.*;;飼用木聚糖酶的質(zhì)量分析

摘要本文通過(guò)模擬動(dòng)物攝食后胃腸道內(nèi)環(huán)境的條件，對(duì)不同廠(chǎng)家的木聚糖酶進(jìn)行耐酸和耐胃蛋白酶穩(wěn)性試驗(yàn)。結(jié)果表明：在pH4.0，40℃保溫2h后，不同的樣品酶活性變化較大，損失最少的為33.4%，最大的達(dá)98.2%；經(jīng)過(guò)pH4.0，每克木聚糖酶中添加的5000U酸性蛋白酶，40℃保溫2h后，木聚糖酶的活性進(jìn)一步降低，但損失低于耐酸試驗(yàn)對(duì)酶活的影響。

關(guān)鍵詞木聚糖酶耐酸性酸性蛋白酶穩(wěn)定性近半年來(lái)，玉米價(jià)格一直堅(jiān)挺，有些地區(qū)甚至超過(guò)麥類(lèi)作物的價(jià)格。我國(guó)是小麥、大麥等麥類(lèi)作物的主產(chǎn)國(guó)之一，并且麥類(lèi)作物的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量相對(duì)于玉米有一定的優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越多的廠(chǎng)家把麥類(lèi)及其副產(chǎn)品應(yīng)用到畜禽飼料中，以減輕能量飼料資源緊張的壓力，降低飼料成本。大量研究表明，在含有麥類(lèi)作物的飼料中添加木聚糖酶可以有效的提高飼料消化吸收利用率，提高飼料轉(zhuǎn)化率。

隨著木聚糖酶需求量的增加，不同品牌的木聚糖酶紛紛進(jìn)入市場(chǎng)，其品質(zhì)也越來(lái)越受到飼料界人士的關(guān)注。聶國(guó)興等（2002、2004）研究底物濃度、DNS量和不同浸提方案對(duì)飼用木聚糖酶活性的影響；何為（2004）研究了在不同溫度、pH值對(duì)木聚糖酶活性的影響。關(guān)于飼料中的礦物質(zhì)和制粒過(guò)程對(duì)酶活性的影響也有一些相關(guān)報(bào)道，黃春紅等（2004），趙玉蓉等（2005）進(jìn)行了金屬離子對(duì)木聚糖酶活性影響的研究；付生慧（2005）于木聚糖酶在制粒工藝中熱穩(wěn)定性的研究等。但目前還未見(jiàn)有關(guān)模擬動(dòng)物胃腸道，對(duì)木聚糖酶進(jìn)行耐酸性和耐胃蛋白酶穩(wěn)定性的報(bào)道。木聚糖酶的發(fā)酵來(lái)源復(fù)雜，酶特性差異較大。本試驗(yàn)通過(guò)體外模擬攝食后動(dòng)物的胃腸道內(nèi)環(huán)境，對(duì)木聚糖酶樣品進(jìn)行耐酸性和酸性蛋白酶處理，測(cè)定其對(duì)酶活的影響，分析其產(chǎn)品品質(zhì)，為飼料廠(chǎng)家選擇合適的木聚糖酶提供理論依據(jù)。1材料與方法

1.1采樣

木聚糖酶從市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)，采集后立即干燥并保存于4℃冰箱中。

1.2酶活測(cè)定方法

采用3,5－二硝基水楊酸法（DNS法）測(cè)定。在37℃、pH值5.5的條件下，每分鐘從濃度為5mg/mL的木聚糖溶液中降解釋放1μmol還原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.3主要儀器和試劑

精密pH計(jì)（0.01），自動(dòng)分析電子天（0.0001g），分光光度計(jì)。

燕麥木聚糖、木糖均購(gòu)于Sigma公司，乙酸鈉、氫氧化鈉等試劑均為分析純。

1.4主要試劑的配制

1.4.1濃度0.1mol/l，pH5.5的乙酸—乙酸鈉緩沖溶液準(zhǔn)確稱(chēng)取三水乙酸鈉23.14g，加入冰乙酸1.70ml，然后加水溶解，定容至2000ml，，用0.1mol/l的乙酸溶液或0.1mol/l的乙酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至5.5。

1.4.2濃度為10.0g/l的燕麥木聚糖溶液準(zhǔn)確稱(chēng)取木聚糖1.00g，加入0.32g氫氧化鈉，再加入90ml水，磁力攪拌，同時(shí)緩慢加熱，直至木聚糖完全溶解。然后停止加熱，繼續(xù)攪拌30min，加入0.5ml冰乙酸，繼續(xù)磁力攪拌，用0.1mol/l的乙酸溶液或0.1mol/l的乙酸鈉溶液的pH值調(diào)節(jié)至5.5，然后再用乙酸－乙酸鈉緩沖溶液定容至100ml。

1.4.3DNS試劑稱(chēng)取3,5—二硝基水楊酸3.15g，加水500ml，攪拌5s，水浴至45℃。然后逐步加入100ml濃度為200g/L的氫氧化鈉溶液，同時(shí)不斷攪拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氫氧化鈉過(guò)程中，溶液溫度不要超過(guò)48℃）。再逐步加入四水酒石酸鉀鈉91.0g、苯酚2.50g和無(wú)水亞硫酸鈉2.50g，繼續(xù)45℃水浴加熱，同時(shí)補(bǔ)加水300ml，不斷攪拌，直到加入的物質(zhì)完全溶解。停止加熱，冷卻至室溫后，用蒸餾水定容至1000ml。用燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾。取濾液，儲(chǔ)存在棕色瓶中，避光保存，室溫下存放7天后使用。

1.5木聚糖酶樣品的處理

每份酶樣稱(chēng)取1g左右，精確至0.001g，然后加入40ml乙酸－乙酸鈉緩沖液，磁力攪拌30min，再用緩沖液定容至100ml，在4℃條件下避光保存24h。然后用離心機(jī)3000rmp/min離心10min，取上清液60mL，分成A、B、C三等份。A用乙酸溶液將pH值調(diào)至4.0；B用乙酸溶液將pH值調(diào)至4.0，再加入酸性蛋白酶，使每克木聚糖酶中酸性蛋白酶含量達(dá)到5000U。然后把A、B放在水浴鍋中40℃保溫振蕩兩h。反應(yīng)結(jié)束后，立即定容至50mL，然后用乙酸－乙酸鈉緩沖液稀釋成幾個(gè)梯度，進(jìn)行測(cè)定，選擇稀釋的木聚糖酶活力在0.04～0.08U/mL之間的測(cè)定值。

1.6酶活測(cè)定

1.6.1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制準(zhǔn)確吸取乙酸－乙酸鈉緩沖溶液4.0ml，加入DNS試劑5.0ml，沸水浴加熱5min。用自來(lái)水冷卻至室溫，用蒸餾水定容至25.0ml，制成標(biāo)準(zhǔn)空白樣。分別準(zhǔn)確吸取10.0mg/ml木糖溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00和7.00ml，分別用乙酸－乙酸鈉緩沖溶液定容至100ml，配制成濃度為0.10～0.70mg/ml木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確吸取上述濃度系列的木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液各2.00ml，分別加入到刻度試管中，再分別加入2.0mL緩沖液和5.0mlDNS試劑。電磁振蕩3s，沸水浴加熱5min。然后用自來(lái)水冷卻到室溫，再用蒸餾水定容至25ml。以標(biāo)準(zhǔn)空白樣為對(duì)照調(diào)零，在540nm處測(cè)定吸光度OD值。以木糖濃度為Y軸、吸光度OD值為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.6.2主要測(cè)定步驟①將備用的木聚糖溶液和適當(dāng)稀釋的酶液在37℃水浴鍋中預(yù)熱5min；②吸取2.00ml預(yù)熱的酶液，加入到刻度試管中，再加入5mlDNS試劑，電磁振蕩3s。然后加入2.0ml預(yù)熱的木聚糖溶液，37℃精確保溫10min，沸水浴加熱5min。用自來(lái)水冷卻至室溫，加水定容至25ml，電磁振蕩3s。以標(biāo)準(zhǔn)空白樣為空白對(duì)照，在540nm處測(cè)定吸光度AB；③吸取2.00ml預(yù)熱的酶液，加入到刻度試管中，再加入2.0ml預(yù)熱的木聚糖溶液，電磁振蕩3s，37℃精確保溫30min。加入5.0mlDNS試劑，電磁振蕩3s，以終止酶解反應(yīng)。沸水浴加熱5min，用自來(lái)水冷卻至室溫，加水定容至25ml，電磁振蕩3s。以標(biāo)準(zhǔn)空白樣為空白對(duì)照，在540nm處測(cè)定吸光度AE。

1.6.3酶活的計(jì)算

X=（公式中AB應(yīng)為AB）式中：X——木聚糖酶的活力，U/g；

AE——酶反應(yīng)液的吸光度；

AB——酶空白樣的吸光度；

K——標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率；

CO——標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的截距；

M——木糖的摩爾質(zhì)量M（C5H10O5）=150.2g/mol；

t——酶解反應(yīng)時(shí)間，min；

m——稱(chēng)取木聚糖酶的重量，g；2結(jié)果和分析

經(jīng)過(guò)不同處理后木聚糖酶的活性見(jiàn)表1。由表1可知，木聚糖酶在pH4.0，40℃保溫2h后，酶活都有較大的損失，損失最少的是酶B，為33.4%，最大的是酶C，達(dá)到98.2%。經(jīng)過(guò)pH4.0，每克木聚糖酶中添加的酸性蛋白酶為5000U，40℃保溫2h后，木聚糖酶的損失都在50％以上，酸性蛋白酶對(duì)木聚糖酶蛋白都表現(xiàn)出一定的破壞作用。表1經(jīng)過(guò)不同處理后的木聚糖酶的酶活（U）樣品對(duì)照酸處理酸和酸性蛋白酶處理酶1823131701257酶2775351663745酶310753193206酶418534395299896693討論

3.1測(cè)定溫度的選擇

目前大多數(shù)廠(chǎng)家提供的檢測(cè)方法是根據(jù)木聚糖酶的特性而定，一般選擇木聚糖酶酶活和穩(wěn)定性都較佳時(shí)的溫度如50℃和55℃。在飼料工業(yè)中，設(shè)置這樣的測(cè)定溫度并沒(méi)有實(shí)際意義，因?yàn)楹宛B(yǎng)殖動(dòng)物的體溫不相符；但是溫度又對(duì)酶蛋白活性的影響非常大，陸文清、李德發(fā)（2005）提出飼料酶的活力測(cè)定溫度應(yīng)都選擇在37~40℃，本試驗(yàn)中測(cè)定選擇的溫度為37℃。

3.2木聚糖酶的耐酸性

木聚糖酶用途較多，如在造紙、飼料和食品中都被廣泛應(yīng)用，但不同的應(yīng)用方面對(duì)酶活特性和pH值范圍的要求也不同。造紙要求偏堿性，飼料中要求偏酸性和較好的耐酸穩(wěn)定性。因?yàn)槭趁釉谖负湍c道的停留時(shí)間較長(zhǎng)，特別在小腸的停留時(shí)間最長(zhǎng)，并且小腸是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要部位，所以木聚糖酶在小腸中保持的酶活越高越好，這就要求木聚糖酶要具有較強(qiáng)的耐酸性。陸文清、李德發(fā)（2005）指出飼料木聚糖酶的耐酸穩(wěn)定性是考察其品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)。楊會(huì)濤（2006）研究表明在pH5～10，40℃保溫60min對(duì)木聚糖酶活性的影響較小，但在pH4.0，40℃保溫60min酶活損失在50％以上。本次試驗(yàn)中各樣品的耐酸差異性較大，特別是酶C，雖然在對(duì)照測(cè)定中表現(xiàn)較好的酶活，但在飼料中卻沒(méi)有應(yīng)用價(jià)值，只能增加成本。

3.3木聚糖酶的耐胃蛋白酶穩(wěn)定性

木聚糖酶是蛋白質(zhì)，并且只有具有完整的立體構(gòu)型時(shí)才能表現(xiàn)其高效的催化作用。胃蛋白酶在酸性條件中可以切割、分解蛋白質(zhì)。本試驗(yàn)中利用酸性蛋白酶代替胃蛋白酶，試驗(yàn)結(jié)果表明，木聚糖酶的活性降低。不過(guò)與pH值對(duì)木聚糖酶的影響相比，酸性蛋白酶的影響較小。