單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)的試驗(yàn)步驟試劑及材料：

1）0.01MPBSpH7.3：8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4,溶于800ml蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.3，最后加蒸餾水定容至1L即可。保存存于室溫或4℃冰箱中。

2）0.8%正常熔點(diǎn)凝膠（PBS配制）

3）0.6％低熔點(diǎn)凝膠（PBS配制）

4）毛玻璃片5）蓋玻片

6）堿性裂解液（2.5mol/LNaCl;100mmol/LNa2EDTA;10mmol/LTris;1%肌氨酸鈉），臨用前加10％DNMSO，1％TritonX-100

7）電泳緩沖液（1mmol/LNa2EDTA;300mmol/LNaOH；Tris.Cl，pH7.5）

8）EB（2ug/ml）

步驟：

1.制備第一層膠：100ml0.8％正常熔點(diǎn)膠，加蓋蓋玻片，4℃固化10min；

2.制備第二層膠：輕輕地去除蓋玻片，在第一層膠上滴加75ul含1×10000個(gè)細(xì)胞的0.6％低熔點(diǎn)膠（cell與凝膠比例為1：5），加蓋蓋玻片，4℃固化10min；

3.裂解：去掉蓋玻片，將凝膠浸入冰冷的堿性裂解液內(nèi)（臨用前加10％DMAO，1％TritonX-100），4℃裂解1h；

4.取出玻片，用PBS緩沖液漂洗3次后置于水平電泳槽內(nèi)，加入pH13的電泳緩沖液（沒(méi)過(guò)玻片2-3min），放置20min（黑閉）。

5.電泳：電壓20V，300mA，30min

6.取出玻片，用PBS或Tris.Cl，pH7.5漂洗3次，每次3min；或雙蒸水漂洗2次，每次5～15min，1.2.5改良彗星試驗(yàn)操作步驟為節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，本研究將鋪三層膠法改為鋪一層膠法，同時(shí)在中和及染色等步驟進(jìn)行了改良，具體操作如下:將已染毒的淋巴細(xì)胞懸液與40℃的1%低溶點(diǎn)\o"醫(yī)學(xué)百科：瓊脂"瓊脂糖等濃度混勻后，取70μl混合液直接滴加在磨毛玻片上，加蓋玻片，4℃冷凝，20min后揭蓋片;4℃于堿性裂解液中裂解1h;解旋20min;4℃電泳（25V，300mA）30min;中和5min;加碘化丙啶，暗處染色10min，加蓋片;于瑩光\o"醫(yī)學(xué)百科：顯微鏡"顯微鏡下鏡檢，照像。四、操作步驟1.各種細(xì)胞用冰冷的PBS洗一次，離心收集，用PBS重懸，密度為1×104-5個(gè)/ml。2.鋪膠：下述各濃度瓊脂糖凝膠均用PBS配制。3.第1層凝膠的制備：將加熱熔解的正常熔點(diǎn)瓊脂糖(NMA)，冷至45-60℃，取適量鋪于載玻片CometSlide上，再置4℃下10min使NMA凝固。也可以先鋪膠，晾干后無(wú)塵存放，14.第2層凝膠的制備：低熔點(diǎn)瓊脂糖LMA在60-70℃水浴加熱至少20min使之完全溶化，冷至37℃（可以放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中或水浴箱冷卻至37℃，低熔點(diǎn)瓊脂糖LMA在37℃可維持3小時(shí)）。將20μL細(xì)胞（約104個(gè)）和75μL的LMA混合均勻。然后，迅速將適量含細(xì)胞的LMA滴到第1層瓊脂糖上，立即蓋上另一干凈蓋玻片，置4℃10min使第25.第3層凝膠的鋪制：:第2層LMA凝固后，在室溫下小心移去蓋玻片，重復(fù)第二層的步驟。（此步可以不作，一般鋪一層細(xì)胞就足夠）6.細(xì)胞裂解：移去蓋玻片，將玻片置于平皿中，輕輕加入預(yù)冷的新鮮配置的細(xì)胞裂解混合液（配制見(jiàn)試劑使用說(shuō)明的1，2）。4℃下裂解1-3h。取出載玻片用蒸餾水漂洗2次，要求動(dòng)作輕柔，以免瓊脂糖脫落。7.DNA堿解旋：將載玻片置于水平電泳槽。倒入新配制的電泳緩沖液約覆過(guò)載玻片膠面0.25cm左右，室溫放置20min，以便使DNA在堿性條件下解螺旋和產(chǎn)生堿易變性區(qū)段，使DNA斷鏈在電場(chǎng)中易于遷移。8.細(xì)胞電泳：電壓15-25V，電壓、電流可用改變緩沖液面高低來(lái)調(diào)節(jié)，電泳時(shí)間為10-20min。建議預(yù)實(shí)驗(yàn)，摸索最佳的電壓、電流及時(shí)間。9.電泳后將載玻片置于平皿內(nèi)。加入蒸餾水，漂洗2次，每次5min，棄去蒸餾水，每載玻片加2-3滴染色劑，蓋上蓋玻片（也可以不蓋上），避光染色10min。蓋上蓋玻片的目的是可以隔日分析，或便于操作。10.觀察、拍照和分析：熒光顯微鏡515-560nm（綠光）波長(zhǎng)的激發(fā)光，可清楚地觀察到核DNA和遷移的DNA(即慧星尾)。色澤和圖像十分精美，每個(gè)樣本隨機(jī)選擇20-100個(gè)細(xì)胞，圖片保存后，用相應(yīng)的軟件分析結(jié)果。。單細(xì)胞凝膠電泳（彗星實(shí)驗(yàn)）操作步驟1.各種細(xì)胞用冰冷的PBS洗1～2次，離心收集，用PBS0.3ml重懸，密度為1×105-6個(gè)/ml。

2.鋪膠：下述各濃度瓊脂糖凝膠均用PBS配制。3.第1層凝膠的制備：用微波爐加熱溶解正常熔點(diǎn)瓊脂糖(NMA)，再冷至45～60℃，取適量（100μL～1ml）鋪于載玻片上，立即蓋上干凈蓋玻片，再置4℃下至少30min使NMA凝固。也可以先鋪膠，晾干后無(wú)塵存放，1周內(nèi)使用。

4.第2層凝膠的制備:低熔點(diǎn)瓊脂糖LMA在微波爐中加熱使之完全溶化，冷至37℃（可以放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中或水浴箱冷卻至37℃，低熔點(diǎn)瓊脂糖LMA在37℃可維持3小時(shí)）。移去蓋玻片，將20μL細(xì)胞懸液和75μL的LMA混合均勻,然后，迅速將適量含細(xì)胞的LMA滴到第1層瓊脂糖上，立即蓋上干凈蓋玻片，置4℃30min使第2層LMA凝固。注意，使用蓋玻片的目的是使瓊脂糖平整，顯微鏡下方便觀察。

5.細(xì)胞裂解：移去蓋玻片，將載玻片置于平皿中，輕輕加入預(yù)冷的新鮮配置的細(xì)胞裂解混合液(PH10.0)。4℃下裂解1～3h或過(guò)夜。取出載玻片用蒸餾水漂洗2次，要求動(dòng)作輕柔，以免瓊脂糖脫落。

6.DNA堿解旋：將載玻片置于水平電泳槽正極端，并列放置，不留空隙。倒入新配制的電泳緩沖液約覆過(guò)載玻片膠面0.25cm左右，室溫放置20～40min，以便使DNA在堿性條件下解螺旋和產(chǎn)生堿易變性區(qū)段，使DNA斷鏈在電場(chǎng)中易于遷移。

7.細(xì)胞電泳：穩(wěn)壓25V，穩(wěn)流300ｍＡ，電壓、電流可用改變緩沖液面高低來(lái)調(diào)節(jié)，電泳時(shí)間為20～30min。

8.電泳后將載玻片置于平皿內(nèi)，緩緩沿壁加入0.4mmol/LTris-HCl(pH7.5)緩沖液或雙蒸水，漂洗2次，每次5～15min，棄去Tris-HCl或雙蒸水，使用PBS洗干凈，并用濾紙吸干水分。（再緩緩加入無(wú)水乙醇將凝膠浸埋脫水10min～1h之后,吸去乙醇,自然涼干或室溫下過(guò)夜。）

9．染色：每張載玻片加2～3滴染色劑（常用30g/l溴化乙錠溶液染色），蓋上蓋玻片（也可以不蓋上），避光染色20min。染色時(shí)應(yīng)戴手套。蓋上蓋玻片的目的是可以隔日分析，或便于操作。

影響因素1．瓊脂糖凝膠薄板的制備：該實(shí)驗(yàn)需要制備兩層瓊脂糖凝膠薄板，應(yīng)注意瓊脂糖的濃度、制備時(shí)間和溫度。第1層是緊貼冰凍玻片砂面的1%正常凝點(diǎn)(42±2)℃的瓊脂糖凝膠，吸取85μl制成面積為18mm×18mm，厚度為0.25mm的凝膠。然后置4℃存放約20分鐘，如時(shí)間過(guò)短，不能得到“老化”的凝膠與玻片粘合不緊,容易在液體浸泡處理和電泳過(guò)程中自然脫落，造成實(shí)驗(yàn)失??；反之，如果放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，凝膠極易干裂而脫落。第2層凝膠是1%低凝點(diǎn)(26±2)℃瓊脂糖液，與細(xì)胞混合時(shí)瓊脂糖液的溫度30～372．細(xì)胞數(shù)和實(shí)驗(yàn)溫度的影響：（1）實(shí)驗(yàn)細(xì)胞數(shù)應(yīng)調(diào)至約3.0×105，如果細(xì)胞數(shù)過(guò)低，一張片子中細(xì)胞數(shù)太少，很難完成100個(gè)彗星計(jì)數(shù)分析；反之細(xì)胞數(shù)過(guò)高，片中細(xì)胞過(guò)密，位于不同層面的細(xì)胞相互重疊，難以分析彗星DNA損傷。(2)實(shí)驗(yàn)溫度的控制。樣品應(yīng)置4℃3.堿化處理及電泳的條件:凝膠內(nèi)的細(xì)胞需在堿性(pH值10)環(huán)境下進(jìn)行處理，其作用一是去除細(xì)胞蛋白質(zhì)，使DNA暴露出來(lái)；其次是堿化處理使DNA緊密螺旋結(jié)構(gòu)解旋，DNA損傷片斷及其極性端暴露出來(lái)［3］。電泳條件：電壓或電流過(guò)大，嚴(yán)重受損傷的細(xì)胞可能出現(xiàn)的拖尾過(guò)長(zhǎng)，彗星消失而影響結(jié)果，其次是正常的細(xì)胞可能因電壓或電流過(guò)大而形成少許拖尾的假陽(yáng)性結(jié)果。反之，電壓或電流過(guò)小，受損傷的細(xì)胞不會(huì)出現(xiàn)拖尾，而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。電泳的電壓多選用低電壓，一般在18～50v，在電泳過(guò)程中電泳液的溫度應(yīng)不超過(guò)15℃(應(yīng)在44.熒光染色及彗星圖象分析：(1)采用DAPI熒光劑染色，質(zhì)量濃度在1～5μg/ml，用量為10μl。染色15分鐘后即可觀察，視野中明亮熒光的“彗星”被光照時(shí)間一般不易超過(guò)2分鐘，以免熒光劑快速衰退而不宜繼續(xù)觀察和拍照。(2)彗星的圖像分析主要靠肉眼顯微鏡讀片，對(duì)DNA損傷程度標(biāo)準(zhǔn)的正確判斷是非常重要的。不同程度損傷可根據(jù)彗星的尾部與