一種鼻咽癌篩查的新方法

溫鑫編寫1《鼻咽部上皮細(xì)胞穩(wěn)定性檢測(cè)技術(shù)》鼻咽部滲液細(xì)胞游離亞鐵原卟啉檢測(cè)2

鼻咽癌在醫(yī)學(xué)上也稱鼻腔癌，在人的鼻腔之后，有一個(gè)腔道，通常稱之為“鼻咽腔”。凡是生長(zhǎng)在此處粘膜上的惡性腫瘤，一律稱之為鼻咽癌。34好發(fā)部位

鼻咽頂后壁咽隱窩5粘膜下型鼻咽癌：鼻咽頂后壁及側(cè)壁見(jiàn)一彌漫隆起的腫物。6結(jié)節(jié)型鼻咽癌：右側(cè)咽隱窩的結(jié)節(jié)狀鼻咽癌，腫物較大，擋住右后鼻孔，但未侵犯鼻腔。7結(jié)節(jié)型鼻咽癌8

菜花型鼻咽癌：右半腔菜花型鼻咽癌伴壞死9

浸潤(rùn)型鼻咽癌：右側(cè)局限性浸潤(rùn)型癌10

混合型鼻咽癌：結(jié)節(jié)+浸潤(rùn)+潰瘍壞死1112

鼻咽癌是中國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之中的一種，死亡率在癌癥中排第8位?？蓮娜澜绶秶鷣?lái)看，中國(guó)鼻咽癌的發(fā)病率卻居世界之冠，據(jù)世界衛(wèi)生組織的調(diào)查顯示說(shuō)明，世界上80%的鼻咽癌發(fā)生在中國(guó)。我國(guó)鼻咽癌的死亡率占全國(guó)惡性腫瘤死亡率的2.81%，總發(fā)病率約占全世界的80%之多，年發(fā)病率為10~25/10萬(wàn)，而全世界平均年發(fā)病率在1/10萬(wàn)以下；其男女發(fā)病之比約為2.5：1。13NPC發(fā)病率全國(guó)分布圖14

在所有的惡性腫瘤中，鼻咽癌的治療效果是比較好的。第一期的患者只要得到及時(shí)治療，五年生存率可高達(dá)80%以上；即使是中晚期的鼻咽癌病人，只要未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，五年生存率亦可達(dá)70%以上，有些患者可生存20年、30年甚至相當(dāng)于正常壽命。15

由于鼻咽癌病因尚未完全清楚，無(wú)法進(jìn)行一級(jí)預(yù)防，因此寄希望于二級(jí)預(yù)防，即早發(fā)現(xiàn)、早診斷與早治療。鼻咽癌的預(yù)后與分期密切相關(guān)。粗略估計(jì)，鼻炎癌病人發(fā)現(xiàn)時(shí)的臨床分期能夠降低一期，則總的5年生存率可以提高20%。另外，早期治療相對(duì)簡(jiǎn)單，費(fèi)用低，生存質(zhì)量也高。因此，提高鼻咽癌的早診率是提高生存率的關(guān)鍵因素之一。16

為加強(qiáng)我國(guó)癌癥的預(yù)防與控制工作，落實(shí)《中國(guó)癌癥預(yù)防與控制規(guī)劃綱要》（２００４—２０１０）的工作目標(biāo)，在中央財(cái)政支持下，衛(wèi)生部在2007年組織制定了《鼻咽癌早診早治項(xiàng)目技術(shù)方案》，決定在部分省、直轄市開(kāi)展癌癥早診早治項(xiàng)目。17

目前，國(guó)內(nèi)外鼻咽癌診斷方法有：EB病毒殼抗原（VCA）血清學(xué)檢查、血清EB病毒多種抗體檢測(cè)、間接鼻咽鏡、鼻咽纖維鏡、間接鼻咽鏡活檢、直接鼻咽纖維鏡活檢鼻和咽細(xì)針穿刺活檢。另外還有鼻咽及頸部MRI掃描和CT掃描。以上檢查方法操作繁瑣，不適于大規(guī)模篩查。因此，研發(fā)敏感性高、特異性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)便捷的鼻咽癌篩查技術(shù)非常迫切。18

使用《鼻咽部上皮細(xì)胞穩(wěn)定性檢測(cè)技術(shù)》進(jìn)行鼻咽癌臨床篩查，在鼻咽部上皮細(xì)胞異常增生及癌變起始階段即可顯示陽(yáng)性結(jié)果，能發(fā)現(xiàn)早期病人，精準(zhǔn)度高。該技術(shù)無(wú)采樣創(chuàng)傷、無(wú)采樣漏診、無(wú)需儀器設(shè)備和專業(yè)實(shí)驗(yàn)室，可用于經(jīng)濟(jì)條件較弱的人群。該法操作簡(jiǎn)單，經(jīng)費(fèi)投入低，適合于大規(guī)模鼻咽癌普查活動(dòng)。19

《鼻咽部上皮細(xì)胞穩(wěn)定性檢測(cè)技術(shù)》是通過(guò)檢測(cè)鼻咽部滲液中是否含有細(xì)胞游離亞鐵原卟啉（CellsFreeFerrousProtoporphyrinFH）而了解鼻咽部細(xì)胞是否癌變的一種檢測(cè)技術(shù)。20

細(xì)胞游離亞鐵原卟啉是鼻咽癌發(fā)生過(guò)程中產(chǎn)生的因果性生物標(biāo)志因子。FH是含亞鐵原卟啉蛋白的分解產(chǎn)物。FH具有強(qiáng)氧化作用，導(dǎo)致細(xì)胞自穩(wěn)調(diào)節(jié)功能紊亂。

FH含量具有連續(xù)可測(cè)量性，且與細(xì)胞癌變程度呈密切正相關(guān)。采用直接生物學(xué)介質(zhì)（鼻咽部滲液）進(jìn)行靶向定位檢測(cè)，即可顯示鼻咽細(xì)胞惡變過(guò)程。21

諾貝爾獎(jiǎng)獲得者德國(guó)生物化學(xué)家?jiàn)W托.海因里希.瓦博格（OttoHeinnichWarburg）發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的耗糖速度是正常細(xì)胞的10倍，卻僅產(chǎn)生1/10的能量。腫瘤細(xì)胞主要通過(guò)磷酸戊糖途徑產(chǎn)能，使即便在有氧情況下有氧氧化過(guò)程也不能對(duì)糖酵解產(chǎn)生抑制，這稱為瓦博格氏效應(yīng)（Warburgeffect）。

以6-磷酸葡萄糖開(kāi)始，在6-磷酸葡萄糖脫氫酶催化下形成6-磷酸葡萄糖酸，進(jìn)而代謝生成以磷酸戊糖為中間代謝物的過(guò)程，稱為磷酸戊糖途徑，簡(jiǎn)稱PPP途徑。反應(yīng)部位：胞漿

重要反應(yīng)產(chǎn)物：NADPH、5-磷酸核糖

限速酶（啟動(dòng)因子）：6-磷酸葡萄糖脫氫酶23

6-磷酸葡萄糖脫氫酶的活性與抑癌基因p53有關(guān)。p53基因因編碼一種分子質(zhì)量為53kDa的蛋白質(zhì)而得名，是一種抑癌基因。一旦p53基因發(fā)生突變，P53蛋白失活，細(xì)胞分裂失去節(jié)制，發(fā)生癌變。24

在正常情況下,p53與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶相結(jié)合,抑制它的活性，阻止磷酸戊糖途徑進(jìn)行,細(xì)胞中的葡萄糖主要通過(guò)三羧酸循環(huán)產(chǎn)生能量。

在p53發(fā)生突變或缺失的腫瘤細(xì)胞中,失去了對(duì)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的抑制,該酶作為戊糖磷酸途徑的啟動(dòng)因子，使葡萄糖通過(guò)戊糖磷酸途徑代謝。1、耗能；2、產(chǎn)生大量還原型輔酶Ⅱ（NADPH）,進(jìn)行生物合成；3、改變細(xì)胞微環(huán)境。

致癌因素阻抑蛋白p53葡萄糖-6-磷酸脫氫酶P53突變突變的p53葡萄糖-6-磷酸脫氫酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶激活啟動(dòng)因子葡萄糖戊糖磷酸代謝途徑TACNADPH果糖-6-磷酸3-磷酸甘油醛二氧化碳抑制瓦博格氏效應(yīng)2728

細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的變化在很大程度上受到GSH/GSSG的影響，它是機(jī)體的主要內(nèi)源性氧化-還原調(diào)控因子，其-SH和-S-S-間的轉(zhuǎn)換調(diào)控著許多生物大分子的活性，被稱為“分子開(kāi)關(guān)”。29

Warburg效應(yīng)形成的細(xì)胞微環(huán)境紊亂

低氧（氧穩(wěn)態(tài)紊亂）

酸性環(huán)境（酸堿平衡紊亂）

還原性狀態(tài)（氧化-還原平衡紊亂）

FH位于細(xì)胞含亞鐵原卟啉蛋白的肽鏈靠近表面的一個(gè)疏水核內(nèi)，它主要依靠Fe2+與F8His的咪唑氮配位而掛在Pr鏈上。但是它之所以能固定在蛋白質(zhì)的固定位置上而且取向一定，主要是因?yàn)檫€有大約21個(gè)殘基逼近FH，距離在4A°之內(nèi)，這些殘基中有60多處與FH比較靠近，可以發(fā)生極性與非極性的相互作用，足以保持FH在細(xì)胞蛋白中的位置。

FH的極性部分丙酸基側(cè)鏈伸向親水的表面，在生理pH下解離成負(fù)離子，在α鏈中，有一個(gè)丙酸基與CD3His相連；在β鏈中，F(xiàn)H的兩個(gè)丙酸基分別與CD3Ser和E10Lys相連。FH與肽鏈之間的靜電引力對(duì)于維持FH在細(xì)胞含亞鐵原卟啉蛋白中的位置有很大作用。

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶以還原型谷胱甘肽(GSH)作為供氫體來(lái)分解H2O2，生成氧化型谷胱甘肽(GSSG)，使細(xì)胞內(nèi)GSH:GSSG的比率下降。GSH生成GSSG過(guò)程中形成腫瘤細(xì)胞的低氧狀態(tài)，激活氧感受器和缺氧信號(hào)傳導(dǎo)通路。34

氧感受器分子導(dǎo)致蛋白質(zhì)的巰基由氧化型向還原型轉(zhuǎn)變，促使缺氧特異性轉(zhuǎn)錄因子-低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-induciblefactor；HIF）

HIF-1a的磷酸化并與HIF-1b結(jié)合而形成一個(gè)完整的HIF-1轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，從而與相應(yīng)靶基因上的缺氧反應(yīng)元件(HRE)結(jié)合，促進(jìn)基因的表達(dá).并通過(guò)第二信使-活性氧族(ROS)與激酶系統(tǒng)發(fā)生聯(lián)系，激活下游酶系統(tǒng)。35

細(xì)胞在代謝過(guò)程中通過(guò)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生產(chǎn)生一系列活性氧族（reactiveoxygenspecies,ROS），包括：O2-、H2O2及HO2·、·OH等。ROS可雙向調(diào)控細(xì)胞的凋亡和增殖，機(jī)體內(nèi)的自由基通過(guò)其濃度調(diào)節(jié)著機(jī)體細(xì)胞的生死平衡，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的激活以及對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)。36

由于瓦格博效應(yīng)，在低氧誘導(dǎo)因子（hypoxiainduciblefactor，HIF）的介導(dǎo)下，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）mRNA轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定性增加，且VEGF受體表達(dá)上調(diào)，VEGF的生物學(xué)效應(yīng)增強(qiáng)。其表達(dá)的結(jié)果是增加血管分支形成,增強(qiáng)血流量。

37

HIF-1a、ROS、VEGF表達(dá)上調(diào)，使一種親脂性物質(zhì)（Hydrophilicfattymolecules）進(jìn)入細(xì)胞含亞鐵原卟啉蛋白疏水核內(nèi)，它所帶的負(fù)電荷中和了肽鏈上His、Lys所帶的正電荷，使它們不再與FH丙酸基側(cè)鏈保持靜電吸引，從而使FH在細(xì)胞蛋白中脫落。

瓦博格效應(yīng)NADPH增加GSH增加激活氧感受器和缺氧信號(hào)傳導(dǎo)通路缺氧特異性轉(zhuǎn)錄因子HIF-1a活性增強(qiáng)激活第二信使-ROS與激酶系統(tǒng)EPO基因表達(dá)水平升高NADPH氧化酶H2O2下降cGMP抑制激活鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶VEGF表達(dá)上調(diào)血紅素氧合酶及NOS活性抑制內(nèi)源性CO及NO下降FH釋放39

代謝改變

HIF-1

VEGF不典型增生癌前病變?cè)话┙?rùn)癌細(xì)胞增生

形態(tài)學(xué)改變低氧、還原態(tài)

ROS瓦博格效應(yīng)

α鏈CD3His

β鏈CD3Ser、E10Lys酶蛋白

FH

p53等基因突變

致癌因素

Hfm細(xì)胞高增生低凋亡低分化低氧代謝通路致癌因素細(xì)胞能量代謝重編程細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂細(xì)胞形態(tài)紊亂細(xì)胞功能紊亂氧穩(wěn)態(tài)紊亂酸堿平衡紊亂氧化-還原態(tài)平衡紊亂細(xì)胞周期功能紊亂線粒體功能紊亂囊泡運(yùn)輸功能紊亂表型遺傳修飾機(jī)制紊亂細(xì)胞對(duì)稱分裂抑制機(jī)制紊亂干細(xì)胞不對(duì)稱分裂機(jī)制紊亂細(xì)胞癌變瓦博格氏效應(yīng)41

采用一種脂溶性較強(qiáng)的物質(zhì)，使之很容易進(jìn)入細(xì)胞與細(xì)胞器中，其與FH物質(zhì)的氧化-還原產(chǎn)物使上皮細(xì)胞內(nèi)含有的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶等酶染色。作為篩查手段，觀察鼻咽部滲液上皮細(xì)胞中FH物質(zhì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)酶的染色情況，即可顯示鼻咽部上皮細(xì)胞是否存有惡變及其程度。因細(xì)胞內(nèi)酶的差異，同一含量FH顯色可能略有不同。43

【判定標(biāo)準(zhǔn)】

一、陰性(細(xì)胞游離亞鐵原卟啉含量低于0.5ng/ml）：不變色。二、弱陽(yáng)性(細(xì)胞游離亞鐵原卟啉含量0.5~5ng/ml）：無(wú)色變?yōu)榈{(lán)色或黃綠色。三、陽(yáng)性(細(xì)胞游離亞鐵原卟啉含量5~200ng/ml）：藍(lán)綠色或藍(lán)色。

四、強(qiáng)陽(yáng)性(細(xì)胞游離亞鐵原卟啉含量200ng/ml以上）：深藍(lán)色五、若標(biāo)本即刻顯深藍(lán)色后轉(zhuǎn)為深黃色或棕紅色，表明標(biāo)本內(nèi)內(nèi)混有血液，亦應(yīng)視為強(qiáng)陽(yáng)性。即刻顯深藍(lán)色是FH的征象，轉(zhuǎn)為深黃色或棕紅色是血液的征象。46

技術(shù)特色1、細(xì)胞游離亞鐵原卟啉是一種因果性生物標(biāo)志因子，是細(xì)胞穩(wěn)定性失調(diào)、腫瘤發(fā)生過(guò)程細(xì)胞代謝變化的必然產(chǎn)物。因而用以檢測(cè)鼻咽癌敏感度高。2、本技術(shù)采用直接生物