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶為37℃，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶最適溫度是72℃然后快速冰上冷卻，再向反應(yīng)管中加入適量的PCR緩沖液，上游和下游引物、TaqDNAPol.，接著，以在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中合成的cDNA單鏈為模板，進(jìn)行PCR循環(huán)該方法可以檢出在單個(gè)細(xì)胞中少于10個(gè)拷貝的特異mRNA，廣泛應(yīng)用于從細(xì)胞或組織克隆功能蛋白的編碼序列RT-PCR法克隆真菌漆酶Potentialapplicationoflaccase?Delignification:Biopulping,Kraftligninbleaching?Bioremediation:Transformationordegradationofpoly-chlorophenols,alkenes,herbicides,dyes,etal.?Biosensor?Druganalysis?Wineclarification?Ethanolproduction?BiocellN-terminalaminoacidsequenceThesolesequenceofproteinsamplewasdeterminedbyEdmanmethod.Thesequenceoffirst15residuesattheaminoterminuswas引物合成Senseprimer(30bp):5′-AAAGAATTCGC(A/C)AT(A/T)GG(A/G)CC(C/T)ACCGCTGA-3′（EcoRI）1234567aaAntisenseprimer:（1）oligodT(寡聚dT)(18bp)（2）相似性比較分析設(shè)計(jì)(36bp)5'-TTTGGATCCCTGGTCGTTGACATCGAGCGCGTC-3'（BamHI）12345678aa三、cDNA末端快速擴(kuò)增法(RACE)在進(jìn)行文庫(kù)篩選或使用簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，常獲得不完整的cDNA序列。為得到cDNA的全長(zhǎng)，需要克隆出其余部分，可以采用cDNA末端快速擴(kuò)增法(rapidamplificationofcDNA，RACE)。cDNA末端快速擴(kuò)增法只需知道m(xù)RNA內(nèi)部一段序列，即可擴(kuò)增出其cDNA的5′端(5′-RACE)或cDNA的3′端(3′-RACE)。cDNA的5′-末端的快速擴(kuò)增(5′-RACE)存在于cDNA基因文庫(kù)中的部分克隆，由于反轉(zhuǎn)錄酶未能沿全長(zhǎng)mRNA模板延伸完全，合成的cDNA第一鏈往往在5′-端不完整。起始mRNA模板過(guò)長(zhǎng)，二級(jí)結(jié)構(gòu)含量過(guò)高，都會(huì)造成反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA5′-端不完整。5′-RACE法可以快速擴(kuò)增cDNA的5′-端。5′-RACE小結(jié)5′-RACE技術(shù)要求對(duì)靶mRNA或cDNA的部分克隆的少量序列是已知的。包括三個(gè)連續(xù)的酶促反應(yīng)：反轉(zhuǎn)錄、同聚物加尾和PCR擴(kuò)增。主要特征：就是利用根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)的特異性引物(序列特異性引物1和接頭引物2)，和一條與加至cDNA第一鏈3′-端的同聚尾互補(bǔ)的通用引物(接頭引物1TTTTTT)擴(kuò)增得到5′-端序列。cDNA的3′末端的快速擴(kuò)增(3′-RACE)在用oligo(dT)引物構(gòu)建的cDNA文庫(kù)中，偶爾發(fā)生部分cDNA克隆缺失了與靶mRNA3′-末端互補(bǔ)的序列(這部分序列如何缺失尚不清楚，可能是第一鏈cDNA的隨機(jī)斷裂，在合成第二鏈cDNA的過(guò)程中DNA聚合酶不能抵達(dá)模板鏈的末端等)，可以采用3′-RACE反應(yīng)得到3′-末端未知的序列。3′-RACE小結(jié)3′-RACE技術(shù)要求對(duì)靶mRNA或cDNA的部分克隆的少量序列是已知的。包括了二個(gè)連續(xù)的酶促反應(yīng):反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增主要特征：用3′-末端的oligo(dT)接頭引物(TTTTT接頭引物1)，把mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR反應(yīng)。應(yīng)用基因特異性引物特異性接頭引物2與oligo(dT)接頭引物1引導(dǎo)如有必要，可用第一步的PCR產(chǎn)物作為模板進(jìn)行第二次嵌套式PCR。轉(zhuǎn)錄分析是基因功能分析不可缺少的實(shí)驗(yàn)技術(shù)Northern印跡、點(diǎn)印跡，RNase保護(hù)、RT-PCR，等Northern印跡用于分析目標(biāo)基因mRNA的大小、轉(zhuǎn)錄部位和轉(zhuǎn)錄量，等轉(zhuǎn)錄分析RNaseA降解單鏈RNA，待測(cè)的RNA若與標(biāo)記的RNA探針雜交，形成RNA-RNA雜交體則被保護(hù)起來(lái)，經(jīng)電泳可被檢查。廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄定量、起始位點(diǎn)、終止位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)分析，以及突變位點(diǎn)和多態(tài)位點(diǎn)的檢測(cè)等。袁璟：基本操作、DNA一、實(shí)驗(yàn)方案的確定

1、明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

基因操作實(shí)驗(yàn)的主要目的有三個(gè)：①分離目的基因，獲取DNA序列信息；②研究基因體內(nèi)功能；③研究和應(yīng)用基因表達(dá)產(chǎn)物。2.實(shí)驗(yàn)方法的選擇和實(shí)驗(yàn)流程的設(shè)計(jì)

在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法時(shí)應(yīng)考慮以下幾點(diǎn)：①能否達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康?；②是否符合?shí)驗(yàn)室現(xiàn)狀；③是否符合自己的喜好。試驗(yàn)流程設(shè)計(jì)：首先，應(yīng)確定使用怎樣的實(shí)驗(yàn)方法；其次，根據(jù)試驗(yàn)規(guī)模和研究室情況；

最后，根據(jù)研究人員生活規(guī)律確定試驗(yàn)時(shí)間。3.實(shí)驗(yàn)遵循的原則：①忠于實(shí)驗(yàn)流程②關(guān)注實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)③準(zhǔn)備充足的實(shí)驗(yàn)材料④設(shè)平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)⑤準(zhǔn)確的試劑用量⑥數(shù)據(jù)整理二、實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的注意事項(xiàng)⑴第一次實(shí)驗(yàn)成功，第二次實(shí)驗(yàn)馬虎。⑵實(shí)驗(yàn)精度：①必須嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行的操作；②較嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)操作，允許5%的變動(dòng)；③允許20%變動(dòng)的實(shí)驗(yàn)操作；④不需要特別注意的實(shí)驗(yàn)操作。⑶酶促反應(yīng)不順利時(shí)，若加入更多的酶或DNA，結(jié)果會(huì)越來(lái)越糟。⑷不設(shè)平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)往往是實(shí)驗(yàn)失敗的原因。⑸樣本標(biāo)記的零亂也往往是實(shí)驗(yàn)失敗的重要原因。三、獲得實(shí)驗(yàn)材料方法及途徑：購(gòu)買(mǎi)、利用公共服務(wù)機(jī)構(gòu)、接受饋贈(zèng)寫(xiě)求助信要注意：①你需要什么？②及時(shí)、真實(shí)的將相關(guān)信息告訴對(duì)方，不能隱瞞。③通常向論文通訊作者尋求幫助。④寫(xiě)信的稿紙是印有單位標(biāo)志、名稱、電話號(hào)碼等信息的公函紙。四、實(shí)驗(yàn)室規(guī)則與安全⒈實(shí)驗(yàn)室規(guī)則：⑴保持肅靜⑵保持整潔⑶嚴(yán)格操作⑷注意節(jié)約⑸保證安全⒉實(shí)驗(yàn)室常識(shí)⑴使用貴重儀器如分析天平、分光光度劑、離心機(jī)等倍加愛(ài)護(hù)，使用前熟知使用方法，使用時(shí)嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，發(fā)生故障時(shí)，立即關(guān)機(jī)。⑵凡揮發(fā)性、有煙霧、有毒和有氣味的實(shí)驗(yàn)，均應(yīng)在通風(fēng)柜內(nèi)進(jìn)行。⑶配制試劑時(shí)，應(yīng)對(duì)試劑純度、結(jié)構(gòu)式、分子質(zhì)量等特性熟悉，做到“有的放矢”。⑷量瓶是量器，不要用量瓶做容器。⑸洗凈器皿應(yīng)倒置架上，使其自然風(fēng)干。⒊實(shí)驗(yàn)室安全⑴《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》（中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB19489—2004）⑵了解電閘、水閥煤氣總閥門(mén)所在處，離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室檢查是否關(guān)好。⑶使用電器設(shè)備時(shí)嚴(yán)防觸電。⑷使用高溫高壓鍋滅菌時(shí)不得離人。⑸使用可燃物，特別是易燃物，應(yīng)特別小心。⑹凡使用腐蝕性試劑，必須謹(jǐn)慎操作，防止濺出。⑺廢液特別是強(qiáng)酸強(qiáng)堿，應(yīng)稀釋后倒入水池。⑻有毒物品應(yīng)按照實(shí)驗(yàn)室規(guī)定辦理審批手續(xù)后方可領(lǐng)取，使用時(shí)嚴(yán)格操作，用后妥善處理。⒋實(shí)驗(yàn)室急救⑴觸電①關(guān)閉電源；②用干木棍將導(dǎo)線與被害者分開(kāi)；③將被害者移至木板上，與地面分離；④急救者必須做好觸電安全措施，手腳必須絕緣。⑵火災(zāi)隔絕氧氣①起火物與水相容：水、濕布、沙土、滅火器等②起火物與水不相容：不可用水⑶燙傷乙醇消毒，涂2%苦味酸或5%鞣酸，防感染⑷玻璃割傷或其他器械損傷清理傷口，硼酸水洗凈，涂碘酒，包扎⑸灼傷皮膚①?gòu)?qiáng)堿：大量清水稀釋，涂5%硼酸或2%乙酸②強(qiáng)酸、溴：大量清水稀釋，5%NaHCO3或5%氨水⑹煤氣中毒呼吸新鮮空氣思考題：1、如何獲得你需要的實(shí)驗(yàn)材料（特別是未商品化的材料）？答案2、什么是《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》（GB19489-2004）？據(jù)此生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室可分幾級(jí)？答案3、實(shí)驗(yàn)室發(fā)生火災(zāi)時(shí)該如何處理？燙傷、灼傷時(shí)該如何處理？答案4、如何處理對(duì)環(huán)境有污染的試劑？答案第二章儀器操作與溶液配制（1）臺(tái)式高速離心機(jī)、微型離心機(jī)用于固液分離（沉淀細(xì)胞碎片、分離DNA、蛋白質(zhì)等）；離心甩干（使附著于管壁的液體沉入管底）。（2）冷凍離心機(jī)分離制備基因組DNA或蛋白等發(fā)酵產(chǎn)物恒溫水浴鍋、恒溫金屬浴多用于酶切、連接酶促反應(yīng)，將Eppendrof管放置水浴或金屬浴加熱儀器中進(jìn)行反應(yīng)。紫外線可分為短波、中波、長(zhǎng)波等類(lèi)型，短波光線強(qiáng)（200-280nm），對(duì)DNA損傷大。實(shí)驗(yàn)室一般使用中波（280-315nm），使用時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡。因燈管和過(guò)濾板有使用壽命，用完后及時(shí)關(guān)閉。1、實(shí)驗(yàn)用水水的純化方法：有蒸餾法、離子交換、反滲透、活性炭吸附、微孔過(guò)濾等方法。蒸餾水：蒸餾法純化，根據(jù)蒸餾次數(shù)可分為單蒸、雙蒸和多次蒸餾水。蒸餾水可以滿足普通分析實(shí)驗(yàn)室的用水要求。由于很難排除二氧化碳的溶入。所以水的電阻率是很低的，達(dá)不到MΩ級(jí)。不能滿足許多新技術(shù)的需要。單蒸和多次蒸餾可分別制取國(guó)家三級(jí)和二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)水，分別可用于配置普通培養(yǎng)基、一般溶液和生化、組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。去離子水：離子交換法純化，可獲得十幾MΩ的去離子水，卻無(wú)法有效的去除大部分的有機(jī)物或微生物。而微生物可附著在樹(shù)脂上，并以樹(shù)脂作為培養(yǎng)基，使得微生物可快速生長(zhǎng)并產(chǎn)生熱源。離子交換法可制得國(guó)家二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)水，可用于實(shí)驗(yàn)室中的簡(jiǎn)單清洗與配制普通溶液和培養(yǎng)基。現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室多用結(jié)合反滲透膜、離子交換、活性炭吸附等技術(shù)的純水裝置（如Milli-Q純水器）制成的純凈水。超純水：反滲透(RO)法是可達(dá)到90%~99%雜質(zhì)去除率中最經(jīng)濟(jì)的方法。RO膜的濾孔結(jié)構(gòu)致密，能去除無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)物（分子量>500）、細(xì)菌、熱源、病毒、懸濁物（粒徑>0.1μm）等。反滲透法結(jié)合離子交換、過(guò)濾等其他方法，可獲得國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)水（18MΩ超純水），如Milli-Q水。18MΩ超純水常用于基因操作，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后可用作HPLC分析用水。2、儲(chǔ)液實(shí)驗(yàn)室中配置的溶液分為儲(chǔ)液（保存用）和工作液。如：TAE緩沖液，儲(chǔ)液配成10×濃度，工作液為1×濃度。3、試劑稱量精度一般稱量精度為3位有效數(shù)字。如：配置500mL5×TBE，需稱取27.0gTris，13.8g硼酸，1.86gNa2-EDTA。4、試劑滅菌實(shí)驗(yàn)室常采用高壓蒸汽滅菌法處理一般培養(yǎng)基、生理鹽水、槍頭及其他耐濕耐高溫物品，通常壓力在103.4kPa，器內(nèi)溫度可達(dá)121.3℃，維持15-30min不可高溫高壓滅菌的試劑，有些需采用微孔濾膜過(guò)濾除菌：①遇熱不穩(wěn)定試劑，如抗生素、丙烯酰胺、DTT、β-巰基乙醇、IPTG等;②易揮發(fā)的試劑，如乙酸銨等;③有機(jī)溶劑不需要高壓滅菌，如氯仿、無(wú)水乙醇、異丙醇等抽提核酸的有機(jī)試劑無(wú)需滅菌;④腐蝕性、刺激性強(qiáng)的試劑。問(wèn)題：1、如何正確使用微量移液器？使用中應(yīng)特別注意哪些事項(xiàng)？答案2、配制培養(yǎng)基時(shí)，通常使用哪種級(jí)別的水？為什么？答案3、哪些試劑需要高溫高壓滅菌？哪些試劑不能采用高溫高壓滅菌？對(duì)于不能采用高溫高壓方式滅菌的試劑如何滅菌？滅菌后試劑如何保存？是否需要分裝？答案第三章大腸桿菌培養(yǎng)與保存第一節(jié)培養(yǎng)前準(zhǔn)備1、大腸桿菌菌株常用菌株JM109：該菌株在使用pUC系列質(zhì)粒載體進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)化或用M13phage載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)進(jìn)行藍(lán)白篩選。DH5α：常用于質(zhì)粒克隆，能進(jìn)行藍(lán)白篩選，轉(zhuǎn)化率高BL21(DE3)：蛋白酶活性低，用于高效表達(dá)用于高效表達(dá)克隆于含有噬菌體T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體（如pET系列）的基因，可進(jìn)行藍(lán)白篩選。TOP10：適用于高效的DNA克隆和質(zhì)粒擴(kuò)增，能保證高拷貝質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳。接種工具接種環(huán)：用于液體培養(yǎng)基的接種及平板劃線。小木棒：用于從平板向液體轉(zhuǎn)接細(xì)菌。牙簽：用于從平板菌落中挑選需要的單菌落。涂布棒：用于向平板上涂布液體菌體。接種操作環(huán)境及物品的消毒滅菌高溫高壓滅菌（培養(yǎng)基、試劑、槍頭、小木棒、牙簽等）過(guò)濾除菌（0.22μm微孔濾膜）（抗生素）干熱滅菌（平板等玻璃器皿及金屬器皿）火焰滅菌（試管瓶口、接種環(huán)等）紫外線滅菌（器械及超凈臺(tái)、塑料器皿）70%乙醇滅菌（操作臺(tái)、實(shí)驗(yàn)人員手、微量取液器、涂布棒、塑料器皿）培養(yǎng)基種類(lèi)1）液體培養(yǎng)基：盛于試管或三角瓶，用于大量繁殖菌株以提取質(zhì)粒DNA或表達(dá)目的蛋白質(zhì)。2）固體培養(yǎng)基：用于平板培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)等，目的是使菌落增殖到一定大小，以獲取分離出單菌落或保存。3）抗生素質(zhì)粒載體中常含有抗生素抗性基因作為微生物選擇標(biāo)記?？股乜商峁┻x擇壓力，同時(shí)還可防止雜菌生長(zhǎng)。無(wú)菌水或乙醇溶解抗生素，過(guò)濾除菌后，在接種前加入到液體培養(yǎng)基中，或固體培養(yǎng)基滅菌冷卻至60℃大腸桿菌培養(yǎng)無(wú)菌操作前用70%乙醇消毒臺(tái)面，并用紫外燈照射10min以上。離酒精燈較近距離進(jìn)行無(wú)菌操作。開(kāi)蓋前和開(kāi)蓋后用酒精燈灼燒瓶口2至3次。瓶口傾斜，不得垂直向上。使用平皿時(shí)盡量去除凝結(jié)在蓋子上的水珠，并不得混淆蓋子。生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)分光光度計(jì)測(cè)定600nm波長(zhǎng)下的菌液吸光值，對(duì)照是未接菌的培養(yǎng)基。A600=0.2~1.0時(shí)為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，A600＞1.0為平臺(tái)期。A600=1.0為108個(gè)/mL。37℃平板劃線培養(yǎng)平板涂布培養(yǎng)大腸桿菌菌株保存簡(jiǎn)易傳代保藏）1、普通瓊脂斜面保存2、半固體穿刺保存（長(zhǎng)期保藏）3、甘油管保存普通瓊脂斜面保存細(xì)菌劃線接種于斜面，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，移入4℃冰箱中冷藏保存。一般可保存一個(gè)月，每月傳代一次?？蓪⒁后w石蠟加入生長(zhǎng)好的斜面上，適當(dāng)延長(zhǎng)保藏時(shí)間。半固體穿刺保存將培養(yǎng)基制成軟瓊脂（一般為1%），盛入1.2×10cm的小試管或螺旋口小試管內(nèi)，高度為試管的1/3。121℃高壓滅菌后不制成斜面，用針形接種針挑取單菌落，從表面垂直穿過(guò)瓊脂直達(dá)管底數(shù)次，原路線垂直退出，37可加入1cm高度的高壓滅菌2次的石蠟油，使密封性更好，移入4℃冰箱中冷藏保存。一般可保存6-12個(gè)月。甘油管保存液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)物瓊脂平板上生長(zhǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)物瓊脂平板表面刮下細(xì)菌放入裝有2mLLB無(wú)菌試管中；再加入等量含有30%滅菌甘油的LB培養(yǎng)基，震蕩混合物使甘油完全分布均勻；分裝后冰凍保存。可用于保存cDNA文庫(kù)等。問(wèn)題：1、配制氨芐青霉素等抗生素時(shí)是否需要滅菌？如何滅菌?2、在進(jìn)行大腸桿菌培養(yǎng)時(shí)，何時(shí)需要大量培養(yǎng)？何時(shí)需要小量培養(yǎng)？培養(yǎng)應(yīng)注意哪些問(wèn)題？3、大腸桿菌的保存方法主要有哪些？第四章基因操作中的酶學(xué)反應(yīng)第一節(jié)DNA聚合酶定義：把脫氧核糖核苷酸連續(xù)的加到雙鏈DNA分子引物鏈的3’-OH末端，催化DNA合成,而不發(fā)生從引物模板上解離的情況。常用有：大腸桿菌DNA聚合酶Ｉ、大腸桿菌DNA聚合酶Ｉ的Klenow大片段酶、T4DNA聚合酶TaqDNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶Ｉ（全酶）：1957年，美國(guó)的生物學(xué)家A.Kornberg首次證實(shí)，在大腸桿菌提取物中存在一種DNA聚合酶，即現(xiàn)在所說(shuō)的DNA聚合酶Ｉ。由polＩ基因編碼的一種單鏈多肽蛋白質(zhì)，分子量為109000D。DNA聚合酶Ｉ，可以被蛋白酶切割成兩個(gè)片段，一個(gè)具有全部的3’-5’的外切酶活性和5’-3’的聚合酶活性，另一個(gè)具有全部DNA聚合酶Ｉ發(fā)揮作用的條件：dNTPs、Mg2+離子、帶有3’-OH游離基團(tuán)的引物鏈、DNA模板。特性：5’-3’的外切酶活性，所切割的DNA5’-3’核酸外切酶的活性位點(diǎn)同聚合作用的活性位點(diǎn)以及3’反應(yīng)物中缺乏dNTPs時(shí)，大腸桿菌DNA聚合酶Ｉ的3’-5’核酸外切酶活性，將會(huì)發(fā)揮作用。對(duì)于底物是雙鏈的DNA，在具有dNTPs時(shí)，3’-5’降解活性將會(huì)被5’-3’的聚合酶活性所抑制。主要用途：用DNA切口平移方法標(biāo)記DNA，制備供核酸分子雜交用的帶放射性標(biāo)記的DNA探針。(僅該全酶能用于此反應(yīng))對(duì)DNA分子3’突出尾進(jìn)行末端標(biāo)記利用3’-5’外切核酸酶活性去除DNA的3’突出尾而產(chǎn)生3’凹端。然后在高濃度放射性標(biāo)記的核苷酸前體存在下，外切降解與dNTP二、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段）Klenow片段：是由大腸桿菌DNA聚合酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶的處理之后，產(chǎn)生出來(lái)的分子量為76000D的大片斷分子。仍具有5’-3’的聚合酶活性和3’-5’的外切酶活性，失去了全酶的5’Klenow片斷的主要用途：補(bǔ)平經(jīng)限制酶消化的DNA所形成的3’凹端；標(biāo)記DNA片段的末端；cDNA克隆的第二鏈cDNA的合成；DNA序列的測(cè)定。T4DNA聚合酶T4DNA聚合酶：從T4噬菌體感染的大腸桿菌培養(yǎng)物中純化出的一種特殊的DNA聚合酶。具有5’-3’的聚合酶活性和3’-5’特點(diǎn)：在沒(méi)有dNTP存在的情況下，3’外切酶活性便是T4DNA聚合酶的獨(dú)特功能。作用于雙鏈DNA片斷，并按3’-5’的方向從3’-OH末端開(kāi)始降解DNA。如果反應(yīng)物中存在一種dNTP時(shí)，它的水解作用進(jìn)行到暴露出同反應(yīng)物中唯一的dNTP互補(bǔ)的核苷酸時(shí)就會(huì)停止。用途：取代合成法標(biāo)記DNA片段。在反應(yīng)過(guò)程中，通過(guò)T4DNA聚合作用，反應(yīng)物中的α-32p-dNTP逐漸地取代了被外切活性刪除掉的DNA片段上原有的核苷酸，因此叫做取代合成。TaqDNA聚合酶是一種耐熱的依賴于DNA的DNA聚合酶，1969年從極度嗜熱的棲熱水生菌中純化而來(lái)的。廣泛用于PCR體外擴(kuò)增特定序列DNA及DNA測(cè)序。特性：具有依賴于聚合作用的5’-3’外切核酸酶活性。具體作用溫度取決于靶序列，最佳作用溫度為75-80℃，每個(gè)酶分子可延伸約150個(gè)核苷酸/秒，60℃時(shí)聚合酶活性僅剩1/2，37℃時(shí)活性僅剩1/10。70℃延伸率大于60個(gè)核苷酸/秒，55℃時(shí)為22個(gè)核苷酸/秒。普通Taq酶無(wú)3′→5′外切活性，在PCR反應(yīng)中如發(fā)生某些堿基的錯(cuò)配，該酶是沒(méi)有校正功能。TaqDNA聚合酶的堿基錯(cuò)配機(jī)率為2.1×10-4。具有非模板依賴的末端（脫氧腺嘌呤核苷酸）轉(zhuǎn)移酶活性，可以在PCR產(chǎn)物3‘末端加上A，其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可直接用來(lái)TA克隆。作用時(shí)需要Mg2+，對(duì)其濃度非常敏感，每次擴(kuò)增反應(yīng)需確定最佳Mg2+濃度。磷酸鹽緩沖液抑制該酶活性，忌用之。第二節(jié)限制性內(nèi)切核酸酶一、基本特性1、定義：一類(lèi)能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某些特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。2、分類(lèi)：按限制酶的組成、與修飾酶的活性關(guān)系以及切斷核酸的情況不同，分為三類(lèi)：Ⅰ型、Ⅱ型*、Ⅲ型。3、命名：EcoRⅠE代表Escherichia屬co代表coli種R代表RY13株羅馬數(shù)字區(qū)別不同特異性的酶4、識(shí)別序列：Ⅱ型限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列長(zhǎng)度通常為4~8個(gè)核苷酸，多數(shù)具有對(duì)稱的回文結(jié)構(gòu)。5、末端結(jié)構(gòu)：限制酶切割DNA后，均產(chǎn)生含5’磷酸基和3’羥基的末端。粘性末端：2個(gè)單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相對(duì)的，交錯(cuò)切割結(jié)果形成的DNA限制片段具有粘性末端。平頭末端：有一些酶沿對(duì)稱軸切斷DNA，產(chǎn)生平端或鈍端（Bluntend）。質(zhì)粒載體的限制性酶切消化根據(jù)質(zhì)粒圖譜、目標(biāo)DNA序列和成本，選擇酶的種類(lèi)；根據(jù)酶在不同緩沖液中的相對(duì)活力以及產(chǎn)品說(shuō)明，選擇合適的酶切緩沖液；根據(jù)產(chǎn)物用途、酶活力以及產(chǎn)品使用手冊(cè)，確定反應(yīng)體系、酶量及底物、反應(yīng)溫度及時(shí)間。PCR產(chǎn)物的限制性酶切消化：大多數(shù)限制酶對(duì)裸露的酶切位點(diǎn)不能切斷?；旧纤邢拗泼?，在其酶切位點(diǎn)旁邊加上3個(gè)以上的保護(hù)堿基后，可以對(duì)其酶切位點(diǎn)進(jìn)行有效切斷。對(duì)于切割效率差的PCR產(chǎn)物片段，也可通過(guò)先TA克隆再酶切的策略。影響核酸內(nèi)切限制酶活性的因素(1)DNA的純度；:(2)DNA的甲基化程度；(3)DNA的分子結(jié)構(gòu)；(4)酶切消化反應(yīng)的溫度；(5)酶緩沖液；(6)近末端切割；(7)星號(hào)活力*。星號(hào)活力（第二活力）：指改變了酶切反應(yīng)條件后特異識(shí)別序列特性降低的一種現(xiàn)象。由于識(shí)別特異性降低，可能對(duì)原識(shí)別序列相似的序列也產(chǎn)生切割反應(yīng)。第三節(jié)DNA連接酶一、T4DNA連接酶DNA連接酶：能在雙鏈DNA的5’磷酸末端和3’羥基末端之間形成磷酸二酯鍵?；虿僮髦谐Ｓ么竽c桿菌噬菌體T4編碼的T4DNA連接酶。特點(diǎn)：不僅能連接具有相同粘性末端的兩個(gè)DNA分子，還可以連接平末端雙鏈DNA分子。但后者連接效率比較低，一般可提高酶濃度或增加DNA濃度來(lái)提高平末端的連接效率。酶最適溫度為37℃，但該溫度下粘性末端氫鍵不穩(wěn)定，所以連接反應(yīng)一般采取12~16℃連接過(guò)夜。二、常用DNA連接試劑盒1、常用TA克隆試劑盒TA克?。簩?′端具有單個(gè)“A”突出末端的PCR產(chǎn)物克隆到3′端具有單個(gè)“T”突出末端的線性化載體的克隆法。2、常規(guī)DNA連接試劑盒TakaraDNALigationKit（適用于粘性末端和平末端）InvitrogenTOPO?Blunt-endcloning注意：不同公司出品的試劑盒可能有不同的連接溫度和反應(yīng)時(shí)間要求，需根據(jù)需