緒論發(fā)酵工程（fermentationengineering）直接利用微生物的機(jī)能將物料加工以提供產(chǎn)品的過程，又稱微生物工程。是研究利用微生物的工業(yè)，即微生物參與的工藝過程。一、生物工藝發(fā)展簡史

1.傳統(tǒng)生物技術(shù)的追溯

SaucePickledvegetablesCheeseDoughfermentationFermentation最初來自拉丁語“發(fā)泡”（fervere）

發(fā)酵現(xiàn)象的早期認(rèn)識1680年荷蘭leenvenhoek制成顯微鏡───微生物(microbe)的存在。1857年法國巴斯德(Pasteur)證明了酒精是由酵母菌發(fā)酵引起的。1897年德國畢西納（Buchner）發(fā)現(xiàn)磨碎的酵母仍使糖發(fā)酵形成酒精───酶。2.初期出現(xiàn)的生物技術(shù)產(chǎn)品

acetone-butanollaticacidalcoholbreadyeastcitricacidamylaseandprotease3.近代生物技術(shù)產(chǎn)品

20世紀(jì)40年代，以抗生素的生產(chǎn)為標(biāo)志Surfacecultures

Submergedfermentationantibioticaminoacidenzymepreparationorganicacid發(fā)酵現(xiàn)象→釀造食品工業(yè)→非食品工業(yè)→青霉素→抗菌素發(fā)酵工業(yè)→氨基酸,核酸發(fā)酵（代謝控制發(fā)酵）→基因工程菌→動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)→植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)→藻類細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)發(fā)酵工程的發(fā)展歷史

工業(yè)發(fā)酵發(fā)展簡史時(shí)間發(fā)酵階段主要產(chǎn)品主要技術(shù)-1900天然發(fā)酵酒醋干酪酵母天然分批1905-純培養(yǎng)酒精丙酮丁醇密閉純培養(yǎng)1940-通氣攪拌抗生素有機(jī)酸通氣攪拌酶維生素分批或連續(xù)1957-代謝控制氨基酸核苷酸選育缺陷菌株1960-開拓原料單細(xì)胞蛋白連續(xù)發(fā)酵1979-基因工程菌胰島素干擾素DNA重組純培養(yǎng):第一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)通氣攪拌:第二個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)代謝控制：第三個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)基因工程菌：第四個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)

二、生物反應(yīng)的過程

cellenzymebiocatalystmonitorsterlizedairproductbioreactorbyproductresiduesterilizing

mediumextract

發(fā)酵工程的概念和內(nèi)容

菌種選育自然界篩選、誘變育種、基因工程、細(xì)胞工程培養(yǎng)基配制根據(jù)培養(yǎng)基的配制原則制備，實(shí)踐中需多次試驗(yàn)配方滅菌殺滅雜菌擴(kuò)大培養(yǎng)和接種發(fā)酵過程（中心階段）檢測進(jìn)程，滿足營養(yǎng)需要；嚴(yán)格控制溫度、pH、溶氧、轉(zhuǎn)速等分離純化菌體：過濾、沉淀代謝產(chǎn)物：蒸餾、萃取、離子交換

四部分組成生物催化劑的制備原料預(yù)處理及培養(yǎng)基的制備生物反應(yīng)器及反應(yīng)條件的選擇厭氧：alcohol,beer,acetone,發(fā)酵方式butanol,lacticacid

好氧：aminoacid,antibiotic4.產(chǎn)品的分離與純化三、微生物工業(yè)產(chǎn)品的類型微生物菌體的發(fā)酵以獲得具有某種用途的菌體為目的的發(fā)酵工業(yè)。2.微生物酶發(fā)酵目前應(yīng)用的酶大多來自微生物發(fā)酵。3.微生物代謝產(chǎn)物發(fā)酵(1)初級代謝產(chǎn)物(primarymetabolite)

菌體生長繁殖所必需的，在對數(shù)生長期產(chǎn)生的物質(zhì)，如氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)等。(2)次級代謝產(chǎn)物(secondarymetabolite)

與菌體生長繁殖無明顯關(guān)系，是在菌體生長的穩(wěn)定期（靜止期）合成的具有特定功能的產(chǎn)物。如抗生素、生物堿、細(xì)菌毒素、植物生長因子、色素等。初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物的異同4.微生物的生物轉(zhuǎn)化利用微生物細(xì)胞的一種或多種酶，把一種化合物轉(zhuǎn)變成結(jié)構(gòu)相關(guān)的更有價(jià)值的產(chǎn)物。最顯著的特點(diǎn)是特異性強(qiáng)。5.微生物特殊機(jī)能的利用利用微生物消除環(huán)境污染、保持生態(tài)平衡等。

發(fā)酵工程的應(yīng)用由于微生物許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，使發(fā)酵工程在當(dāng)前能源、資源緊張，人口、糧食以及污染問題日益嚴(yán)重的情況下，發(fā)揮著重要的作用。醫(yī)藥工業(yè)：抗生素、維生素、人胰島素、乙肝疫苗、干擾素、透明質(zhì)酸等。2.食品工業(yè)：微生物蛋白、氨基酸、新糖原、飲料、酒類和一些食品添加劑等。3.能源工業(yè)：纖維素、半纖維素的轉(zhuǎn)化，利用微生物采油、產(chǎn)氫及微生物新能源等。4.化學(xué)工業(yè)：生產(chǎn)可降解的生物塑料、化工原料如乙醇、丙酮等、生物表面活性劑及生物凝集劑等。5.冶金工業(yè)：黃金開采和銅、鈾等金屬的浸提等。6.農(nóng)業(yè)、牧業(yè)：生物固氮、生物殺蟲劑、微生物農(nóng)藥、微生物飼料等。7.環(huán)境保護(hù)：微生物降解。（1）釀酒工業(yè)（啤酒、葡萄酒、白酒等）（2）

食品工業(yè)（醬、醬油、食醋、面包、酸乳等）（3）

有機(jī)溶劑發(fā)酵工業(yè)（酒精、丙酮、丁醇等）（4）

抗生素發(fā)酵工業(yè)（青霉素、鏈霉素、土霉素等）（5）

酸制劑發(fā)酵工業(yè)（檸檬酸、葡萄糖酸等）（6）

酶制劑發(fā)酵工業(yè)（淀粉酶、蛋白酶等）（7）

氨基酸發(fā)酵工業(yè)（谷氨酸、賴氨酸等）（8）

核苷酸類物質(zhì)發(fā)酵工業(yè)（肌苷酸、肌苷等）（9）

維生素發(fā)酵工業(yè)（維生素B2、維生素B12等）（10）生物活性物質(zhì)發(fā)酵工業(yè)（激素、赤霉素等）（11）微生物菌體蛋白發(fā)酵工業(yè)（酵母、單細(xì)胞蛋白等）（12）微生物環(huán)境凈化工業(yè)（利用微生物處理廢水、污水等）（13）生物能源工業(yè)（沼氣、纖維素等天然原料發(fā)酵生產(chǎn)酒精、乙烯等能源物質(zhì)）（14）微生物冶金工業(yè)（利用微生物探礦、冶金、石油脫硫等）

第一章菌種選育

第一節(jié)工業(yè)常用微生物及要求一、常見微生物

（一）細(xì)菌（bacteria）醋桿菌屬（Acetobacter）乳桿菌屬（Lactobacillus）芽孢桿菌屬（Bacillus）短桿菌屬（Brevibacterium）棒桿菌屬（Corynebacterium）（二）放線菌（actinomyces）最大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值在于產(chǎn)生多種抗生素（antibiotic）鏈霉菌（Streptomyces）小單孢菌屬（Micromonospora）

（三）霉菌（mould）

1.曲霉屬（Aspergillus）黑曲霉（A.niger）米曲霉（A.oryzae）黃曲霉（A.flavus）

2.青霉屬（Penicillum）桔青霉（P.citrinum）產(chǎn)生5’－磷酸二酯酶，降解核糖核酸為四個(gè)單核苷酸。3.根霉屬（Rhizopus

）米根霉（R.oryzae）華根霉（R.chinensis）4.紅曲霉屬（Monascus）（四）酵母（yeast）酵母屬（Saccharomyces）啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）2.假絲酵母屬（Candida）產(chǎn)朊假絲酵母（Candidautilis）3.畢赤酵母屬（Pichia）（五）其它微生物1.擔(dān)子菌（basidiomycetes）即菇類（mushroom）2.藻類（alga）幾種菌落

（六）噬菌體（phage）危害以細(xì)菌和放線菌為生產(chǎn)菌株的發(fā)酵工業(yè)。特點(diǎn)：1.體積比細(xì)菌小得多，可以通過細(xì)菌濾器。2.沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，由核酸和蛋白質(zhì)構(gòu)成。3.營專性活物寄生，即只能在特異性寄主細(xì)胞中增殖。烈性噬菌體

——引起寄主細(xì)胞迅速裂解。受感染的細(xì)菌稱敏感性細(xì)菌。溫和噬菌體

——隨寄主細(xì)胞的繁殖而繁殖。含溫和噬菌體的細(xì)菌稱溶原性細(xì)菌。吸附注入核酸合成核酸和蛋白質(zhì)釋放裝配

二、微生物工業(yè)對菌種的要求1.原料廉價(jià)，生長迅速，目的產(chǎn)物產(chǎn)量高。2.易控制培養(yǎng)條件，發(fā)酵周期較短。3.抗雜菌和噬菌體的能力強(qiáng)。4.不易變異和退化，不產(chǎn)生任何有害物質(zhì)和毒素。

第二節(jié)工業(yè)微生物菌種的選育一、自然選育（一）從自然界分離獲得菌種采樣增殖培養(yǎng)（富集培養(yǎng)enrichment）提供有利于所需菌株生長而不利于其它菌型生長的條件，即讓目的微生物在種群中占優(yōu)勢，使篩選變得可能。方法：（1）控制培養(yǎng)基成分（2）控制培養(yǎng)條件（3）抑制不需要的菌類3.純種分離（1）劃線法：簡單、快捷。（2）稀釋法：菌落單一均勻，適合分離具有蔓延性的微生物。固體培養(yǎng)基四區(qū)劃法接種法接種針先以火焰滅菌法滅菌

步驟一輕觸營養(yǎng)平板上無菌的瓊脂處冷卻

步驟二以接種針輕觸菌落，使接種針上沾有細(xì)菌。

步驟三更換一個(gè)新的無菌營養(yǎng)平板

步驟四將接種針上的細(xì)菌劃于一個(gè)新的營養(yǎng)平板上。此為第一菌區(qū)。步驟五重復(fù)第一步驟，將接種針以火焰滅菌法滅菌，然后輕觸瓊脂無菌處冷卻。步驟六由第五步驟的第一區(qū)中劃出第二區(qū)，如右上圖。步驟七重復(fù)第六以及第七步驟，由第七步驟的第二區(qū)中劃出第三區(qū)，如右上圖。

步驟八重復(fù)第六以及第七步驟，由第八步驟的第三區(qū)中劃出第四區(qū)，劃滿剩下的空間。完成后的營養(yǎng)平板，如右上圖。步驟九

在營養(yǎng)平板上貼好標(biāo)簽，標(biāo)示好接種日期、操作者姓名、菌種學(xué)名以及培養(yǎng)基名稱。步驟十固體培養(yǎng)基的稀釋涂抹接種法需要使用的儀器——震蕩機(jī)

吸取準(zhǔn)備好欲稀釋的菌液吸取充分均勻后的菌液

取含有9mL無菌水之試管，將試管口過火滅菌。將菌液置入，此時(shí)試管須做記號為第一次稀釋。將試管于震蕩機(jī)上，使菌液混合均勻取出試管中的第一次十倍稀釋菌液1mL，加入另一個(gè)新的含9mL無菌水的試管中。重復(fù)此步驟直至所需要的稀釋濃度。

從最后稀釋菌液中吸取0.1mL菌液，置入準(zhǔn)備好的無菌瓊脂內(nèi)。將三角玻璃棒浸于酒精中

將三角玻璃棒在火焰上燃燒（須注意勿使燃燒中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃燒）

使用玻璃棒將菌液均勻涂布開來，將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中隔天觀察菌落數(shù)目，再依照稀釋倍數(shù)推算出菌液濃度。

4.生產(chǎn)性能的測定一般采用兩步法：初篩：以量為主復(fù)篩：以質(zhì)為主（二）從自發(fā)突變體中獲得菌株

自然狀態(tài)下，堿基對發(fā)生自然突變的機(jī)率為10-8～10-9，自然突變有兩種情況：一種是我們生產(chǎn)上所不希望看到的，表現(xiàn)為菌株的衰退和生產(chǎn)質(zhì)量的下降，這種突變稱為負(fù)突變。另一種是我們生產(chǎn)上希望看到的，對生產(chǎn)有利，這種突變稱為正突變。

二、誘變育種用各種物理、化學(xué)的因素人工誘發(fā)基因突變進(jìn)行的篩選，稱為誘變育種。誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)稱為誘變劑。誘變劑物理：紫外線，快中子化學(xué)：硫酸二乙酯，亞硝基胍{

誘變育種的主要環(huán)節(jié)（1）以合適的誘變劑處理細(xì)胞懸浮液

——誘變（2）用合適的方法淘汰負(fù)效應(yīng)變異株，選出性能優(yōu)良的正變異株——篩選

（一）誘變育種的程序選擇出發(fā)菌株制備菌懸液前培養(yǎng)物理誘變誘變變異菌株的分離和篩選化學(xué)誘變（二）突變株的篩選隨機(jī)篩選：傳統(tǒng)方法（1）搖瓶篩選法（2）瓊脂塊篩選法2.理化性篩選方法一：降低終產(chǎn)物濃度a.篩選終產(chǎn)物營養(yǎng)缺陷型

AaBbCcDdE

b.篩選細(xì)胞膜透性改變的突變株使終產(chǎn)物排出細(xì)胞，以降低細(xì)胞內(nèi)終產(chǎn)物濃度。如：用谷氨酸棒桿菌（Corynebacteriumglutamicum）的生物素營養(yǎng)缺陷型（biotindeficiency）進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵。

生物素：B族維生素的一種，又稱維生素H或輔酶R。是合成脂肪酸所必需的。脂肪酸的生物合成：利用乙酰CoA（直接原料是丙二酸單酰CoA）在乙酰CoA羧化酶（輔基為生物素）催化下合成。

脂肪酸＋甘油磷酸磷脂＋蛋白質(zhì)生物膜因此，脂肪酸是組成細(xì)胞膜類脂的必要成分。生物素限量，不利于脂肪酸的合成，有利于谷氨酸透過細(xì)胞膜分泌至體外。

使胞內(nèi)代謝產(chǎn)物迅速排出的方法

1.用生理學(xué)手段——

直接抑制膜合成或使膜受缺損如:Glu發(fā)酵中，控制生物素亞適量可大量分泌Glu；當(dāng)培養(yǎng)液中生物素含量較高時(shí)采用適量添加青霉素的方法；2.利用膜缺損突變株

——

油酸缺陷型、甘油缺陷型如:用谷氨酸生產(chǎn)菌的油酸缺陷型，限制地添加油酸，合成有缺損的膜。應(yīng)用甘油缺陷型菌株，即便在生物素或油酸過量的情況下，也可以獲得大量谷氨酸。

控制細(xì)胞膜的滲透性1.通過生理學(xué)手段控制細(xì)胞膜滲透性2.通過細(xì)胞膜缺損突變控制細(xì)胞膜滲透性生物素谷氨酸細(xì)胞膜滲透性青霉素谷氨酸油酸缺陷型油酸

方法二：篩選抗反饋突變株抗反饋控制突變株——是指對反饋抑制不敏感或?qū)ψ瓒粲锌剐裕騼烧呒嬗兄木??？狗答伩刂仆蛔冎昕梢詮慕K產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株中獲得。

營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選誘變淘汰野生型菌株：抗菌素法、菌絲過濾法檢出缺陷型：影印法

夾層法

逐個(gè)檢出法

限量補(bǔ)充培養(yǎng)法確定生長譜

第三節(jié)生產(chǎn)菌種的改良一、原生質(zhì)體融合（protoplastfusion）

1.標(biāo)記菌株的篩選

2.原生質(zhì)體的制備

3.原生質(zhì)體的融合與再生聚乙二醇（PEG）－脫水劑助融劑

Ca2+－提高融合頻率

4.融合子的選擇二、DNA重組技術(shù)（DNArecombinationtechnology）目標(biāo)DNA片斷的獲得與載體DNA分子的連接重組DNA分子引入宿主細(xì)胞從中選出所需重組DNA分子的宿主細(xì)胞

第四節(jié)菌種的衰退、復(fù)壯與保藏一、菌種的衰退衰退原因1.菌種保藏不當(dāng)2.菌種生長條件沒有得到滿足二、菌種的復(fù)壯

1.純種分離

2.通過寄主體進(jìn)行復(fù)壯

3.淘汰已衰退的個(gè)體三、菌種保藏

1.原理低溫、干燥、缺氧、缺營養(yǎng)物質(zhì)

2.方法（1）斜面保藏法（2）干燥保藏法（3）懸液保藏法（4）冷凍干燥保藏法（5）液氮保藏法（6）低溫保藏法

第五節(jié)種子的擴(kuò)大培養(yǎng)一、微生物的培養(yǎng)方法

1.表面培養(yǎng)

2.固體培養(yǎng)

3.液體深層培養(yǎng)二、菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)種子擴(kuò)大培養(yǎng)的概念

指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴(kuò)大培養(yǎng),最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。

菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的目的：為每次發(fā)酵罐的投料提供相當(dāng)數(shù)量的代謝旺盛的種子。接種量的需要菌種的馴化縮短發(fā)酵時(shí)間、保證生產(chǎn)水平

（一）種子制備的工藝流程

搖瓶保藏菌種試管斜面活化茄瓶斜面種子罐固體培養(yǎng)基生理代謝菌種篩選種子培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)（二）斜面菌種的培養(yǎng)

1.不宜多次移種。

2.活化斜面中加0.1%葡萄糖。培養(yǎng)基特點(diǎn)：原料較精細(xì)。（三）一級種子培養(yǎng)（搖瓶）培養(yǎng)基特點(diǎn)：

使用的原料基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基。（四）二級種子培養(yǎng)（種子罐）培養(yǎng)基的特點(diǎn)：

和一級種子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，更接近于發(fā)酵培養(yǎng)基。（五）種子罐級數(shù)制備種子需逐級擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)。谷氨酸：一級種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)（二級發(fā)酵）搖瓶培養(yǎng)→一級種子（小罐）→發(fā)酵青霉素：二級種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)（三級發(fā)酵）搖瓶培養(yǎng)→一級種子（小罐）→二級種子（中罐）→發(fā)酵發(fā)酵級數(shù)確定的依據(jù)級數(shù)受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長特性、接種量的影響。級數(shù)大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一般2-4級。（六）種齡與接種量

1.種齡種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。種齡短：菌體太少；種齡長：易老化。原則：對數(shù)生長期末，細(xì)胞活力強(qiáng)，菌體濃度相對較大。2.接種量移入種子的體積接種量＝—————————

接種后培養(yǎng)液的體積

一般：細(xì)菌1％霉菌715％雙種：兩個(gè)種子罐接種到一個(gè)發(fā)酵罐中。倒種：一部分種子來源于種子罐，一部分來源于發(fā)酵罐。

大量地接入培養(yǎng)成熟菌種的優(yōu)點(diǎn)：

1.可以縮短生長過程的延緩期，因而縮短了發(fā)酵周期，提高了設(shè)備利用率。

2.節(jié)約了發(fā)酵培養(yǎng)的動力消耗。

3.并有利于減少染菌機(jī)會。

工業(yè)發(fā)酵的目的：

大量積累人們所需要的微生物代謝產(chǎn)物。

代謝的人工控制：人為地打破微生物的代謝控制體系，使代謝朝著人們希望的方向進(jìn)行。

人工控制代謝的手段：

改變微生物遺傳特性(遺傳學(xué)方法）；控制發(fā)酵條件（生物化學(xué)方法）；改變細(xì)胞膜透性；

第二章培養(yǎng)基及制備第一節(jié)工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基的作用：滿足菌體的生長促進(jìn)產(chǎn)物的形成一、工業(yè)上常用的碳源（carbonsource）1.谷物淀粉（玉米、馬鈴薯、木薯淀粉）

—

應(yīng)用最廣。使用條件：微生物必須能分泌水解淀粉、糊精的酶類。

缺點(diǎn)：

a.難利用、發(fā)酵液比較稠、一般>2.0%時(shí)加入一定的α-淀粉酶。

b.成分較復(fù)雜，有直鏈淀粉和支鏈淀粉等。優(yōu)點(diǎn)：來源廣泛、價(jià)格低，可解除葡萄糖效應(yīng)。

2.葡萄糖所有的微生物都能利用葡萄糖，但會引起葡萄糖效應(yīng)。工業(yè)上常用淀粉水解糖,但是糖液必須達(dá)到一定的質(zhì)量指標(biāo)。3.糖蜜（制糖工業(yè)上的廢糖蜜或結(jié)晶母液）

canemolasses包括

beetmolasses

糖蜜使用的注意點(diǎn)：

除糖份外，含有較多的雜質(zhì)，對發(fā)酵產(chǎn)生不利的影響，需要進(jìn)行預(yù)處理。例：谷氨酸發(fā)酵有害物質(zhì)：膠體成分（起泡、影響結(jié)晶）、鈣鹽（影響結(jié)晶）、生物素（代謝控制）。預(yù)處理：澄清→脫鈣→脫除生物素例：檸檬酸發(fā)酵有害物質(zhì)：鐵離子含量高（導(dǎo)致異檸檬酸的生成）預(yù)處理：黃血鹽二、工業(yè)上常用的氮源（nitrogensource）

1.無機(jī)氮：種類：氨水、銨鹽或硝酸鹽、尿素特點(diǎn)：吸收快，也稱之迅速利用的氮源。但無機(jī)氮源的迅速利用常會引起pH的變化,如：

(NH4)2SO4

→2NH3+2H2SO4

NaNO3+4H2

→NH3+2H2O+NaOH

無機(jī)氮源被菌體利用后，培養(yǎng)液中留下了酸性或堿性物質(zhì)。

代謝后形成酸性物質(zhì)的無機(jī)氮源稱生理酸性物質(zhì)，如硫酸銨。

代謝后產(chǎn)生堿性物質(zhì)的無機(jī)氮源稱生理堿性物質(zhì)，如硝酸鈉。

正確使用生理酸堿性物質(zhì)，對穩(wěn)定和調(diào)節(jié)發(fā)酵過程的pH有積極作用。

所以選擇合適的無機(jī)氮源有兩層意義：

滿足菌體生長穩(wěn)定和調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中的pH無機(jī)氮源的影響：硫酸銨>硝酸銨>硝酸鈉>尿素毛霉產(chǎn)蛋白酶的研究2.有機(jī)氮：來源：一些廉價(jià)的原料，如玉米漿、豆餅粉、花生餅粉、魚粉、酵母浸出膏等。成分復(fù)雜：除提供氮源外，有些有機(jī)氮源還提供大量的無機(jī)鹽及生長因子。三、無機(jī)鹽（inorganicmineral）硫酸鹽、磷酸鹽、氯化物及一些微量元素。四、生長因子（growthfactor）微生物生長不可缺少的微量有機(jī)物質(zhì)。如氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素。生物素作用：主要影響細(xì)胞膜通透性，同時(shí)也影響菌體的代謝途徑。即：影響菌體生長和谷氨酸積累。過量：菌體大量繁殖，不產(chǎn)或少產(chǎn)谷氨酸。不足：菌體生長不好，谷氨酸產(chǎn)量也低。因此，要達(dá)到菌體生長需要的“亞適量”。2.提供生長因子的農(nóng)副產(chǎn)品原料（1）玉米漿：（cornsteepliquor,CSL）最具代表性。（2）麩皮水解液（3）糖蜜（4）酵母五、發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)和優(yōu)化設(shè)計(jì)步驟：①初步確定可能的培養(yǎng)基成分；②通過單因子實(shí)驗(yàn)確定適宜的培養(yǎng)基成分；③采用正交試驗(yàn)法確定各成分最適濃度。類胡蘿卜素高產(chǎn)菌Y11的培養(yǎng)基的優(yōu)化郭秒,食品與工業(yè)發(fā)酵，2004類胡蘿卜素的作用：色素、營養(yǎng)保健原培養(yǎng)基:

初步確定可能的培養(yǎng)基成分(以碳源為例)

通過單因子實(shí)驗(yàn)確定適宜的培養(yǎng)基成分(以碳源為例)考慮到成本：乙酸鈉是較為合適的碳源

正交設(shè)計(jì)確定優(yōu)化的配方結(jié)果：碳源：乙酸鈉0.2%氮源：氯化銨0.2%

酵母膏0.03%無機(jī)鹽:復(fù)合無機(jī)鹽0.05%搖瓶優(yōu)化配方：菌種篩選，反應(yīng)器研究的基礎(chǔ)發(fā)酵罐：反應(yīng)器水平,

可以得出最終優(yōu)化的基礎(chǔ)配方pH控制搖床：反應(yīng)器水平上的搖瓶研究

第二節(jié)淀粉水解糖的制備在工業(yè)生產(chǎn)中，將淀粉水解為葡萄糖（glucose）的過程稱淀粉的糖化，制得的溶液叫淀粉水解糖。

一、淀粉水解制糖的意義大多數(shù)微生物不能直接利用淀粉（所有的氨基酸生產(chǎn)菌不能直接利用）2.有些微生物能夠直接利用淀粉作原料，但必須在微生物產(chǎn)生淀粉酶后才能進(jìn)行，過程緩慢，發(fā)酵周期延長。3.若直接利用淀粉作原料，滅菌過程的高溫會導(dǎo)致淀粉結(jié)塊，發(fā)酵液粘度劇增。二、淀粉水解糖的制備方法及原理（一）酸解法（acidhydrolysismethod）以酸為催化劑，在高溫高壓下使淀粉水解生成葡萄糖的方法。

1.水解過程：總反應(yīng)式：(C6H10O5)n+nH2OnC6H12O6過程：(C6H10O5)n(C6H10O5)xC12H22O11C6H12O6

淀粉糊精麥芽糖葡萄糖

H+對作用點(diǎn)無選擇性，-1,4-糖苷鍵和-1,6-糖苷鍵均被切斷。2.葡萄糖的復(fù)合反應(yīng)和分解反應(yīng)在水解過程中，由于受到酸和熱的作用，一部分葡萄糖會發(fā)生復(fù)合反應(yīng)和分解反應(yīng)。

淀粉

葡萄糖復(fù)合二糖5‘－羥甲基糠醛復(fù)合低聚糖有機(jī)酸、有色物質(zhì)損失葡萄糖量

7％<1％復(fù)合反應(yīng)分解反應(yīng)

不利影響：（1）降低了葡萄糖的收率。（2）給產(chǎn)物的提取和糖化液的精制帶來困難。復(fù)合反應(yīng)：生成的多數(shù)復(fù)合糖不能被微生物利用，使發(fā)酵結(jié)束時(shí)殘?zhí)歉?。分解反?yīng)：生成的5‘－羥甲基糠醛是產(chǎn)生色素的根源，增加了糖化液精制脫色的困難。如何控制分解反應(yīng)和復(fù)合反應(yīng)的發(fā)生？（1）淀粉乳濃度（2）酸濃度不能過高（3）溫度3.評價(jià)優(yōu)點(diǎn)：工藝簡單，水解時(shí)間短，生產(chǎn)效率高，設(shè)備周轉(zhuǎn)快。缺點(diǎn)：（1）副產(chǎn)物多，影響糖液純度，一般DE值只有90％左右。（2）對淀粉原料要求嚴(yán)格，不能用粗淀粉，只能用純度較高的精制淀粉。DE值：dextroseequivalentvalue

（葡萄糖當(dāng)量值）表示淀粉糖的含糖量。還原糖含量（％）DE值＝

100％干物質(zhì)含量（％）（二）酶解法（enzymehydrolysismethod）用專一性很強(qiáng)的淀粉酶及糖化酶將淀粉水解為葡萄糖的工藝。

分兩步：（1）液化：用-淀粉酶將淀粉轉(zhuǎn)化為糊精和低聚糖，（2）糖化：用糖化酶（又稱葡萄糖淀粉酶）將糊精和低聚糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖。所以，淀粉的液化和糖化均在酶作用下進(jìn)行，又稱雙酶法(doubleenzymehydrolysismethod)。液化（liquification）－淀粉酶水解底物內(nèi)部的－1,4糖苷鍵，不能水解－1,6糖苷鍵，一般采用耐高溫淀粉酶，使液化速度加快。85－90。

液化程度的控制（液化后需糖化的原因）糖液的DE值低（α-淀粉酶不能水解α-1,6糖苷鍵）液化在較高溫度下進(jìn)行，液化時(shí)間加長，淀粉老化，使糖化酶難以利用。糖化酶水解的底物分子要求有一定的大小范圍。

根據(jù)生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，DE值在2030之間為好，液化終點(diǎn)可通過碘液判斷，此時(shí)呈棕色。2.糖化（saccharification）糖化酶從非還原性末端水解-1,4糖苷鍵和-1,6糖苷鍵。終點(diǎn)確定：DE值達(dá)最高時(shí)，停止酶反應(yīng)。3.評價(jià)優(yōu)點(diǎn)：（1）反應(yīng)條件溫和，不需高溫、高壓設(shè)備。（2）副反應(yīng)少，水解糖液純度高。（3）對原料要求粗放，可用粗原料并在較高淀粉乳濃度下水解。（4）糖液顏色淺，質(zhì)量高。

缺點(diǎn)：（1）生產(chǎn)周期長，一般需要48小時(shí)。（2）需要更多的設(shè)備，且操作嚴(yán)格。

（三）酸酶結(jié)合法（acid-enzymehydrolysismethod）集酸解法和酶解法的優(yōu)點(diǎn)而采取的生產(chǎn)工藝。根據(jù)原料淀粉性質(zhì)分：酸酶法：先將淀粉酸水解成糊精和低聚糖，再用糖化酶將其水解為葡萄糖。適用：淀粉顆粒堅(jiān)硬（如玉米、小麥）的原料，若用-淀粉酶液化，短時(shí)間液化，反應(yīng)往往不徹底。2.酶酸法：先用-淀粉酶液化，再用酸水解。適用：顆粒大小不一（如碎米淀粉）的淀粉原料，若用酸法，則水解不均勻。（四）不同糖化工藝的比較項(xiàng)目酸解法酸酶結(jié)合法酶解法DE值919598羥甲基糠醛（％）0.30.0080.003色度100.30.2淀粉轉(zhuǎn)化率909598工藝條件高溫加壓高溫加壓常溫過程耗能多多少副產(chǎn)物多中少生產(chǎn)周期短中長設(shè)備規(guī)模小中大防腐要求高較高低適合發(fā)酵工藝情況差中有利

第三節(jié)糖蜜原料一、糖蜜的分類及組成含糖量含氮量1.分類：canemolasses高低

beetmolasses低高2.組成：粘稠、黑褐色、半流動狀液體。組成各不相同。二、糖蜜的預(yù)處理澄清：加酸，加絮凝劑（石灰）脫鈣：加Na2CO3降低生物素含量（谷氨酸發(fā)酵中）（1）去除生物素：活性炭及樹脂吸附（2）拮抗生物素：加表面活性劑（Tween60），阻止油酸合成（3）加青霉素：使細(xì)胞壁不完整菌種方面：使用油酸或甘油缺陷型。

第三章培養(yǎng)基滅菌與空氣凈化

第一節(jié)培養(yǎng)基滅菌

一、滅菌的原理和方法

消毒（disinfection）與滅菌（sterilization）的區(qū)別？

消毒是指用物理或化學(xué)方法殺死物料、容器、器具內(nèi)外的病原微生物。一般只能殺死營養(yǎng)細(xì)胞而不能殺死細(xì)菌芽孢。例如，巴氏消毒法，是將物料加熱至60℃維持30min，以殺死不耐高溫的微生物營養(yǎng)細(xì)胞。

滅菌是用物理或化學(xué)方法殺死或除去環(huán)境中所有微生物，包括營養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌芽孢和孢子。

消毒不一定能達(dá)到滅菌要求，而滅菌則可達(dá)到消毒的目的。

防腐（antisepsis）

防腐就是利用某種理化因素完全抑制霉腐微生物的生長繁殖，從而達(dá)到防止食品等發(fā)生霉腐的措施。（1）低溫（4）高滲（2）缺氧（5）高酸度（3）干燥（6）防腐劑

除菌的方法

培養(yǎng)基的加熱滅菌空氣的過濾除菌紫外線或電離輻射化學(xué)藥物滅菌1.化學(xué)試劑滅菌法

甲醛、乙醇或新潔爾滅、高錳酸鉀等適用范圍：環(huán)境、皮膚及器械的表面消毒2.射線滅菌法3.干熱滅菌法

電磁波、紫外線或放射性物質(zhì)適用范圍：無菌室、接種箱常用烘箱，滅菌條件：160℃下保溫1h適用范圍：金屬或玻璃器皿4.濕熱滅菌法

利用飽和蒸汽滅菌，條件：121℃，30min適用范圍：生產(chǎn)設(shè)備及培養(yǎng)基滅菌5.過濾除菌法

利用過濾方法阻留微生物適用范圍：制備無菌空氣

6.火焰滅菌法

火焰適用范圍：接種針、玻璃棒、三角瓶口

二、培養(yǎng)基的濕熱滅菌

濕熱滅菌原理滅菌條件滅菌不利方面蒸汽具有很強(qiáng)的穿透能力，而且在冷凝時(shí)會放出大量的冷凝熱，很容易使蛋白質(zhì)凝固而殺死各種微生物。

121℃，30min。

同時(shí)會破壞培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，甚至產(chǎn)生不利于菌體生長的物質(zhì)。

將配制好的培養(yǎng)基同時(shí)放在發(fā)酵罐或其他裝置中，通入蒸汽將培養(yǎng)基和所用設(shè)備一起進(jìn)行加熱滅菌的過程，也稱實(shí)罐滅菌。（一）間歇滅菌

（常用）24016012080時(shí)間（min)050100150溫度升溫冷卻保溫培養(yǎng)基間歇滅菌過程中的溫度變化情況過程包括：升溫、保溫和冷卻三階段。各階段對滅菌的貢獻(xiàn)：

20%、75%、5%。發(fā)酵罐蒸汽蒸汽冷卻水無菌培養(yǎng)基配料罐泵加熱塔維持罐冷卻管（二）連續(xù)滅菌（又稱連消）

將培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外通過連續(xù)滅菌裝置進(jìn)行加熱、保溫和冷卻而進(jìn)行滅菌。

連續(xù)滅菌的基本設(shè)備有哪些？問題連續(xù)滅菌的流程與設(shè)備（1）配料預(yù)熱罐，將配制好的料液預(yù)熱到6070°C，以免連續(xù)滅菌時(shí)由于料液與蒸汽溫度相差過大而產(chǎn)生水汽撞擊聲；（2）連消塔，用高溫蒸汽使料液溫度很快升高到滅菌溫度（126132°C）；（3）維持罐，使料液在滅菌溫度下保持57min。因?yàn)椋哼B消塔加熱的時(shí)間很短，光靠這段時(shí)間的滅菌是不夠的；（4）冷卻管，使料液冷卻到4050°C后（冷水噴淋），輸送到預(yù)先滅菌過的罐內(nèi)。

連續(xù)滅菌過程中溫度的變化(虛線)

優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)連續(xù)滅菌1.高溫短時(shí)滅菌，培養(yǎng)基營養(yǎng)成分損失少。2.發(fā)酵罐占用時(shí)間縮短，利用率高。

1.設(shè)備復(fù)雜，操作麻煩,

染菌機(jī)會多。2.不適合含大量固體物料的滅菌。間歇滅菌1.設(shè)備要求低，不需另外加熱、冷卻裝置。2.操作要求低，適合小批量生產(chǎn)規(guī)模3.適合含大量固體物料的滅菌1.培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)損失大，滅菌后培養(yǎng)基質(zhì)量下降2.發(fā)酵罐的利用率較低3.不適合大規(guī)模生產(chǎn)的滅菌（三）間歇滅菌與連續(xù)滅菌的比較

第二節(jié)空氣凈化（除菌）發(fā)酵對空氣無菌程度的要求

一般要求1000次使用周期中只允許有一個(gè)菌通過，即經(jīng)過濾后空氣的無菌程度為N=10-3?？諝庵形⑸?包括細(xì)菌、酵母、霉菌和病毒)含量一般為103~104個(gè)／米3。一般附著在空氣中的灰塵上或霧滴上。灰塵粒子的平均大小約0.6μm左右，空氣除菌主要去除空氣中的微粒(0.6~1μm）。一、空氣除菌的方法

（一）輻射殺菌（二）熱殺菌

（三）靜電除菌（四）過濾除菌

二、空氣過濾除菌的原理與介質(zhì)

1.過濾除菌的種類絕對過濾：過濾介質(zhì)的濾孔小于細(xì)胞和孢子。如聚乙烯醇縮甲醛樹脂（PVF）制成的0.3m的微孔濾膜。深層介質(zhì)過濾：介質(zhì)的孔隙一般大于微生物細(xì)胞。如用棉花、玻璃纖維和顆?；钚蕴刻畛涞倪^濾器。2.深層介質(zhì)過濾的原理

微粒隨氣流通過濾層時(shí)，由于濾層纖維的層層阻礙，使氣流出現(xiàn)無數(shù)次改變運(yùn)動速度和方向的繞流運(yùn)動，引起微粒與濾層纖維間產(chǎn)生慣性沖擊、攔截、布朗擴(kuò)散、重力沉降、靜電引力等作用把微粒滯留在纖維表面上，實(shí)現(xiàn)過濾的目的。

3.空氣過濾除菌介質(zhì)

（１）纖維狀或顆粒狀過濾介質(zhì)棉花：常用，有彈性，纖維長度適中。玻璃纖維：纖維直徑小，不易折斷，過濾效果好?；钚蕴浚阂筚|(zhì)地堅(jiān)硬，顆粒均勻。缺點(diǎn)：體積大，裝填費(fèi)時(shí)費(fèi)力，松緊度不易掌握，空氣壓降大。（２）紙類過濾介質(zhì)——超細(xì)玻璃纖維紙

36張疊在一起使用，過濾效率高，壓降小。缺點(diǎn)：強(qiáng)度不大（特別是受潮后）。發(fā)酵生產(chǎn)中制備無菌空氣的

大致過程

空氣空壓機(jī)貯氣罐冷卻除油水加熱空氣預(yù)處理總過濾器分過濾器無菌空氣

空氣過濾三、空氣的預(yù)處理

目的:提高壓縮前空氣的潔凈度去除壓縮后空氣中的油和水1.提高壓縮前空氣的潔凈度（1）提高空氣吸氣口的位置（2）在空氣入口處設(shè)置粗過濾器

——捕集較大的灰塵顆粒，并保護(hù)空壓機(jī)。高空取氣管

為遠(yuǎn)離地面幾十米的管子。每升高10米，空氣中雜菌降低一個(gè)數(shù)量級。因此從高空取氣要比從低空取氣有利得多。

高效前置過濾除菌流程

１——高效前置過濾器２——壓縮機(jī)３——貯罐４——冷卻器５——絲網(wǎng)分離器６——加熱器７——過濾器

2.空氣壓縮和壓縮空氣的冷卻（1）空氣壓縮：克服輸送過程中過濾介質(zhì)的阻力并維持一定的氣流速度。（2）壓縮后空氣溫度顯著上升，需冷卻。

因?yàn)閴嚎s后的高溫空氣能引起過濾介質(zhì)的炭化或燃燒增大發(fā)酵罐的降溫負(fù)荷增加培養(yǎng)液水分的蒸發(fā)一般用列管式冷卻器進(jìn)行冷卻?？諝赓A罐消除壓縮機(jī)排出空氣量的脈沖，維持穩(wěn)定的空氣壓力。利用重力沉降作用除去部分油霧。緊接空壓機(jī)安裝。有些裝有冷卻管。3.壓縮空氣的除油除水

冷卻降溫后的空氣濕度增大，會使過濾介質(zhì)受潮失效。

兩類設(shè)備旋風(fēng)分離器——利用離心力進(jìn)行沉降，對于10m以上的微粒分離效率較高。絲網(wǎng)分離器——利用慣性進(jìn)行攔截，分離效率較高，能除去2～5m的細(xì)小顆粒。旋風(fēng)分離器

采用慣性攔截等機(jī)理，有效去除空氣中的水、油霧、塵埃，不銹鋼絲網(wǎng)可清洗，使用壽命長。4.空氣的加熱將除油水的空氣加熱（溫差在10～15°C

左右），降低相對濕度（達(dá)50%～60%）后，輸入過濾器。用列管換熱器。空氣過濾除菌設(shè)備流程空壓機(jī)儲罐二級冷卻加熱器空氣過濾粗過濾四、空氣過濾器過濾除菌的關(guān)鍵設(shè)備180M3發(fā)酵罐車間大型空氣壓縮機(jī)發(fā)酵車間的空氣過濾器空氣凈化的流程吸氣口吸入的空氣先經(jīng)過壓縮前的過濾進(jìn)入空氣壓縮機(jī)（120150°C）冷卻（2025°C），除去油、水，再加熱至3035°C。最后通過總過濾器和分過濾器，獲得潔凈度、壓力、溫度和流量都符合要求的無菌空氣。

第四章發(fā)酵工藝過程控制第一節(jié)發(fā)酵的操作方式分批培養(yǎng)補(bǔ)料分批培養(yǎng)（半連續(xù)培養(yǎng)）連續(xù)培養(yǎng)一、分批培養(yǎng)

（batchcultureorfermentation）1.概念：在一個(gè)密閉系統(tǒng)內(nèi)投入有限數(shù)量的營養(yǎng)物質(zhì)后，接入少量的微生物菌種進(jìn)行培養(yǎng)，在特定的條件下只完成一個(gè)生長周期的微生物培養(yǎng)方法。分批培養(yǎng)中微生物的生長遲滯期對數(shù)生長期穩(wěn)定期死亡期2.特點(diǎn)：(1)整個(gè)培養(yǎng)系統(tǒng)與外界沒有其它物質(zhì)交換（O2、CO2、消泡劑、酸堿除外）(2)整個(gè)過程中菌的濃度、營養(yǎng)成分的濃度和產(chǎn)物濃度不斷變化，是一種非穩(wěn)態(tài)的培養(yǎng)方法。3.分批培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):操作簡單，周期短，染菌機(jī)會少，生產(chǎn)過程和產(chǎn)品質(zhì)量容易掌握。缺點(diǎn):產(chǎn)率低，不適于測定動力學(xué)數(shù)據(jù)。二、連續(xù)培養(yǎng)（continuousculture）

1.概念：微生物培養(yǎng)到對數(shù)生長期時(shí)，在發(fā)酵罐中不斷添加新鮮的培養(yǎng)基，同時(shí)不斷放出代謝物，使微生物細(xì)胞在近似恒定狀態(tài)下生長的培養(yǎng)方式。2.特點(diǎn)：菌的濃度，產(chǎn)物濃度，限制性基質(zhì)濃度均處于恒定狀態(tài)。3.連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):

控制稀釋速率可以使發(fā)酵過程最優(yōu)化。發(fā)酵周期長，產(chǎn)量高。缺點(diǎn):

長期連續(xù)培養(yǎng)會引起菌種退化，降低產(chǎn)量。染菌機(jī)會增加。應(yīng)用：廢水處理、葡萄糖酸發(fā)酵、酒精發(fā)酵等工業(yè)中。三、補(bǔ)料分批培養(yǎng)（fed-batchculture）介于分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)之間的操作方法。1.概念：根據(jù)菌體生長和初始培養(yǎng)基的特點(diǎn)，在分批培養(yǎng)的某些階段適當(dāng)補(bǔ)加培養(yǎng)基，使菌體或其代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)時(shí)間延長。2.補(bǔ)料分批培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：

與分批培養(yǎng)相比(1)解除底物抑制、產(chǎn)物的反饋抑制和葡萄糖的分解阻遏效應(yīng)。(2)延長次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)時(shí)間。

與連續(xù)培養(yǎng)相比(1)降低了染菌，避免了遺傳不穩(wěn)定性。(2)最終產(chǎn)物濃度較高，有利于產(chǎn)物的分離。(3)使用范圍廣。

缺點(diǎn)：(1)由于沒有物料取出，產(chǎn)物的積累最終導(dǎo)致比生產(chǎn)速率的下降。(2)由于物料的加入增加了染菌機(jī)會。應(yīng)用：面包酵母、氨基酸、抗生素等工業(yè)。3.幾個(gè)實(shí)例：產(chǎn)物補(bǔ)料物酵母菌麥芽汁、氮、磷、鎂谷氨酸氨水或尿素檸檬酸銨鹽、糖蘋果酸葡萄糖淀粉酶葡萄糖青霉素葡萄糖、氨水、苯乙酸

第二節(jié)溫度變化及其控制一、溫度對發(fā)酵的影響

1.影響反應(yīng)速率

2.影響發(fā)酵方向另外，還影響發(fā)酵液的粘度、溶氧和傳遞速率。二、最適溫度的選擇最適發(fā)酵溫度是既適合菌體的生長又適合代謝產(chǎn)物合成的溫度。隨菌種、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件和菌體生長階段不同而改變。

三、發(fā)酵過程引起溫度變化的因素——發(fā)酵熱Q發(fā)酵＝Q生物＋Q攪拌－Q蒸發(fā)－Q輻射四、溫度的控制一般不需加熱，因釋放了大量的發(fā)酵熱，需要冷卻的情況多。用夾套或蛇形管，通冷卻水。

第三節(jié)pH變化及其控制一、pH變化的原因

1.基質(zhì)代謝

（1）糖代謝糖分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是補(bǔ)料的標(biāo)志之一。（2）氮代謝氨基酸中的-NH2被利用，pH下降；尿素被分解成NH3，pH上升。（3）生理酸堿性物質(zhì)利用后，pH上升或下降。

2.產(chǎn)物形成

3.菌體自溶pH上升二、pH對發(fā)酵的影響

1.影響酶的活性。

2.影響微生物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。

3.影響微生物對基質(zhì)的利用速率。

4.影響代謝方向三、pH值的確定和控制

1.pH的確定微生物發(fā)酵的最適pH范圍一般在58之間，根據(jù)實(shí)驗(yàn)確定，即配制不同初始pH的培養(yǎng)基，搖瓶考察發(fā)酵情況。2.pH的控制

(1)調(diào)節(jié)好基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH。若控制消后pH在6.0，消前pH往往要調(diào)到6.56.8。

(2)通過加酸堿和中間補(bǔ)料來控制。a.過去直接加酸（H2SO4）或堿（NaOH），現(xiàn)常用：生理酸性物質(zhì)：(NH4)2SO4

生理堿性物質(zhì)：氨水b.補(bǔ)料既調(diào)節(jié)了pH值，又補(bǔ)充了營養(yǎng)，還可減少阻遏作用。如：味精廠普遍采用流加尿素，有兩個(gè)作用:

調(diào)節(jié)pH值補(bǔ)充氮源

第四節(jié)溶解氧及其控制一、溶解氧（dissolvedoxygen,DO）對發(fā)酵的影響

溶氧要適量，大小與產(chǎn)物的生物合成途徑有關(guān)。（1）最適氧濃度（optimaloxygenconcentration）：

——菌體生長或產(chǎn)物合成最適濃度范圍。（2）臨界氧濃度（criticalvalueofdissolvedoxygenconcentration）：

——滿足微生物呼吸的最低氧濃度。二、溶氧濃度的控制溶氧濃度決定因素：供氧和需氧兩方面。（一）供氧方面：

1.調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速

2.調(diào)節(jié)通氣速率（二）需氧方面：

1.菌體濃度和菌齡

2.基質(zhì)種類和濃度以菌濃影響最明顯。

3.培養(yǎng)條件控制方法：通過控制基質(zhì)濃度。大型發(fā)酵罐攪拌裝置溫度傳感器、耐高溫pH和溶氧（DO）傳感器

第五節(jié)泡沫的形成與控制一、泡沫產(chǎn)生的原因

1.通風(fēng)攪拌程度及菌體新陳代謝產(chǎn)生的CO2。

2.培養(yǎng)基性質(zhì)二、泡沫的危害

1.降低生產(chǎn)能力（裝料系數(shù)減少）引起原料浪費(fèi)

2.造成大量逃液引起染菌

3.影響菌的呼吸三、泡沫的控制調(diào)整培養(yǎng)基成分（如少加或緩加易起泡的原材料）改變某些物理化學(xué)參數(shù)（如pH值、溫度、通氣和攪拌）改變發(fā)酵工藝（采用分批投料）1.機(jī)械消泡：（物理方法）利用機(jī)械振動或壓力變化使泡沫破裂。罐內(nèi)消泡:靠罐內(nèi)消泡漿打碎泡沫。罐外消泡：靠噴嘴的加速作用消除泡沫。2.消泡劑消泡機(jī)理:降低液膜的機(jī)械強(qiáng)度降低液膜的表面粘度（1）天然油脂類：豆油、玉米油、棉子油、菜籽油（還可作為碳源），用量大，0.1%0.2%。（2）聚醚類：又稱泡敵，消泡能力為豆油的1020倍，用量少，0.02%-0.03%。

第六節(jié)發(fā)酵染菌及其防治一、染菌的檢查、判斷（一）觀察法

1.菌體濃度（OD值）異常（OD:opticaldensity）

2.溶解氧（DO）異常

3.pH值異常

4.排氣中CO2異常

5.泡沫過多（二）鏡檢法（三）平板劃線培養(yǎng)法（四）酚紅肉湯培養(yǎng)法二、發(fā)酵染菌的原因

1.種子帶菌

2.空氣帶菌

3.設(shè)備滲漏

4.培養(yǎng)基滅菌不徹底

5.技術(shù)管理不善三、染菌情況分析1.單罐染菌罐本身而非系統(tǒng)問題。如種子帶菌、培養(yǎng)基滅菌不徹底、罐有滲漏、分過濾器失效。2.多罐染菌系統(tǒng)問題，如空氣過濾系統(tǒng)有問題，特別是總過濾器長期沒有檢查，可能受潮失效；移種或補(bǔ)料的分配站有滲漏或滅菌不徹底。3.前期染菌種子帶菌、培養(yǎng)基滅菌不徹底。4.中后期染菌補(bǔ)料的料液滅菌不徹底或補(bǔ)料管道、閥門滲漏，一般不會是種子問題。四、噬菌體（phage）染菌及其防治（一）phage的檢查

1.單層瓊脂法

2.雙層瓊脂法

3.平板交叉劃線法

4.液體培養(yǎng)檢查法（二）phage的防治

工藝角度1.消滅環(huán)境中的phage2.藥物防治

菌種選育1.輪換菌種2.選育抗phage的菌株

第五章下游加工過程（downstreamprocessing）

第一節(jié)概況一、下游加工技術(shù)的重要性

1.產(chǎn)品分離純化是最終獲得商業(yè)產(chǎn)品的環(huán)節(jié)。

2.投資費(fèi)用高（抗生素、乙醇、檸檬酸占60%）。

3.分離純化技術(shù)落后會阻礙發(fā)酵工程技術(shù)的發(fā)展。

幾種產(chǎn)品在發(fā)酵液中的濃度產(chǎn)品典型濃度（g/L）抗生素25

氨基酸100

酒精100

有機(jī)酸100

酶20

蛋白質(zhì)10二、下游加工技術(shù)的特點(diǎn)

1.發(fā)酵液的復(fù)雜性造成分離上的困難性。

2.欲提取的產(chǎn)物通常濃度低且很不穩(wěn)定。

3.多為分批操作，各批發(fā)酵液不盡相同，要求下游加工有一定彈性。

第二節(jié)下游加工過程一、一般程序

1.預(yù)處理和固液分離：加速固液相分離

2.細(xì)胞破碎，分離胞內(nèi)產(chǎn)物

3.初步純化（提取）：除去與產(chǎn)物性質(zhì)差異很大的雜質(zhì)

4.高度純化（精制）：除去與產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜質(zhì)

5.產(chǎn)品加工二、過程概述（一）預(yù)處理和固液分離預(yù)處理：目的——改變發(fā)酵液性質(zhì)，有利于固液分離。酸化降低發(fā)酵液粘度加熱

加絮凝劑使細(xì)胞或大分子聚結(jié)成較大顆粒2.固液分離主要方法是過濾和離心。板框壓濾機(jī)過濾加助濾劑（常用硅藻土等）鼓式真空過濾機(jī)離心：含固形物較多的發(fā)酵液用傾析式離心機(jī)傾析式離心機(jī)的結(jié)構(gòu)

1發(fā)酵液2固形物出口3送料的中空驅(qū)動軸4固形物

5螺旋輸送器6液體出口處7主驅(qū)動軸（二）細(xì)胞破碎（欲提取的產(chǎn)物存在于細(xì)胞內(nèi)）

機(jī)械法物理法化學(xué)法生物法（酶解）1.機(jī)械法

1）液體剪切：攪拌、勻漿。

2）固體剪切：研磨，珠磨，搗碎。2.物理法

1）超聲波破碎法。

2）滲透壓突變法：高滲（蔗糖，高鹽等）平衡后迅速轉(zhuǎn)入低滲溶液或水中。

3）凍融法：反復(fù)低溫冰凍，室溫融化。3.化學(xué)法

應(yīng)用各種化學(xué)試劑與細(xì)胞膜作用，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變或破壞。

（1）有機(jī)溶劑處理：破壞膜磷脂結(jié)構(gòu)，常用丙酮、丁醇、氯仿等。（2）表面活性劑處理：常用非離子型表面活性劑，如TritonX-100，Tween等。4.酶解法（enzymaticlysis）

外加酶法根據(jù)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成特點(diǎn)，選用適當(dāng)?shù)拿浮?/p>

自溶法（autolysis）

細(xì)胞結(jié)構(gòu)在本身具有的各種水解酶作用下發(fā)生溶解的現(xiàn)象。細(xì)胞對破碎方法的敏感性細(xì)胞聲波機(jī)械滲透壓凍融————————————————————動植物++++++++++++革蘭氏陰性菌++++++++革蘭氏陽性芽孢菌

++++++酵母++++革蘭氏陽性球菌+-++菌絲-++-++孢子

----工業(yè)上大規(guī)模細(xì)胞破碎一般采用機(jī)械法高壓勻漿器（利用冷凍擠壓原理制成）球磨機(jī)細(xì)胞碎片分離方法離心雙水相萃取（三）提取

1.沉淀法（1）等電點(diǎn)沉淀法(isoelectricprecipitation)

氨基酸（兩性電解質(zhì)）在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低。較少單獨(dú)使用，多與其它方法聯(lián)合使用（如鹽析法、有機(jī)溶劑法），因蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)仍有一定的溶解度。

谷氨酸分子中有兩個(gè)羧基和一個(gè)堿性氨基，溶于水后呈離子狀態(tài)。離子態(tài)GA+GA±GA–GA=pH23.227.0>12

等電點(diǎn)（2）不溶性鹽沉淀法某些代謝產(chǎn)物在一定pH下，能與酸、堿或金屬離子等形成不溶性鹽沉淀析出，再用適當(dāng)方法使復(fù)合物溶解。鋅鹽法：提取谷氨酸鈣鹽法：提取檸檬酸單寧：提取酶（3）有機(jī)溶劑沉淀法試劑：丙酮、乙醇、甲醇等親水溶劑原理：降低水的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)分子間靜電引力增大，導(dǎo)致聚集沉淀。蛋白質(zhì)的溶劑化，與蛋白質(zhì)爭奪水化水，使蛋白質(zhì)溶解度降低。乙醇沉淀多糖：在較高的醇濃度下，降低多糖分子與水之間的親和力，使多糖分子之間相互結(jié)合形成沉淀。2.色譜分離法色譜法也稱層析法，是1903年俄國植物學(xué)家MichaelTswett發(fā)現(xiàn)并命名的。將植物色素溶液通過裝有CaCO3

吸附劑的柱子，然后用石油醚淋洗，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開。

色譜起源色譜組分色素石油醚碳酸鈣顆粒

用色彩（chroma）和圖譜（graphs）組成色譜一詞（Chromatography)。（1）吸附層析（adsorptionchromatography）

原理

利用吸附劑對組分吸附能力的差異進(jìn)行分離。通過范德華力、靜電引力、疏水作用等與待分離物質(zhì)的極性官能團(tuán)作用。

常用吸附劑:

活性炭、氧化鋁、碳酸鈣、磷酸鈣（羥基磷灰石）、硅膠等。（2）離子交換層析（ionexchangechromatography）20世紀(jì)初期，工業(yè)上利用天然的無機(jī)離子交換劑泡沸石來軟化硬水。泡沸石的化學(xué)成分為硅鋁酸鹽(Na2A12Si4O12·nH2O)，與水接觸時(shí)，其中的Na+與水中的Ca2+、Mg2+發(fā)生交換作用：Na2Z+Ca2+＝CaZ+2Na+，使水軟化。但這類無機(jī)離子交換劑的交換能力低，化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度差，應(yīng)用受到很大限制。近年來合成的有機(jī)離子交換劑——離子交換樹脂，克服了無機(jī)離子交換劑的缺點(diǎn)而得到了廣泛應(yīng)用。原理:根據(jù)待分離物質(zhì)帶電性質(zhì)不同的分離純化方法。即：離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交換。

離子交換劑：離子交換劑由載體、電荷基團(tuán)和反離子構(gòu)成。

如羧甲基纖維素離子交換劑組成纖維素—O—CH2—COO-—Na+

載體電荷基團(tuán)反離子

疏水性：化學(xué)原料合成：樹脂類物質(zhì)載體親水性：天然材料制成：cellulose、sephadex

陽離子交換劑:電荷基團(tuán)（一）,反離子（＋）電荷基團(tuán)陰離子交換劑:電荷基團(tuán)（＋）,反離子（－）

離子交換親和力

樹脂對離子親合力的大小，與離子的半徑大小和帶電荷的多少有關(guān)。1.平衡階段:離子交換劑與反離子結(jié)合。2.吸附階段：樣品與反離子進(jìn)行交換。3、4.解吸附階段：用梯度緩沖液洗脫，先洗下弱吸附物質(zhì)，后洗下強(qiáng)吸附物質(zhì)。5.再生階段：用原始平衡液進(jìn)行充分洗滌，即可重復(fù)使用。12345原始緩沖溶液的反離子樣品溶液梯度濃度Ion-exchangechromatography

氨基酸的分離(陽離子交換樹脂)

用pH遞增的檸檬酸鹽緩沖溶液洗脫側(cè)鏈pKa增大的氨基酸3.萃取法

（1）雙水相萃取技術(shù)

(two-aqueousphaseextraction)

又稱水溶液兩相分配技術(shù)（partionoftwoaqueousphasesystem）

用兩種不相溶的親水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran）進(jìn)行萃取。由于形成的兩相均有很高的含水量（達(dá)70%?90%），故稱“雙水相”系統(tǒng)。

幾種典型的雙水相系統(tǒng)聚丙二醇聚乙二醇、聚乙烯醇葡聚糖（Dex）羥丙基葡聚糖聚乙二醇（PEG）葡聚糖（Dex）硫酸葡聚糖鈉鹽聚丙烯乙二醇羧基甲基葡聚糖鈉鹽甲基纖維素聚乙二醇（PEG）

磷酸鉀、硫酸銨硫酸鈉、硫酸鎂a雙節(jié)線系線b雙節(jié)線均相區(qū)均相區(qū)兩相區(qū)兩相區(qū)系線臨界點(diǎn)PEG/Dx和PEG/KPi系統(tǒng)的典型相圖

優(yōu)點(diǎn)：可直接從細(xì)胞破碎勻漿液中萃取蛋白質(zhì)而無需將細(xì)胞碎片分離，一步操作可達(dá)到固液分離和純化兩個(gè)目的。應(yīng)用

胞內(nèi)酶的提取和精制:

除去細(xì)胞碎片，避免了高粘度的細(xì)胞勻漿液進(jìn)行固液分離的困難。（2）超臨界流體萃?。⊿upercriticalF1uidExtraction,SFE）兼有蒸餾和溶液萃取的特征，與常規(guī)溶劑萃取的區(qū)別:將超臨界流體作為萃取劑。超臨界流體(supercriticalfluid，SCF）：超過氣液共存時(shí)的最高壓力和最高溫度下物質(zhì)特有的點(diǎn)——臨界點(diǎn)后的流體。原理：

SFE是利用SCF作為萃取劑，從液體和固體中萃取出特定成分，以達(dá)到某種分離的目的。臨界點(diǎn)的概念可用臨界溫度和臨界壓力解釋：臨界溫度：高于此溫度時(shí)，無論加壓多大也不能使氣體液化。臨界壓力：在臨界溫度下，液化氣體所需要的壓力。SCF性質(zhì)介于液體和氣體之間：1)SCF密度接近于液體，溶解度高。2)SCF粘度和