混合菌的分離實驗目的1.掌握常用的分離純化微生物的方法。2.學習倒平板的方法，進一步掌握無菌操作技術。實驗原理從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物分離與純化。從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物分離與純化。在分子生物學的研究及應用中，不僅需要通過分離純化技術從混雜的天然微生物群中分離出特定的微生物，而且還必須隨時注意保持微生物純培養(yǎng)物的“純潔”，防止其他微生物的混入。本實驗將采用不同的培養(yǎng)基，通過稀釋涂布平板法和平板劃線法，從混合菌液中分離微生物。涂布平板法：做法是先將已熔化的培養(yǎng)基倒入無菌平皿，制成無菌平板，冷卻凝固后，將一定量的微生物懸液滴加在平板表面，再用無菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個平板表面，經(jīng)培養(yǎng)后挑取單個菌落。平板劃線法：是指把雜菌樣品通過在平板表面劃線稀釋而獲得單菌落的方法。一般是將混雜在一起的不同種微生物或同種微生物群體中的不同細胞，通過在分區(qū)的平板表面上作多次劃線稀釋，形成較多的獨立分布的單個細胞，經(jīng)培養(yǎng)而繁殖成相互獨立的多個單菌落。通常認為這種單菌落就是某微生物的“純種”。具體的劃線形式有多種，這里介紹一種經(jīng)過我們長期實踐并證明可獲得良好實驗效果的方法：將一個平板分成A、B、C、D4個面積不同的小區(qū)進行劃線，A區(qū)面積最小，作為待分離菌的菌源區(qū)，B和C區(qū)為經(jīng)初步劃線稀釋的過渡區(qū)，D區(qū)則是關鍵的單菌群收獲區(qū)，它的面積最大，出現(xiàn)單菌群的概率也最高。由此可知，這4個區(qū)的面積安排應做到D>C>B>A。實驗器材實驗材料:混合菌夜（大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基試劑鏈霉素、工業(yè)酒精實驗儀器:試管、涂布器、0.1-0.2ml無菌吸管、接種環(huán)，酒精燈、無菌培養(yǎng)皿、試管架、培養(yǎng)箱、超凈工作臺、記號筆、廢液缸1.配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基配方：*牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（1000ml）牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，瓊脂15-20g，水1000mL，pH7.0-7.2(后調)*馬丁氏培養(yǎng)基（1000ml）蛋白胨0.5g，葡萄糖10.0g，KH2PO41.0g，MgSO4·7H2O0.5g，瓊脂15-20g，水1000mL，pH自然*高氏一號培養(yǎng)基（1000ml）可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO4·3H2O0.5g，MgSO4·7H2O0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01g，瓊脂15-20g，水1000mL，pH7.4-7.6注意：高氏一號培養(yǎng)基配制時要將可溶性淀粉用蒸餾水調成混懸液然后在加入到熱水中，配制成淀粉漿，然后在加入其它的藥品。（1）根據(jù)實驗中培養(yǎng)基用量計算培養(yǎng)中各藥品的用量，每實驗臺（4個小組）共同配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基400ml、馬丁氏培養(yǎng)基400ml、高氏一號培養(yǎng)基400ml（2）需要準備一下物品：錐形瓶500ml3支（盛裝培養(yǎng)基，每大組）試管3支（小組，裝有蒸餾水一支9ml，另兩支4.5ml，塞好棉塞包扎）移液管1ml3支（小組）培養(yǎng)皿9套（小組）吸耳球1支（小組）

2.加熱、包扎、滅菌a.將培養(yǎng)基根據(jù)要求調pH值，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基pH7.0－7.2；馬丁氏培養(yǎng)基pH自然，加瓊脂進行加熱溶解，煮制澄清時停止加熱，每小組各分裝牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基2支，塞好棉塞，備用。b.包扎將錐形瓶3支、培養(yǎng)皿9套、盛裝蒸餾水的試管3支、裝有培養(yǎng)基的試管2支、移液管3支、吸耳球1支分別按照要求使用報紙包扎好，備用。c.滅菌將準備好的物品放入滅菌鍋中進行滅菌，121℃，25mind.倒平板將滅菌后的培養(yǎng)基冷卻55℃左右時，進行分裝。每種培養(yǎng)基分裝倒3個平板。在倒培養(yǎng)基之前將培養(yǎng)皿底部做好標記，然后無菌操作倒培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的厚度約為培養(yǎng)皿整個高度的1/3。讓培養(yǎng)基充分凝固，備用。注：滅菌物品取出之后立即將裝有培養(yǎng)基的試管擺好斜面。斜靠在玻璃棒或書本等合適的支撐物上，形成斜面，斜面長度不超過試管總長的1/2，備用。

3.混合菌夜稀釋液的制備：取混合菌夜1ml，加入盛有9ml無菌水的試管中，稀釋濃度為10-1，從濃度為10-1試管中取0.5ml稀釋液加入盛有4.5ml無菌水的試管中，以此類推，分別制成稀釋度為10-2～10-3的稀釋液。4.涂布平板法：將上述每種培養(yǎng)基平板底面標記稀釋度，然后用無菌吸管從最后三種稀釋度中即10-1、10-3試管中吸取0.1ml對號放入平板上，用玻棒涂布。5.平板劃線法a.作分區(qū)標記在皿底將整個平板分成A、B、C、D四個面積不等的區(qū)域。各區(qū)之間的交角應為120度左右（平板轉動一定角度約60度），一遍充分利用整個平板的面積，而且采用這種分區(qū)法可使D區(qū)和A區(qū)劃出的線條相平行，并可避免此兩區(qū)線條相接觸。b.劃線操作（1）用接種環(huán)挑取10-1少量混合菌夜；（2）劃A區(qū)，劃3-4條平行線（線條的多少依據(jù)挑取的菌量多少而定）。劃完A區(qū)后應立即燒掉環(huán)上的殘菌，以免因菌過多而影響后面各區(qū)的分離效果。在接種時，左手持皿底并將其覆蓋在皿蓋上方（不要放入皿蓋內），以防止雜菌污染。（3）劃其他區(qū)：將燒去殘菌后的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基邊緣冷卻一下，并使B區(qū)轉到上方，接種環(huán)通過A區(qū)（菌源區(qū)）將菌帶到B區(qū)，隨即劃數(shù)條致密的平行線。再從B區(qū)作C區(qū)的劃線。最后經(jīng)C區(qū)作D區(qū)的劃線，D區(qū)的線條應與A區(qū)平行，但話D區(qū)時切勿重新接觸A、B區(qū)，以免該兩區(qū)中濃度的菌夜帶到D區(qū)，影響單菌落的形成。隨即將皿底放入皿蓋中。燒去接種環(huán)上的菌線。6.培養(yǎng)：馬丁氏倒置培養(yǎng)于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5d，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)1-2d。實驗結果1.平板劃線法中檢查每個平板分離的結果，繪制菌苔或菌落的分布圖。2.涂布平板法中用下圖描述菌落生長情況。培養(yǎng)物生長情況（+或-）染菌情況（+或-）牛肉膏10-1牛肉膏10-3馬丁氏10-1馬丁氏10-3注意事項1.藥品稱量要符合稱量規(guī)則2.調pH值，應小心操作，避免過頭，以免回調而影響培養(yǎng)基內各離子的濃度3.加熱過程中要不斷攪拌，控制火力，防止培養(yǎng)基因暴沸而溢出或瓊脂沉淀在瓶底燒