第七章細(xì)胞培養(yǎng)和反應(yīng)動(dòng)力學(xué)1/13/20231教學(xué)時(shí)數(shù)：8學(xué)時(shí)教學(xué)目的與要求：能說出分批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)的定義，并比較它們的優(yōu)缺點(diǎn)及使用范圍，并分別進(jìn)行簡(jiǎn)單的動(dòng)力學(xué)分析；能說出動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)、工程菌培養(yǎng)的特點(diǎn)及培養(yǎng)方法，會(huì)選擇合適的培養(yǎng)基。教學(xué)重點(diǎn)：分批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)的適用范圍及動(dòng)力學(xué)分析；教學(xué)難點(diǎn)：分批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)的動(dòng)力學(xué)分析。1/13/20232反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的概念

主要是研究各種環(huán)境因素與微生物代謝活動(dòng)的之間的相互作用隨時(shí)間而變化的規(guī)律。用數(shù)學(xué)的模型定量地描述生物反應(yīng)過程中影響細(xì)胞生長(zhǎng)、基質(zhì)利用和產(chǎn)物生成的各種因素。有關(guān)的研究可為生物反應(yīng)過程的控制、小型試驗(yàn)數(shù)據(jù)的放大和提高反應(yīng)過程的產(chǎn)物得率等提供理論依據(jù)。

1/13/20233細(xì)胞培養(yǎng)分類按照培養(yǎng)的方式分三種類型：分批培養(yǎng)(batchculture)連續(xù)培養(yǎng)(continuousculture)

補(bǔ)料分批培養(yǎng)(fed-batchculture)1/13/20234第一節(jié)分批培養(yǎng)(batchculture)

分批培養(yǎng)又稱分批發(fā)酵，是指在一個(gè)密閉系統(tǒng)內(nèi)投入有限數(shù)量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)后，接入少量的微生物菌種進(jìn)行培養(yǎng)，使微生物生長(zhǎng)繁殖，在特定的條件下只完成一個(gè)生長(zhǎng)周期的微生物培養(yǎng)方式。分批培養(yǎng)是一種非穩(wěn)態(tài)的培養(yǎng)方法。1/13/20235微生物的生長(zhǎng)曲線在分批培養(yǎng)過程中，隨著微生物和底物、代謝產(chǎn)物的濃度等的不斷變化，微生物的生長(zhǎng)可分為停滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和死亡期四個(gè)階段。1）停滯期（適應(yīng)期）lagphase停滯期是微生物細(xì)胞適應(yīng)新環(huán)境的過程。微生物細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)基被轉(zhuǎn)移至另外一個(gè)培養(yǎng)基中，細(xì)胞需要有一個(gè)適應(yīng)過程，在該過程中，系統(tǒng)的微生物數(shù)量并沒有增加，處于一個(gè)相對(duì)的停止生長(zhǎng)的過程。接種物的生理狀態(tài)和濃度是停滯期長(zhǎng)短的關(guān)鍵。1/13/20236

2）對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(exponentialphase)

處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)速度大大加快，單位時(shí)間內(nèi)細(xì)胞的數(shù)目或重量的增加維持恒定，并達(dá)到最大。此階段生長(zhǎng)比速為常數(shù)。為縮短適應(yīng)期，常采用對(duì)數(shù)期的培養(yǎng)物做

接種物。

3）穩(wěn)定期(stationaryphase)

當(dāng)細(xì)胞停止分裂，或細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡的速率達(dá)到平衡時(shí)便出現(xiàn)穩(wěn)定期。在微生物生長(zhǎng)的穩(wěn)定期，細(xì)胞的重量基本維持穩(wěn)定，但活細(xì)胞的數(shù)量可能下降。

4）死亡期（declinephase)

培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)耗盡，代謝產(chǎn)物大量積累，細(xì)胞繁殖趨于停止，而死亡細(xì)胞越來越多，即活細(xì)胞數(shù)量顯著下降。

1/13/20237微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)（1）指數(shù)生長(zhǎng)方程：dX/dt=μXμ=(1/X)(dX/dt)或X=X0eμtlnX=μt+lnX0μ----------------生長(zhǎng)比速在非對(duì)數(shù)期時(shí)μ是不定的。在對(duì)數(shù)期時(shí)其值最大用μm表示。X------------------細(xì)胞濃度X0和X分別為t=0和t=t時(shí)的細(xì)胞濃度在工業(yè)生產(chǎn)上，也常用菌體細(xì)胞質(zhì)量加倍所需要的時(shí)間即倍增時(shí)間td來表示菌種生長(zhǎng)活力的高低，一般是用指數(shù)生長(zhǎng)期的td(td=0.693/μm)來表示。大多數(shù)工業(yè)微生物菌種的倍增時(shí)間td在1~3小時(shí)。1/13/20238（2）Monod方程

Monod提出了在特定溫度、pH值、營(yíng)養(yǎng)物類型、營(yíng)養(yǎng)濃度等條件下，微生物細(xì)胞的比生長(zhǎng)速度與限制性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度之間存在如下的關(guān)系式：μ=μmS/(Ks+S)

μm-----------最大的比生長(zhǎng)速度

S------------限制性營(yíng)養(yǎng)物的濃度

Ks-----------飽和常數(shù)

數(shù)值上等于μ=μm/2時(shí)的限制性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度，它的大小表示了微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收的親和力。Ks越大，表示微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的親和力越小，反之越大，對(duì)于許多微生物來說，一般為0.1~120mg/L或0.01~3.0mmol/L，這表示微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有較高的吸收親和力。

1/13/20239當(dāng)限制性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度S很低的時(shí)候（S<<Ks)，μ和S是線性關(guān)系，μ=(μm/Ks).S。隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度增加，比生長(zhǎng)速度也相應(yīng)的增加，

μ與S不成直線關(guān)系，當(dāng)S>>Ks時(shí)μ≈μmMonod方程與酶催化反應(yīng)的米氏方程形式上是一樣的，因?yàn)槲⑸锏纳L(zhǎng)可看作酶反應(yīng)的粗略代表。但所不同的是，米氏方程是應(yīng)用酶反應(yīng)理論推導(dǎo)得到的，而Monod方程卻是完全經(jīng)驗(yàn)得到的。將Monod方程兩邊取倒數(shù)可改寫成下列形式1/μ=1/μm+Ks/μm(1/S)以1/μ為縱坐標(biāo)，1/S為橫坐標(biāo)，作圖可得一直線。斜率為Ks/μm，截距1/μm

1/13/202310例：采用合成培養(yǎng)基，在1m3生物反應(yīng)器中進(jìn)行大腸桿菌分批培養(yǎng)，菌體的生長(zhǎng)變化可利用Monod方程描述，已知μ=0.935h-1，Ks=0.71kg/m3，基質(zhì)初始濃度為50kg/m3，菌體初始濃度X0=0.1kg/m3，YX/S=0.6kg/kg(以細(xì)胞/基質(zhì)計(jì))，求當(dāng)80%的基質(zhì)已反應(yīng)時(shí)所需的時(shí)間。1/13/202311（3）多種底物現(xiàn)象當(dāng)培養(yǎng)基中有多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)時(shí)，常表現(xiàn)出“多種底物現(xiàn)象”，即多種底物同時(shí)被利用。在分批培養(yǎng)的培養(yǎng)基中含有一種以上碳源時(shí)，一般在一段時(shí)間內(nèi)菌只能利用一種碳源；待第二種碳源開始大量利用，菌體的生長(zhǎng)速率又開始增加。這種帶有兩個(gè)生長(zhǎng)期的曲線稱為二次生長(zhǎng)曲線。在工業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中，許多常用的復(fù)合培養(yǎng)基都含有碳源或含有成分復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)物（如麩皮、豆餅粉）微生物在這樣的培養(yǎng)基中會(huì)經(jīng)歷連續(xù)的變化，難以區(qū)分開其中的各個(gè)生長(zhǎng)期。1/13/202312生長(zhǎng)抑制動(dòng)力學(xué)1）競(jìng)爭(zhēng)性抑制葡萄糖作為限制性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，加入山梨醇。2）非競(jìng)爭(zhēng)性抑制在酵母進(jìn)行酒精發(fā)酵時(shí)，產(chǎn)物酒精對(duì)酵母的生長(zhǎng)就是非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。1/13/202313產(chǎn)物形成動(dòng)力學(xué)1）物料的平衡生長(zhǎng)：dX/dt=μX-F0X-αX即細(xì)胞積累=生長(zhǎng)-移出-死亡基質(zhì)利用：-ds/dt=FiS0-μX/YX/S-QPX/YP/S-mX-F0S/V基質(zhì)積累=基質(zhì)進(jìn)料-生長(zhǎng)消耗-產(chǎn)物消耗-維持-基質(zhì)移去產(chǎn)物形成：dP/dt=QPX-F0P/V-kP產(chǎn)物積累=產(chǎn)物合成-產(chǎn)物移去-產(chǎn)物破壞F0----移出液體積流量Fi---進(jìn)料液體體積流量V---反應(yīng)器容積α---比死亡速率S0----基質(zhì)初始濃度S----基質(zhì)移出濃度m---維持系數(shù)P-----產(chǎn)物濃度k----產(chǎn)物破壞系數(shù)QP----產(chǎn)物比生產(chǎn)速率YX/S-----細(xì)胞得率YP/S-------產(chǎn)物得率1/13/202314上述三個(gè)方程對(duì)穩(wěn)態(tài)（連續(xù)培養(yǎng)）和非穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)（分批培養(yǎng)）都適用。在分批培養(yǎng)中，沒有基質(zhì)進(jìn)料，也無基質(zhì)從過程中移出，即不存在補(bǔ)料或產(chǎn)物的移出，若微生物在生長(zhǎng)過程中沒有死亡，產(chǎn)物也沒有破壞，則以上方程可以簡(jiǎn)化：菌體生長(zhǎng)：dX/dt=μX基質(zhì)利用：-ds/dt=-μX/YX/S-QPX/YP/S-mX產(chǎn)物形成：dP/dt=QPX1/13/202315產(chǎn)物形成動(dòng)力學(xué)模式產(chǎn)物的形成與微生物細(xì)胞生長(zhǎng)關(guān)系的動(dòng)力學(xué)模式有三種。1）偶聯(lián)型也叫產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)模式，產(chǎn)物的形成和菌體生長(zhǎng)是平行的。在該模式中，產(chǎn)物形成速度與生長(zhǎng)速度的關(guān)系可表示為：dP/dt=α(dX/dt)=αμXP---------產(chǎn)物濃度（g/L）α-------產(chǎn)物相對(duì)于細(xì)胞的生成速度（g產(chǎn)物/g細(xì)胞），即：YP/X在上式表示，在微生物的分批培養(yǎng)過程中，產(chǎn)物的形成速度與細(xì)胞的比生成速度成正比。因此，對(duì)于符合該模式的培養(yǎng)過程來說，要提高產(chǎn)物的形成速度就應(yīng)當(dāng)爭(zhēng)取獲得高的細(xì)胞的比生長(zhǎng)速度。如葡萄糖厭氧發(fā)酵生成乙醇，或者好氣發(fā)酵生成的中間代謝物氨基酸或維生素。1/13/2023162）非偶聯(lián)型產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)無關(guān)模式。在該模式中，產(chǎn)物形成速度與生長(zhǎng)速度無關(guān)聯(lián)，而只與細(xì)胞濃度有關(guān)，此時(shí)，細(xì)胞具有控制產(chǎn)物形成速度的組成酶系統(tǒng)，這時(shí)產(chǎn)物形成與細(xì)胞濃度的關(guān)系可表示為：dP/dt=βXβ----------非生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)的產(chǎn)物形成常數(shù)(g產(chǎn)物/g細(xì)胞.h)在生長(zhǎng)和產(chǎn)物無關(guān)聯(lián)的模式中，產(chǎn)物合成發(fā)生在生長(zhǎng)停止之后（即產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物）。大多數(shù)抗生素和微生物毒素都是非生長(zhǎng)偶聯(lián)產(chǎn)物。對(duì)于這類非生長(zhǎng)偶聯(lián)型產(chǎn)物的生物反應(yīng)來說，應(yīng)充分注意菌體在生長(zhǎng)期和產(chǎn)物形成期營(yíng)養(yǎng)的差別?？蛇m當(dāng)調(diào)配快速利用和緩慢利用的營(yíng)養(yǎng)物的比例，分別滿足不同時(shí)期菌體的不同需要。1/13/2023173）混合型產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)聯(lián)和無關(guān)聯(lián)的復(fù)合模式，也叫產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)部分關(guān)聯(lián)模式。這時(shí)產(chǎn)物的形成與細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)系可表達(dá)為：dP/dt=αμX+βX這種動(dòng)力學(xué)模式存在生長(zhǎng)和非生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)項(xiàng)，如乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)過程。實(shí)際上，此模式對(duì)任意的動(dòng)力學(xué)都是通用的，偶聯(lián)和非偶聯(lián)動(dòng)力學(xué)模式只是兩種極端形式。1/13/202318細(xì)胞群體模型1/13/202319第二節(jié)連續(xù)培養(yǎng)及其動(dòng)力學(xué)連續(xù)培養(yǎng)的概念連續(xù)培養(yǎng)又稱連續(xù)發(fā)酵，是指以一定的速度向發(fā)酵罐內(nèi)添加新鮮培養(yǎng)液，同時(shí)以相同的流速流出培養(yǎng)液，從而使發(fā)酵罐內(nèi)的液量維持恒定，使培養(yǎng)物在近似恒定下生長(zhǎng)的培養(yǎng)方法。與密閉系統(tǒng)的分批培養(yǎng)相反，連續(xù)培養(yǎng)是在開放系統(tǒng)中進(jìn)行的。它的最大特點(diǎn)是，微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)速度和代謝活性處于恒定狀態(tài)，達(dá)到穩(wěn)定高速培養(yǎng)微生物或產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物的目的。1/13/202320

連續(xù)培養(yǎng)優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：1）提供了一個(gè)微生物在恒定狀態(tài)下告訴生長(zhǎng)的環(huán)境，便于進(jìn)行微生物的代謝、生理、生化和遺傳特性的研究；2）在工業(yè)上可減少分批培養(yǎng)中每次清洗、裝料、滅菌、接種、放罐等的操作時(shí)間，提高生產(chǎn)效率。3）產(chǎn)物質(zhì)量比較穩(wěn)定；4）所需設(shè)備和投資較少，便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。缺點(diǎn)：1）在長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)過程中，微生物菌種容易發(fā)生變異，發(fā)酵過程易染菌；2）新加入的培養(yǎng)基與原有的培養(yǎng)基不易完全混合，影響培養(yǎng)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用。1/13/202321連續(xù)培養(yǎng)的類型1.均勻混合的生物反應(yīng)器（全混式，CSTR）即連續(xù)攪拌反應(yīng)器，又分為恒化器（chemostat）和恒濁器（turtitostat）兩種，前者是使培養(yǎng)液中限制性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)保持恒定，后者是使培養(yǎng)液中的細(xì)胞濃度維持恒定。恒化器主要由能維持恒定的發(fā)酵液體積的培養(yǎng)容器、新鮮培養(yǎng)基供給裝置（一般采用定量泵控制培養(yǎng)基的供給速度）和無菌的培養(yǎng)基儲(chǔ)槽等部分組成。新鮮的培養(yǎng)基由泵輸送到具有勻化裝置的培養(yǎng)容器中，同時(shí)又從培養(yǎng)容器中抽出同量的培養(yǎng)液，以使培養(yǎng)液的體積在容器內(nèi)維持恒定。恒濁器中發(fā)酵液的細(xì)胞濃度靠監(jiān)測(cè)培養(yǎng)物的光密度裝置維持恒定。這種設(shè)備很少被使用，原因是測(cè)定罐內(nèi)細(xì)胞濃度很困難。2.活塞流反應(yīng)器1/13/202322Fermentationprocess:Continuousprocess1/13/202323單罐連續(xù)發(fā)酵的動(dòng)力學(xué)單罐連續(xù)發(fā)酵的前提和假定1）在穩(wěn)定狀態(tài)下單罐連續(xù)發(fā)酵的物料平衡，各參數(shù)變化等于零。2）假定培養(yǎng)基中每一點(diǎn)濃度都沒有差別，稱為完全均勻混合或勻態(tài)。勻態(tài)是連續(xù)發(fā)酵動(dòng)態(tài)的一個(gè)重要假定，即指連續(xù)發(fā)酵過程中菌體、基質(zhì)、氧等在培養(yǎng)基中均是混合均勻。3）假定微生物完全沒有死亡（死亡比速為0）1/13/202324單罐恒流速連續(xù)發(fā)酵反應(yīng)動(dòng)力學(xué)1.稀釋速率D與菌體比生長(zhǎng)速率μ的關(guān)系（穩(wěn)態(tài)的條件）對(duì)微生物細(xì)胞作物料平衡積累=流入-流出+生長(zhǎng)-死亡dX/dt=(F/V)X0-(F/V)X+μX-αXX0,X---------分別為流入和流出發(fā)酵罐的細(xì)胞濃度（g/L）F-------------培養(yǎng)基流速（L/h）V-------------罐內(nèi)液體體積（L）對(duì)于普通單級(jí)恒化器（恒流器）而言，料液為新鮮培養(yǎng)基，X0=0;α=0則：dX/dt=(μ-F/V)X令dX/dt=0則有：μ=F/V在連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)中，F(xiàn)/V被稱為稀釋率（dilutionrate）用符號(hào)“D”表示。μ=D1/13/202325均勻混合連續(xù)發(fā)酵穩(wěn)定狀態(tài)的前提是D=μ，即稀釋率D等于比生長(zhǎng)速率μ。稀釋率D的單位同生長(zhǎng)比速的單位一樣，即為h-1，其含義為單位時(shí)間內(nèi)新進(jìn)入的培養(yǎng)基體積（F）占罐內(nèi)培養(yǎng)液總體積（V）的分?jǐn)?shù)。D的倒（1/D）用t表示，則是培養(yǎng)基在罐內(nèi)的平均停留時(shí)間。討論：1）若D<μ，則dX/dt>0，培養(yǎng)液中微生物細(xì)胞的濃度隨時(shí)間而增加。2）若D>μ，則dX/dt<0，即細(xì)胞濃度因培養(yǎng)物被“洗出”（washout）發(fā)酵罐外而減少。3）若D=μ，

dX/dt=0，細(xì)胞濃度不隨時(shí)間而變化。1/13/202326稀釋率D對(duì)菌體濃度X和基質(zhì)濃度S的影響基質(zhì)的物料平衡：積累=流入-流出-生長(zhǎng)消耗-維持消耗-產(chǎn)物消耗dS/dt=(F/V)S0-(F/V)S-μX/YX/S-mX-QPX/YP/S同生長(zhǎng)相比，細(xì)胞對(duì)限制性基質(zhì)的維持需求往往是很低的，而且產(chǎn)物形成的需求也可忽略。故在穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)（dS/dt=0），上式可簡(jiǎn)化為：D(S0-S)=μX/YX/S

，將D=μ代入得：X=YX/S(S0-S)---(1)D=μ代入到Monod方程中μ=μmaxS/(KS+S)得：D=DCS/(KS+S)--------(2)DC---------------臨界稀釋速率，代表恒化器所能運(yùn)行的最大稀釋速率。DC=μmax將（2）式整理得：S=DKS/(μmax-D)---------(3)將（3）式代入到（1）中得：X=YX/S[S0-DKS/(μmax-D)]----------------------(4)1/13/202327(4)兩邊乘以稀釋率D得：P=DX=DYX/S[S0-DKS/(μmax-D)]-----------(5)P對(duì)D求一階導(dǎo)數(shù)得：Dmax=

μm{1-[Ks/(Ks+S0)]1/2}---------------(6)Xmax1/13/2023281/13/202329例：求青霉素連續(xù)發(fā)酵的穩(wěn)定狀態(tài)下最大菌體生成速度(DX)max及此時(shí)的稀釋率Dmax，菌體濃度Xmax和基質(zhì)濃度S。已知（菌體可用Monod方程表達(dá)）S0=30g/L，YX/S=0.45，μmax=0.18h-1，Ks=1.0g/L。1/13/202330連續(xù)培養(yǎng)中的主要問題穩(wěn)定性問題連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)要求處于穩(wěn)定狀態(tài)，首先要求確保菌種的穩(wěn)定，但大規(guī)模連續(xù)培養(yǎng)過程中常出現(xiàn)菌種變異和退化的現(xiàn)象，尤其是帶有營(yíng)養(yǎng)缺陷、抗反饋突變等遺傳標(biāo)記的生產(chǎn)菌。可采用半連續(xù)發(fā)酵。無菌度問題連續(xù)培養(yǎng)周期長(zhǎng)、保持設(shè)備的密閉性以及培養(yǎng)液和空氣的無菌度更為嚴(yán)格?？稍诎l(fā)酵掖中加入抗菌的藥物。勻態(tài)問題所謂勻態(tài)是指連續(xù)培養(yǎng)要求菌體、基質(zhì)和產(chǎn)物都要混合均勻作為前提。對(duì)于高黏度和非牛頓醪液，更難混勻。1/13/202331控制問題連續(xù)培養(yǎng)要求各參數(shù)穩(wěn)定，整個(gè)系統(tǒng)要在最佳化的條件下進(jìn)行，才能獲得最高的產(chǎn)率和最大的生產(chǎn)能力。有些連續(xù)培養(yǎng)的最佳點(diǎn)與最壞點(diǎn)相當(dāng)接近?？梢娺B續(xù)培養(yǎng)要求精確的控制技術(shù)。放大問題1/13/202332第三節(jié)補(bǔ)料分批培養(yǎng)及其動(dòng)力學(xué)補(bǔ)料分批培養(yǎng)的概念又稱半連續(xù)培養(yǎng)，是分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)之間的一種過渡培養(yǎng)方式。它指在分批培養(yǎng)過程中，間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法。1/13/202333補(bǔ)料分批培養(yǎng)的類型按補(bǔ)料方式分：連續(xù)、不連續(xù)和多周期按補(bǔ)料速度分：快速、恒速、指速和變速按反應(yīng)器數(shù)目分：?jiǎn)渭?jí)和多級(jí)按補(bǔ)料的培養(yǎng)基分：?jiǎn)我唤M分補(bǔ)料和多組分無反饋控制補(bǔ)料和反饋控制補(bǔ)料1/13/202334補(bǔ)料分批培養(yǎng)動(dòng)力學(xué)單一補(bǔ)料分批培養(yǎng)動(dòng)力學(xué)補(bǔ)料一直到培養(yǎng)液達(dá)到額定值為止，而且在培養(yǎng)過程中不取出培養(yǎng)液。某一瞬間培養(yǎng)液細(xì)胞濃度X可用下式表示：X=X0+YX/S(S0-S)X0-----------剛接種時(shí)的細(xì)胞濃度S------------培養(yǎng)液中未被利用的限制性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度。YX/S---------細(xì)胞得率系數(shù)1/13/202335當(dāng)S=0時(shí)，細(xì)胞最終濃度以Xm表示，假定Xm>>X0，則：Xm=YX/SS0S0=YX/S/Xm如果在X=Xm時(shí)，開始以恒定速率流加培養(yǎng)基，那么D<μm

則：FS0≈μ(XV)/YX/SF----------流加培養(yǎng)基的流速X----------時(shí)間t時(shí)培養(yǎng)液中細(xì)胞濃度V----------時(shí)間t時(shí)培養(yǎng)液的體積XV--------時(shí)間t時(shí)培養(yǎng)液中的細(xì)胞總量1/13/202336分批補(bǔ)料培養(yǎng)進(jìn)行補(bǔ)加培養(yǎng)基，且流加培養(yǎng)基速率與底物被消耗速率相等，雖然菌體總數(shù)在不斷增加，而細(xì)胞濃度仍為一常數(shù)，這種狀態(tài)稱為半穩(wěn)定或準(zhǔn)穩(wěn)定狀態(tài)。即：dX/dt=0,dS/dt=0,μ=D的狀態(tài)，就稱為“準(zhǔn)恒定狀態(tài)”。在此狀態(tài)下：S≈DKs/(μm-D)(XV)=(XV)0+FYX/SS0tD=F/(V0+Ft)1/13/202337補(bǔ)料培養(yǎng)的特點(diǎn)與分批培養(yǎng)比較1.可解除培養(yǎng)過程中的底物抑制、產(chǎn)物的反饋抑制和葡萄糖的分解阻遏效應(yīng)。2.對(duì)于耗氧過程，可以避免在分批培養(yǎng)過程中因一次性投糖過多造成的細(xì)胞大量生長(zhǎng)、耗氧過多以至通風(fēng)攪拌設(shè)備不能匹配狀況；在某種程度上可減少微生物細(xì)胞的生成量、提高目的產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率；3.微生物細(xì)胞可被空中在一系列的過渡態(tài)階段，可用來控制細(xì)胞的質(zhì)量；并可重復(fù)某一時(shí)期細(xì)胞培養(yǎng)的過渡態(tài)，可用來理論研究。1/13/202338與連續(xù)培養(yǎng)方式比較：1.不需要嚴(yán)格的無菌條件。2.不會(huì)產(chǎn)生微生物菌種的老化和變異。3.最終產(chǎn)物濃度較高，有利于產(chǎn)物的分離。4.使用范圍廣。1/13/202339流加補(bǔ)料的控制流加補(bǔ)料的內(nèi)容和原則流加補(bǔ)料的內(nèi)容可分為補(bǔ)充生產(chǎn)菌體所需的碳源、氮源、微量元素或無機(jī)鹽以及誘導(dǎo)物等。發(fā)酵過程中流加補(bǔ)料的原則是在于控制微生物的中間代謝，使之向著有利于產(chǎn)物積累的方向發(fā)展。為此要根據(jù)微生物的生長(zhǎng)代謝、生物合成規(guī)律，利用流加補(bǔ)料的措施給予生產(chǎn)菌適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)，讓它能在生物合成階段有足夠而又不過多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供其維持正常代謝和合成產(chǎn)物的需要。1/13/202340流加時(shí)間和方式的控制流加的時(shí)間不能以簡(jiǎn)單地以時(shí)間為依據(jù)，還要根據(jù)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中碳源的種類、用量和消耗速度、發(fā)酵前期條件、菌種特性和種子質(zhì)量等因素綜合考慮。一般來說，在實(shí)際生產(chǎn)過程中常常根據(jù)殘?zhí)堑暮?、pH值或菌絲的形態(tài)變化等代謝變化來確定補(bǔ)料時(shí)間。一旦確定了補(bǔ)料時(shí)間，補(bǔ)料的方式和控制指標(biāo)也有一定的要求。流加補(bǔ)料是生產(chǎn)過程中較為靈活控制微生物中間代謝的一種措施，不同微生物或同一微生物的培養(yǎng)條件不同，控制方法也有差異，需要根據(jù)具體情況，通過實(shí)驗(yàn)確定最適的控制方法。1/13/202341第四節(jié)動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)及動(dòng)力學(xué)許多有重要價(jià)值的蛋白質(zhì)等生物物質(zhì)，必須借助于動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)來獲得。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)物疫苗：小兒麻痹疫苗、狂犬病疫苗、風(fēng)癥疫苗、腦炎疫苗、皰癥疫苗等單克隆抗體：IgG、IgM、IgA等免疫調(diào)節(jié)劑：β-細(xì)胞生長(zhǎng)因子、干擾素、白細(xì)胞活化因子、血清胸腺因子、白細(xì)胞介素等酶：尿激酶、天門冬酰胺酶、膠原酶等激素：絨膜促性腺激素、促紅細(xì)胞生成素、生長(zhǎng)激素等1/13/202342動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基：主要取自于動(dòng)物體液或從動(dòng)物組織分離提取而得，優(yōu)點(diǎn)是營(yíng)養(yǎng)成分豐富、培養(yǎng)效果良好；缺點(diǎn)是成分復(fù)雜、個(gè)體差異大、來源有限。包括生物性液體(如血清)、組織浸出液(如胚胎浸出液)、凝固劑(如血漿)等無血清培養(yǎng)基的發(fā)展。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基不能采用高溫蒸煮，而只能是采用過濾的方法除菌。1/13/202343動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)：動(dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，適應(yīng)環(huán)境能力差；生長(zhǎng)速度緩慢，易受微生物污染，培養(yǎng)時(shí)需要抗生素，且大多數(shù)哺乳動(dòng)物的細(xì)胞需附著在固體或半固體的表面才能生長(zhǎng)；對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求嚴(yán)格；大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)，不可簡(jiǎn)單地套用微生物培養(yǎng)的經(jīng)驗(yàn)。（支原體對(duì)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的威脅最大，因?yàn)槠涓腥玖?qiáng)且不易被檢出）1/13/202344動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法懸浮培養(yǎng)：用于非貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)，可用發(fā)酵罐式的細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器。貼壁培養(yǎng)：用于貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)。滾瓶系統(tǒng)、微載體系統(tǒng)。固定化培養(yǎng)：既適用于非貼壁依賴性細(xì)胞也適用于貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)。一般對(duì)于貼壁依賴性細(xì)胞通常是采用膠原包埋，而對(duì)于非貼壁細(xì)胞是采用海藻酸鈣包埋。1/13/202345培養(yǎng)方式：分批式培養(yǎng)、半連續(xù)、連續(xù)式培養(yǎng)。動(dòng)物細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)一般是采用灌注培養(yǎng)。是把細(xì)胞接種后進(jìn)行培養(yǎng)，一方面連續(xù)不斷地取出等量的培養(yǎng)液，但過程中不取出細(xì)胞，細(xì)胞仍留在反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞處于一種營(yíng)養(yǎng)不斷的狀態(tài)。1/13/2023461/13/202347植物細(xì)胞的培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng)是指在離體條件下將易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中，將組織振蕩分散成游離的懸浮細(xì)胞，通過繼代培養(yǎng)使細(xì)胞增殖來獲得大量細(xì)胞群體的方法。