實驗十二原生質體的分離、

融合與培養(yǎng)

指導教師：唐穎1.實驗目的了解植物原生質體分離、融合和培養(yǎng)的基本原理。掌握植物原生質體分離、融合和培養(yǎng)的基本過程。2.實驗原理概述物原生質體融合和培養(yǎng)在理論和實踐上都有很大的意義，它是植物同源、異源多倍體獲得的途徑之一，可望成為作物改良的有力工具之一。植物原生質體是除去細胞壁后為原生質所包圍的“裸露細胞”，是開展基礎研究的理想材料。其中酶解法分離原生質體是一個常用的技術，其原理是植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶能降解細胞壁成分，除去細胞壁。原生質融合許多化學、物理學和生物學方法可誘導原主質體融合，現(xiàn)在被廣泛采用并證明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法、高Ca高pH法和電融合法：PEG作為一種高分子化合物，20～50％的濃度能對原生質體產(chǎn)生瞬間沖擊效應，原生質體很快發(fā)生收縮與粘連，隨后用高Ca高pH法進行清洗．使原生質體融合得以完成。PEG誘導融合的機理：PEG由于含有醚鍵而具負極性，與水、蛋白質和碳水化合物等一些正極化基團能形成氫鍵，當PEG分子足夠長時，可作為鄰近原生質表面之間的分子橋而使之粘連。PEG也能連接Ca2+等陽離子，Ca2+可在一些負極化基團和PEG之間形成橋，因而促進粘連。在洗滌過程中，連接在原生質體膜上的PEG分子可被洗脫．這樣將引起電荷的紊亂和再分布．從而引起原生質體融合：高Ca高pH由于增加了質膜的流動性，因而也大大提高了融合頻率，洗滌時的滲透壓沖擊對融合也可能起作用。原生質體融合后培養(yǎng)原生質體分離純化或融合后，在適當?shù)呐囵B(yǎng)基上應用合適的培養(yǎng)方法，能夠再生細胞壁，并啟動細胞持續(xù)分裂，直至形成細胞團，長成愈傷組織或胚狀體，再分化發(fā)育成苗。其中，選擇合適的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法是原生質體培養(yǎng)中最基礎也是最關鍵的環(huán)節(jié)。3.實驗材料、用品實驗材料：黃瓜種子。實驗用品：

①實驗器具：三角瓶、離心管、燒杯、200目濾網(wǎng)、解剖刀、長、短鑷子、培養(yǎng)皿、濾紙、0.2μm濾膜、濾器、培養(yǎng)瓶、臺式離心機、高壓滅菌鍋、倒置顯微鏡、超靜工作臺。

②試劑：(1)酶液(2)PEG融合液(3)13％CPW洗液1％纖維素酶1％果膠酶0.7mol/L甘露醇0.7mmol/LKH2PO4

10mmol/LCaCl2·2H2OpH6.8—7.040%PEG(MW1500-6000)0.3mol/L葡萄糖3.5mmol/LCaCl2·2H2O0.7mm0l/LKH2PO427．2mg／LKH2PO4101.0mg／LKNO31480．0mg／LCaCl2·2H2O246．0mg／LMgSO40．16mg／LKI0．025mg／LCuSO413％W／V甘露醇pH6.0(4)20％蔗糖溶液(5)黃瓜種子萌發(fā)與生根培養(yǎng)基（固體）：1/2MS（注：MS無機成份減半，蔗糖0.2%,瓊脂0.7%）(6)黃瓜原生質體形成愈傷組織培養(yǎng)基(固體和液體)：MS+0.05mg/LNAA+1mg/LBA(7)黃瓜原生質體愈傷組織分化培養(yǎng)基(固體)：MS+5mg/LNAA(8)無菌蒸餾水(9)0.1%HgCl24.實驗步驟溶液及培養(yǎng)基的配制

黃瓜無菌苗的培養(yǎng)精選飽滿的黃瓜種子，浸種20～30min后，用0.1%HgCl2表面消毒8～10min，無菌水洗滌4～5次，剝皮，種子接入1/2MS培養(yǎng)基中。置于溫度25±2℃，光照度1000Lx,光照14～16h/d的條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)時間約1周。原生質體的分離取黃瓜無菌苗子葉，切成薄片后，置于酶液中和搖床上（60～70rpm），在25～28℃黑暗條件下，酶解5～7h,用200目網(wǎng)過濾除去未完全消化的殘渣。在1000rpm條件下離心5分鐘，棄上清。加入3～4mll3％CPW洗液，相同條件下離心2-5分鐘，棄上清，留1ml洗液。用滴管將混有原生質體的1ml洗液吸也，輕輕鋪于20％蔗糖溶液上(5ml離心管裝3m120％蔗糖溶液)，在1000rpm條件下離心5—10分鐘，由于密度梯度離心的作用，生活力強狀態(tài)好的原生質體漂浮在20％的蔗糖與13％CPW之間，破碎的細胞殘渣沉入管底。用200μl移液器輕輕將狀態(tài)好的原生質體吸出(注意盡可能不要吸入下層的蔗糖溶液)，放入另一干凈的離心管中．加4mll3％CPW洗液，1000rpm離心2-5分鐘，棄上清．用血球計數(shù)板調整原生質體密度為105一106/ml之間。原生質體融合將1-2滴原生質體混合物（密度分別為105一106/ml）滴入小培養(yǎng)皿，靜置8—10分鐘。相對方向加入2滴40％的PEG溶液，靜置10分鐘，依次間隔5分鐘加入0.5ml、1ml和2ml含13％甘露醇的CPW洗液洗滌，注意在第二、三次洗液加入前，用移液器輕輕吸走部分溶液，但不能吸干，否則原生質體破碎死亡；最后用液體培養(yǎng)基洗l一2次即可進行培養(yǎng)：觀察兩種原生質體加入PEG融合液后，只發(fā)生粘連，在洗滌過程中才發(fā)生膜融合．核融合通常于融合體第一次有絲分裂過程中發(fā)生。培養(yǎng)將原生質體或融合體懸液鋪于愈傷組織誘導培養(yǎng)基（固體）上進行淺層培養(yǎng)，在溫度25±2℃，光照度1000Lx,光照14～16h/d的條件下培養(yǎng)，經(jīng)1-2個月后在培養(yǎng)基上出現(xiàn)肉眼可見的細胞團。細胞團長到2～4mm左右，