（四）超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域

近年來在研究蛋白質(zhì)構(gòu)象、功能和進(jìn)化的變化時，發(fā)現(xiàn)在蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)之間存在著兩個過渡層次，即超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域。1、超二級結(jié)構(gòu)多肽鏈內(nèi)若干順序上相鄰的二級結(jié)構(gòu)的構(gòu)象單元在空間折疊中靠近，彼此相互作用，形成有規(guī)則的，在空間上能辨認(rèn)的二級結(jié)構(gòu)的組合體。超二級結(jié)構(gòu)在結(jié)構(gòu)層次上高于二級結(jié)構(gòu)，但不具有功能。超二級結(jié)構(gòu)的形式主要有：-螺旋組合（

）；-折疊組合（）；-螺旋-折疊組合（

）；；希臘鑰匙結(jié)構(gòu)超二級結(jié)構(gòu)類型：back（五）蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)：1、概念包括主側(cè)鏈在內(nèi)的所有原子在三維空間的排列。

一條多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，由于順序上相隔較遠(yuǎn)的氨基酸殘基側(cè)鏈的相互作用，進(jìn)行范圍更廣泛的盤繞、折疊，形成很不規(guī)范但特定的空間構(gòu)象。

具有三級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子，往往具有球形、橢球形的物理外形，稱之為球蛋白。球蛋白常常是生物體內(nèi)具有一定生理功能的活性蛋白質(zhì)。例如：肌紅蛋白（Mb）;核糖核酸酶；細(xì)胞色素C；2、穩(wěn)定三級結(jié)構(gòu)的作用力氫鍵疏水力（疏水作用力）范氏引力（分子間的作用力）離子鍵（鹽鍵）酯鍵二硫鍵Garrett&Grisham(1999)Biochemistry(2e)p.181三級結(jié)構(gòu)中的氫鍵二級結(jié)構(gòu)氫鍵三級結(jié)構(gòu)氫鍵ahelixbsheetGarrett&Grisham(1999)Biochemistry(2e)p.181胰臟

trypsininhibitor三級結(jié)構(gòu)中的疏水作用力疏水性氨基酸基團(tuán)以水溶性蛋白質(zhì)而言(脂溶性蛋白質(zhì)恰相反)Albertsetal(2002)MolecularBiologyoftheCell(4e)p.135親水性基團(tuán)3、球蛋白分子結(jié)構(gòu)的一般特征一條肽鏈往往是通過一部分а-螺旋，一部分?-折疊，拐角處形成?-轉(zhuǎn)角或無軌卷曲盤繞折疊成致密的—球形分子具有極性側(cè)鏈的氨基酸殘基幾乎分布在分子的表面—親水的表面而非極性氨基酸側(cè)鏈的殘基包埋在分子的內(nèi)部形成—疏水的核分子表面往往有一個裂隙（口袋；凹槽），常常是疏水的環(huán)境。這一部位常常是球蛋白的—活性部位Hexokinase

具有兩個結(jié)能域Albertsetal(1994)MolecularBiologyoftheCell(3e)p.196domaindomain細(xì)胞色素C的空間結(jié)構(gòu)4、肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)肌紅蛋白是哺乳動物肌肉中運輸氧的蛋白質(zhì)。是1957年由JohnKendrew用X射線晶體分析法測定的有三維結(jié)構(gòu)的第一個蛋白質(zhì)。由153個氨基酸殘基組成的一條多肽鏈。分子內(nèi)含有一個血紅素輔基。相對分子量17800d（六）蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)1、寡聚蛋白和蛋白質(zhì)亞基分子量較大的蛋白質(zhì)往往由兩條或兩條以上的多肽鏈組成，這些肽鏈相互之間以非共價鍵結(jié)合，每條多肽鏈各自具有一定的三級結(jié)構(gòu)，但肽鏈單獨存在時不具有生物活性，這種肽鏈就稱為——蛋白質(zhì)的亞基

亞基聚合在一起形成具有一定生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)分子——寡聚蛋白2、蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)

寡聚蛋白質(zhì)中亞基的空間排布、相互關(guān)系和相互作用力，稱之為蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。亞基的種類和數(shù)量均一四級結(jié)構(gòu)

不均一四級結(jié)構(gòu)亞基的空間排布亞基間的相互作用力次級鍵HemoglobinMyoglobinMathewsetal(2000)Biochemistry(3e)p.214血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)五、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

蛋白質(zhì)分子具有多種多樣的生物功能是以其極其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的。這不僅需要一定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，更重要的是需要特定的空間結(jié)構(gòu)作基礎(chǔ)。研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系是分子生物學(xué)的一個重要方面。1、分子病

分子病（moleculardisease)：是一種遺傳性疾病，由于DNA分子上基因突變，而合成了失去正常生物活性的異常蛋白質(zhì)，或者是缺失某種蛋白質(zhì)，從而影響了機(jī)體正常的生理功能而產(chǎn)生的疾病。研究表明幾乎所有遺傳病都與pr分子結(jié)構(gòu)改變有關(guān)。鐮刀型紅細(xì)胞貧血病是1904年首先被發(fā)現(xiàn)的一種分子病。病人的血紅蛋白（Hb-S）與正常人血紅蛋白（Hb-A）相比，鏈第6位氨基酸不同。

HbAVal-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-

HbSVal-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys-僅僅這一點差別，就使患者的紅細(xì)胞在氧缺乏時呈鐮刀狀，易脹破發(fā)生溶血，運氧機(jī)能降低，引起頭昏、胸悶等貧血癥狀。2、種屬差異與分子進(jìn)化同源蛋白質(zhì)：不同種屬中完成相同功能的蛋白質(zhì)。對于不同種屬來源的同種pr進(jìn)行一級結(jié)構(gòu)測定和比較，發(fā)現(xiàn)存在種屬差異。這種差異可能是分子進(jìn)化的結(jié)果。比較種屬來源不同而功能相同的同源pr的一級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)與活性和pr空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān)的aa殘基高度保守。（二）酶原與激素原的激活1.胰島素原的激活2.蛋白水解酶原的激活胰蛋白酶原（trypsinogen）

胰蛋白酶（trypsin）腸激酶／胰蛋白酶

Lys6-Ile7Ｎ端６肽（十二指腸）消化道中蛋白酶原激活的連鎖反應(yīng)：

胰蛋白酶原胰蛋白酶腸激酶／胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶彈性蛋白酶原彈性蛋白酶羧肽酶原羧肽酶一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ)蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象歸根到底是由一級結(jié)構(gòu)決定一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系是十分重要的一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系實際上反映的也是高級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（二）蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)的構(gòu)象并不是固定不變的。別構(gòu)現(xiàn)象：有些蛋白質(zhì)表現(xiàn)其生物活性時，其構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變整個分子的性質(zhì)，這種現(xiàn)象叫別構(gòu)現(xiàn)象。血紅蛋白在表現(xiàn)其輸氧功能時就具有別構(gòu)現(xiàn)象。(R)relaxedstate(T)tensestateHemoglobinLung氧分子MyoglobinMuscle靜脈動脈環(huán)境氧濃度高時Hb快速吸收氧分子環(huán)境氧濃度低時Hb迅速釋出氧分子任何一個亞基接受氧分子后，會增進(jìn)其它亞基吸附氧分子的能力氧結(jié)合曲線（氧解離曲線）

020406080100O2分壓Y100501HbMb2一級結(jié)構(gòu)

(氨基酸序列)

↓二級結(jié)構(gòu)

(

helix,sheet)

↓三級結(jié)構(gòu)

(monomer)

↓四級結(jié)構(gòu)

(dimer)序列↓構(gòu)象↓活性↓調(diào)節(jié)有智慧？有生命？有形體？Domain

(結(jié)構(gòu)域)JuangRH(2004)BCbasics蛋白質(zhì)各級結(jié)構(gòu)的意義兩性解離高分子量性質(zhì)膠體溶液性質(zhì)蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性五、蛋白質(zhì)的性質(zhì)（一）蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)：(1)蛋白質(zhì)具有酸堿兩性(2)蛋白質(zhì)的可解離基團(tuán)：肽鏈末端的α-氨基和α-羧基輔基部分包含的可解離基團(tuán)側(cè)鏈上的可解離基團(tuán)：ε-氨基，β-羧基，γ-羧基，咪唑基，胍基，酚基，巰基(3)蛋白質(zhì)的等電點(PI)：蛋白質(zhì)以兼性離子存在時，溶液的pH值，就是蛋白質(zhì)的等電點。

PrCOOHNH3+OH-H+PrNH3+COO－OH-PrH+NH2COO－正離子pH＜pI兩性離子pH﹦pI負(fù)離子pH＞pI含堿性氨基酸殘基較多的，pI偏堿，反之，偏酸。含酸堿氨基酸殘基數(shù)目相近者，等電點為中性偏酸。如魚精蛋白：pI=12～12.4如胃蛋白酶：pI=1～2.5胰島素：pI=5等電沉淀：蛋白質(zhì)分子在等電點的溶液中，溶解度最低，最容易從溶液中析出，用這種方法沉淀蛋白質(zhì)，稱為等電沉淀。(4)利用蛋白質(zhì)兩性性質(zhì)可分離純化蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)電泳：蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負(fù)極移動。這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù),稱為電泳(elctrophoresis)。電泳自由界面電泳區(qū)帶電泳：紙電泳，凝膠電泳、醋酸纖維薄膜電泳幾種重要的蛋白質(zhì)電泳*SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于蛋白質(zhì)分子量的測定。*等電聚焦電泳，通過蛋白質(zhì)等電點的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。*雙向凝膠電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

有一混合蛋白質(zhì)（其pI值分別是4.6，5.0，5.3，6.7，7.3）溶液，電泳時欲使其中四種泳向正極，緩沖液pH應(yīng)該是多少？A.4.0B.6.0C.7.0

D.8.0

在pH7時，下列蛋白質(zhì)電泳的方向和相對應(yīng)位置圖示之。胰島素（5.3），核糖核酸（9.5）胃蛋白酶（PH=1.0）細(xì)胞色素C（PI=10.7）血紅蛋白（PI=6.7）+－pH<pIpH=pIpH>pI

Pro+Pro±Pro-點樣點（二）蛋白質(zhì)的高分子化合物性質(zhì)蛋白質(zhì)是分子量很大的生物大分子（104～106d或更大），蛋白質(zhì)的很多性質(zhì)與其分子量有關(guān)。測定蛋白質(zhì)分子量的方法有：根據(jù)化學(xué)組成測定最低相對分子量利用蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)來測定滲透壓法超離心法凝膠過濾法凝膠電泳法1、根據(jù)蛋白質(zhì)的化學(xué)組成測定最低相對分子量采用化學(xué)分析的方法，測定蛋白質(zhì)分子中某一微量元素的含量。假定蛋白質(zhì)分子中只含有一個這種被測定元素的原子，則可以計算出蛋白質(zhì)最低相對分子量。最低相對分子量=被分析元素的原子量被分析元素的百分含量如:肌紅蛋白，F(xiàn)e含量為：0.335%。==最低分子量=Fe原子量0.335%0.335%56.816700(d)如:血紅蛋白,Fe含量為：0.335%，計算其最低相對分子量也是16700，但根據(jù)其它方法測得的分子量是68000。真實分子量=最低分子量×nn—代表被分析元素的原子個數(shù)。如:牛血清清蛋白含色氨酸0.58%，計算所得的最低相對分子質(zhì)量是35200；每一個牛血清蛋白分子含兩個色氨酸分子，則真實分子量是69000。（色氨酸的分子量為204）該方法的優(yōu)點：計算所得的真實分子量十分精確。

缺點：必須和其它方法結(jié)合使用，否則不能提供真實分子量。2、超速離心法：SedimetationVelociy

采用分析性超速離心機(jī)（轉(zhuǎn)速大，50000—60000rpm

，配有光學(xué)系統(tǒng)，觀察離心情況）利用光學(xué)方法測定界面移動速度（用S表示），分子量越大，界面移動就越快。S——沉降系數(shù)(sedimentationcoefficient,S)

，代表大分子物質(zhì)在超速離心時單位離心力場的沉降速度，與蛋白質(zhì)的大小和形狀有關(guān)。其數(shù)值定為1×10-13秒，分子越大，沉降越快，其S值就越大。M=RTSD(1－vρ)R-氣體常數(shù)T-絕對溫度D-擴(kuò)散系數(shù)V-溶質(zhì)分子的密度倒數(shù)Ρ-介質(zhì)的密度S-沉降系數(shù)沉降速度法優(yōu)點：操作時間短，還可以鑒定純度（均一的蛋白質(zhì)溶液僅形成一個界面，而不同分子量的混合物形成幾個界面）．缺點：需要參數(shù)多3、凝膠過濾法——分子排阻層析技術(shù)（分子篩法）

這是根據(jù)分子大小分離、測定蛋白質(zhì)混合物的一種方法（柱層析）填充物：萄聚糖凝膠sephadex高度水化的惰性物質(zhì)具有不同網(wǎng)眼大小合成凝膠借助重力過柱：比網(wǎng)眼大的分子不能進(jìn)入網(wǎng)眼中比網(wǎng)眼小的分子進(jìn)入網(wǎng)眼中過柱時，所走的路程不同大分子先下來小分子后下來（三）蛋白質(zhì)的溶液是膠體溶液1、膠體溶液：以固體物質(zhì)做分散相，液體做分散劑的分散系。粗分散系：>100nm，不穩(wěn)定。膠體：100nm>分散顆粒>1nm，相對穩(wěn)定。真溶液：分散顆粒<1nm，穩(wěn)定。分散系是一種物質(zhì)以或大或小的顆粒分散到另一種物質(zhì)中去所得到的體系，它包括分散相和分散劑。根據(jù)分散相、分散劑的狀態(tài)，可構(gòu)成9種分散系。其中最常見的是分散相為固體、分散劑為液體的系統(tǒng)，又根據(jù)分散顆粒的大小，可分為三種分散系：2.維持親水膠體穩(wěn)定性的因素：顆粒大小：1nm～100nm質(zhì)點帶有相同電荷質(zhì)點與溶劑相結(jié)合，形成溶劑化層（水化層）3.蛋白質(zhì)的水溶液是膠體溶液++++++蛋白質(zhì)溶液穩(wěn)定的原因：1）表面形成水膜（水化層）；2）帶相同電荷。（四）蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)：分離、純化蛋白質(zhì)時，常需要進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀——凡是影響蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定因素的措施，都可用于沉淀蛋白質(zhì)。①pH值：（改變界質(zhì)酸堿度）pH=pI時溶解度最小，蛋白質(zhì)沉淀②高濃度的中性鹽——離子強(qiáng)度鹽溶：鹽析：-0.200.20.40.511.52低濃度時，鹽濃度溶解度鹽溶高濃度時，鹽濃度溶解度鹽析實際是離子強(qiáng)度的影響。（同樣濃度的二價中性鹽比單價鹽影響大）pI時，K2SO4對碳氧Hb溶解度的影響③有機(jī)溶劑（脫水劑）：如乙醇、丙酮等。④重金屬離子（Hg2+、Ag+、Pb2+、Cu2+）⑤生物堿試劑：如三氯乙酸、苦味酸、單寧酸、磷鎢酸等。（五）蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性

蛋白質(zhì)受物理或化學(xué)因素影響，其分子內(nèi)部原有的高度規(guī)律性結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，致使蛋白質(zhì)分子的理化性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)都有所變化，但并不導(dǎo)致其一級結(jié)構(gòu)的破壞，這種現(xiàn)象叫蛋白質(zhì)的變性。變性后的蛋白質(zhì)叫變性蛋白質(zhì)。1.什么叫變性(denaturation)2.變性實質(zhì)變性實質(zhì)最早由我國科學(xué)家吳憲發(fā)現(xiàn)(1931年)。在變性因素影響下，破壞了維持高級結(jié)構(gòu)的次級鍵和二硫鍵，蛋白質(zhì)分子從原來有序卷曲的緊密結(jié)構(gòu)變?yōu)闊o序的松散結(jié)構(gòu)。但一級結(jié)構(gòu)沒有破壞，組成成分和分子量都不變。3.變性因素物理因素：加熱（70～100

℃

）、高壓、劇烈振蕩、紫外線、超聲波等?；瘜W(xué)因素：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、尿素、去污劑、重金屬鹽、濃乙醇、生物堿試劑等。4.變性后理化性質(zhì)的變化①生物活性全部或部分喪失。②溶解度降低。③喪失結(jié)晶能力。④分子形狀改變，溶液粘度升高。⑤生化性質(zhì)改變，反應(yīng)基團(tuán)增加，易被蛋白水解酶消化。

應(yīng)用舉例臨床醫(yī)學(xué)上，變性因素常被應(yīng)用來消毒及滅菌。此外,防止蛋白質(zhì)變性也是有效保存蛋白質(zhì)制劑（如疫苗等）的必要條件。

5.蛋白質(zhì)的復(fù)性（renaturation）當(dāng)變性因素除去后，蛋白質(zhì)又可重新恢復(fù)到原來天然構(gòu)象的現(xiàn)象。可逆變性：可以復(fù)性的蛋白質(zhì)變性不可逆變性：生物活性不能再