谷胱甘肽過氧化物酶在豬體內(nèi)的分布和動態(tài)變化,畜牧獸醫(yī)論文谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathioneperoxidase,EC1.11.1.9,簡稱GPx)是生物機體組織中存在的3種重要的抗氧化酶之一,也是一種重要的含硒酶,硒是該酶活性中心的構(gòu)成成分;它的生物學作用主要是去除脂質(zhì)氫過氧化物,并在過氧化氫酶含量很少或H2O2產(chǎn)量很低的組織中,代替過氧化氫酶去除H2O2發(fā)揮抗氧化作用.當前研究表示清楚GPx具有去除氫過氧化物、阻止癌癥啟動ROS對機體DNA的損傷,抑制癌細胞的擴散、轉(zhuǎn)移和再生;保衛(wèi)線粒體ATP免受氧化應激的影響,抑制線粒體凋亡的發(fā)生以及對神經(jīng)退行性疾病具有一定的神經(jīng)保衛(wèi)作用.因而講,GPx是一種有發(fā)展?jié)摿Φ尼t(yī)藥用酶和動物飼料添加劑.正常情況下,GPx的活力保持在一個相對穩(wěn)定的狀態(tài),但在病理情況下,當體內(nèi)活性氧發(fā)生堆積時,GPx必然會與其他的抗氧化酶協(xié)同介入調(diào)節(jié)經(jīng)過,因而它的活力也會隨著這種調(diào)節(jié)經(jīng)過發(fā)生動態(tài)變化.GPx對于有些疾病,如鼠的中毒性肝炎,該酶的活力會伴隨著疾病的發(fā)生而上升;而另一些疾病,如阿爾茨海默病,該酶的活力則會伴隨著疾病的發(fā)生而下降;因而以為該酶可作為某些疾病的輔助診斷指標.除此之外,血漿和紅細胞的GPx活力也會隨著年齡的增長而發(fā)生變化.也有研究發(fā)現(xiàn),同一動物不同性別間GPx的活力也存在差異.本研究通過對不同豬種、不同性別、不同組織及豬生長發(fā)育的不同階段、不同健康狀況下GPx的活力進行研究.了解GPx在豬體內(nèi)的分布和動態(tài)變化,為以該酶的活力水平來評定豬的健康狀態(tài),并作為某些豬病的輔助診斷治療指標提供參考,同時確定富含GPx的組織和采集時期,為選擇GPx含量最豐富的原材料,進一步開發(fā)應用該酶提供根據(jù).1、材料與方式方法1.1試驗動物26、30、90、150日齡藍塘豬與長白豬(均為公豬),每品種每齡期各5頭,共40頭豬,由東莞板嶺豬場提供.90日齡杜大長(杜洛克、大白、長白)三元雜健康公、母豬各7頭,共14頭豬,由珠海市那洲豬場提供.90日齡杜大長(杜洛克、大白、長白)三元雜患副嗜血桿菌病1周的豬(應用PCR進行鑒定診斷),公、母各11頭,共22頭豬,由珠海市那洲豬場提供.1.2主要試劑谷胱甘肽(GSH),Amresco公司產(chǎn)品;5,5-二硫代對二硝基苯甲酸(DTNB),Sigma公司產(chǎn)品;牛血清白蛋白,Fluka公司產(chǎn)品;考馬斯亮藍G250,USB公司產(chǎn)品;肝素,廣州齊云生物公司產(chǎn)品;其他試劑均為市售分析純.1.3試驗方式方法1.3.1樣品制備血樣采集:分別選取26(斷奶前)、30、90、150日齡的長白和藍塘公豬各5頭(同一品種體質(zhì)量間無差異,健康狀態(tài)無差異)頸靜脈取血2mL,參加事先用肝素處理過的離心管中,置于冰箱中冷藏待用,在1d內(nèi)測定酶活力.測定前取10L全血加到1mL雙蒸水中,充分振搖,使之全部溶血成為1∶100溶血液即為待測樣品.取90日齡杜大長三元雜健康及患病公、母豬各11頭,頸靜脈采血.血樣處理方式方法與前述一樣.組織樣品采集:分別取150日齡的長白豬和藍塘豬公豬各5頭(同一品種間體質(zhì)量無差異,健康狀態(tài)無差異),屠宰后,立即采集腎、脾、肺、肝、心、胰、胃、腦、肌肉以及腸(華而不實腸分為空腸、結(jié)腸、回腸、十二指腸、盲腸)等組織采集鮮物樣品約5g,用20mmol/LpH7.2的磷酸緩沖液沖洗3次后,包裝好,置于-70℃的冰箱中冷藏備用,在3d內(nèi)測定樣品的酶活力.測定前取出樣品,將組織樣品用4℃、質(zhì)量分數(shù)為0.86%的生理鹽水漂洗,除去血液,濾紙拭干,準確稱取0.4g,放入10mL的小燒杯內(nèi).用量筒量預冷的勻漿介質(zhì)(pH7.2,20mmol/L,內(nèi)含1mmol/LEDTANa2的磷酸緩沖液),勻漿介質(zhì)是組織質(zhì)量的9倍.用移液槍將總量2/3的勻漿介質(zhì)移入燒杯中,用眼科小剪盡快剪碎組織塊(在冰浴條件下進行),然后將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中,再用剩余的1/3勻漿介質(zhì)沖洗殘存余留在小燒杯中的碎組織一起倒入玻璃勻漿管中進行勻漿,上下轉(zhuǎn)動研磨數(shù)十次,充分磨碎,得到質(zhì)量分數(shù)為10%的組織勻漿液,以4000r/min離心10min,取上清液0.5mL參加1.5mL勻漿介質(zhì)混勻以后測定酶活力.1.3.2豬副嗜血桿菌病的診斷參照吳詩敏的方式方法通過PCR進行鑒定診斷.1.3.3GPx活力的測定參照榮征星等和蒙秋鎖等的測定方式方法,并作適當改良.1.3.4蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測定按Bradford的方式方法,并以牛血清白蛋白為標準蛋白質(zhì).1.3.5數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析采用SPSS17.0進行數(shù)據(jù)分析.所有數(shù)據(jù)采用平均值標準誤表示.2種數(shù)據(jù)間的比擬采用T-tests,多組數(shù)據(jù)比擬采用Dun-cans新復極差法.2、結(jié)果與分析2.1豬不同日齡GPx活力的動態(tài)變化分別對26~150日齡(華而不實:26日齡是斷奶前的仔豬;150日齡為即將出欄豬)的長白豬與藍塘豬頸靜脈采血,測定全血中GPx的活力,結(jié)果見圖1.圖1表示清楚,26(斷奶前)~150日齡這段時期,長白豬和藍塘豬全血中的GPx活力隨著齡期的增加而緩慢上升.長白豬26~150日齡GPx活力由平均1.11U/L增至1.30U/L,藍塘豬GPx活力由1.20U/L增至1.38U/L,都在150日齡時活力達最大,但除長白豬在150日齡與其他日齡GPx活力有顯著差異外(P0.05),其余日齡GPx活力差異不顯著(P﹥0.05).對斷奶前(26日齡)與斷奶后(30日齡)仔豬全血GPx活力進行比擬,藍塘豬斷奶前后的GPx活力沒有顯著的差異(P﹥0.05);長白豬斷奶前后的GPx活力亦沒有顯著差異(P﹥0.05).可能斷奶應激對全血GPx活力不會造成影響,可以能GPx活力斷奶后能迅速恢復到原來的水平.2.2豬種間GPx活力的比擬由圖1可見,對藍塘豬和長白豬26、30、90、150日齡GPx活力進行比擬,藍塘豬各日齡的平均酶活力均高于長白豬的平均酶活力.在26日齡和150日齡,長白豬和藍塘豬全血中的GPx活力差異不顯著(P﹥0.05),而在30日齡和90日齡GPx活力存在顯著差異(P0.05).可見不同豬種間酶活力存在差異.2.3公、母豬GPx活力的比擬由圖2可見,90日齡杜大長公豬的平均GPx活力比母豬的高了8.93%.公、母豬間的GPx活力存在極顯著差異(P0.01).2.4不同健康狀況GPx活力的比擬首先對豬副嗜血桿菌病進行診斷.分別測定了公、母各11頭豬,通過PCR在822bp左右處出現(xiàn)目的條帶,其大小與陽性對照一致(圖3),結(jié)合臨床異常感覺和狀態(tài),講明所采樣的豬患有副嗜血桿菌.測定了華而不實患病豬(公、母各7頭)和健康豬(公、母各7頭)全血GPx活力,結(jié)果見圖4.90日齡患病公豬GPx活力比健康公豬的低16.39%;患病母豬GPx活力比健康母豬的低了20.83%(圖4).無論是公豬或母豬,患豬副嗜血桿菌病1周的豬全血中的酶活力會顯著降低(P0.01,圖4).2.5豬不同組織GPx活力的比擬。從表1對長白豬和藍塘豬各組織GPx活力的比擬發(fā)現(xiàn),GPx活力最高的組織是腎,活力最低的組織是盲腸,GPx活力大小的排列順序依次是腎脾肺肝回腸心胰胃、腦、肌肉、空腸、十二指腸、直腸、結(jié)腸、盲腸等組織.華而不實腎GPx活力與肺、肝、回腸、心、胰、胃等組織間的酶活力存在顯著差異(P0.05),脾GPx活力與肝、回腸、心、胰、胃等組織間的GPx活力存在顯著差異(P0.05),肺GPx活力與腎、回腸、心、胰、胃等組織間的GPx活力存在顯著差異(P0.05),肝GPx活力與腎、脾、心、胰、胃等組織間的GPx活力存在顯著差異(P0.05),回腸GPx活力與腎、脾、肺、胰、胃等組織間的GPx活力存在顯著差異(P0.05),心GPx活力與腎、脾、肺、肝、胃等組織間的GPx活力存在顯著差異(P0.05),胰GPx活力與所測定各組織(除長白豬心的GPx活力外)的GPx活力存在顯著差異(P0.05),胃GPx活力與腎、脾、肺、肝、回腸、心、胰組織間的GPx活力存在顯著差異(P0.05);胃、腦、肌肉、空腸、十二指腸、直腸、結(jié)腸、盲腸等組織間活力差異不顯著(P0.05).對藍塘豬和長白豬各腸段GPx活力比擬發(fā)現(xiàn),回腸的GPx活力顯著高于其他腸段(P0.05),與活力相對較高的肝GPx活力相比,沒有顯著性差異(P0.05)(表1).對藍塘豬和長白豬各組織的比活力分別進行比擬發(fā)現(xiàn),GPx比活力較高的組織有直腸、胃、回腸、肺、腎、脾、肝等;且在長白豬中,這些組織間GPx比活力差異不顯著(P0.05)。3、討論與結(jié)論GPx的活力會隨著動物年齡的增長而發(fā)生變化,一般以為GPx的活力在青壯年期活力較高,到了老年時期該酶活力會顯著下降.Cejkov等測定了1月齡至5歲的兔角膜的GPx活力,發(fā)現(xiàn)1月齡的兔角膜活力很低,4~9.5月齡活力較高,2~2.75歲的GPx活力最高,3~5歲活力又顯著降低.本研究2個品種的豬在斷乳前至上市的這段時期,全血GPx的活力保持在一個相對穩(wěn)定上升的水平.本研究對健康仔豬斷奶前1d及斷奶后第4天GPx活力進行比擬,無顯著差異(P0.05).這種結(jié)果存在兩種可能,一是斷奶應激對GPx活力不一定會造成影響;二是經(jīng)過4d時間GPx活力已經(jīng)迅速恢復至原水平.有研究發(fā)現(xiàn),熱應激反響短期內(nèi)會造成鼠腦線粒體GPx活力的明顯下降,但48h后能恢復到原有水平.藍塘豬是我們國家優(yōu)良的地方品種,具有肉質(zhì)鮮美,遺傳性能穩(wěn)定,溫馴易管,適應性強等特點.長白豬原名德瑞斯豬,原產(chǎn)于丹麥,具有產(chǎn)仔數(shù)較多,生長發(fā)育快,飼料轉(zhuǎn)化率高,瘦肉率高,但抗逆性差,對飼料營養(yǎng)要求高等特點.測定這兩品種豬全血GPx活力,結(jié)果表示清楚藍塘豬GPx活力高于長白豬的活力,尤其在30日齡和90日齡顯著高于長白豬全血中GPx的活力(P0.05).藍塘豬抗病力、適應能力強于長白豬,這可能與該酶能加強和調(diào)節(jié)機體的免疫系統(tǒng)功能有關(guān).Habif等測定了12至90歲的男女血液中GPx活力,得出性別對GPx活力沒有影響的結(jié)論,而Rush等的研究卻以為,女性血漿中的GPx活力顯著高于男性.本研究分別測定了7頭公、母豬的GPx活力,結(jié)果則表示清楚公豬的GPx活力極顯著地高于母豬的活力(P0.01).與上述兩位學者的研究結(jié)果不一致,這可能與采樣的是留種公豬(一般都選擇愈加健康的公豬留種)有關(guān);但還有待于擴大檢測樣品的數(shù)據(jù)來進一步確認這一結(jié)果.在人醫(yī)臨床工作中發(fā)現(xiàn)很多疾病的患者體內(nèi)均存在GPx活性和含量的改變,這種變化較為復雜,但通過其變化能夠作為斷定一些疾病的輔助指標.如鼠的中毒性肝炎,該酶的活力會伴隨著疾病的發(fā)生而上升;阿爾茨海默病,該酶的活力則會伴隨著疾病的發(fā)生而下降.本研究以患副豬嗜血桿菌病1周的病豬為檢測對象,以健康豬為對照,檢測到發(fā)病1周病豬比健康豬的酶活力顯著降低(P0.05).豬副嗜血桿菌病癥中有豬的心包炎、漿膜炎、肺炎等.豬在斷奶至上巿這段時間GPx活力保持在一個相對較平穩(wěn)的狀態(tài),假如豬全血GPx活力忽然升高或者降低了,講明豬可能是處在某種不健康的狀態(tài).GPx在不同組織的活性是不同的,有研究結(jié)果表示清楚肝臟中GPx活性最高,心和肺次之,肌肉中最低.本研究測定了長白豬和藍塘豬的心、肝、肺、腸、腦、肌肉等10個組織,發(fā)現(xiàn)GPx活力高的組織主要有腎、脾、肺、肝、回腸、心臟和胰等,而胃、腦、肌肉及其他腸段GPx活力較低,這可能與自由基產(chǎn)生部位主要在腎、肺、肝等器官有關(guān).對各腸段GPx活力測定表示清楚,除了回腸的活力明顯較高外,其他腸段活力都較低(P0.05).分離純化GPx應選擇酶活力高的組織進行提取.除此之外,對各組