第七章

細(xì)菌感染的檢測(cè)方法與

防治原則1張文原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室本章重點(diǎn)與難點(diǎn)細(xì)菌感染性標(biāo)本的采集原則細(xì)菌感染的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)程序常用的血清學(xué)診斷方法適應(yīng)性免疫的獲得方式人工免疫的概念和常用的免疫制劑細(xì)菌感染的治療原則2第一節(jié)細(xì)菌感染的實(shí)驗(yàn)診斷3形態(tài)學(xué)檢查可疑細(xì)菌感染血清（雙份）標(biāo)本含菌標(biāo)本直接凝集試驗(yàn)乳膠凝集試驗(yàn)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)ELISA等細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定細(xì)菌成分檢測(cè)凝集試驗(yàn)、免疫熒光技術(shù)酶免疫技術(shù)、免疫印跡試驗(yàn)等細(xì)菌培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)檢查生物試驗(yàn)、血清學(xué)鑒定動(dòng)物試驗(yàn)、藥物敏感試驗(yàn)核酸雜交、PCR16SrRNA基因序列分析基因芯片等核酸檢測(cè)抗原檢測(cè)特異性抗體檢測(cè)細(xì)菌感染的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)方法4一.臨床標(biāo)本的采集與運(yùn)送原則早期采集無菌操作選感染部位最佳時(shí)間采集雙份血清標(biāo)本采集做好標(biāo)記置于密閉容器內(nèi)盡快送檢標(biāo)本運(yùn)送5（一）細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查暗視野顯微鏡相差顯微鏡主要用于檢查在生活狀態(tài)下細(xì)菌的動(dòng)力及其運(yùn)動(dòng)情況不染色標(biāo)本二、細(xì)菌的檢測(cè)細(xì)菌的染色革蘭染色抗酸染色熒光金胺O染色其他特殊染色7革蘭染色葡萄球菌（革蘭染色陽性）大腸埃希菌（革蘭染色陰性）8細(xì)菌檢查的一般程序標(biāo)本膿/痰/尿血、腦脊液等涂片、染色、鏡檢分離培養(yǎng)純培養(yǎng)生化反應(yīng)血清學(xué)鑒定藥敏試驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)增菌(二)細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定9細(xì)菌的分離培養(yǎng)培養(yǎng)基的成分pH培養(yǎng)時(shí)間溫度氣體環(huán)境在血平板上的肺炎鏈球菌菌落10生化試驗(yàn)?zāi)c道感染細(xì)菌在含鐵雙糖培養(yǎng)基上的生化反應(yīng)11血清學(xué)鑒定利用已知的特異性抗體檢查未知的純培養(yǎng)細(xì)菌對(duì)細(xì)菌進(jìn)行種、群、型的鑒定沙門菌血清學(xué)鑒定摘自《臨床微生物檢驗(yàn)》（第五版）人民衛(wèi)生出版社12藥物敏感試驗(yàn)紙片擴(kuò)散法、稀釋法、E-test法……最低抑菌濃度（minimuminhibitoryconcentration,MIC）能夠完全抑制培養(yǎng)基中細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度最低殺菌濃度（minimumbactericidalconcentration,MBC）能夠殺死培養(yǎng)基中細(xì)菌的最低藥物濃度13紙片擴(kuò)散法含有定量抗生素的紙片貼在已接種待檢病原菌的瓊脂平板上，紙片上的抗生素向周圍瓊脂中擴(kuò)散，形成了逐漸減小的藥物濃度梯度。由于致病菌對(duì)各種抗生素的敏感程度不同，在藥物紙片周圍便出現(xiàn)抑制病原菌生長(zhǎng)而形成的大小不同的抑菌環(huán)。根據(jù)抑菌環(huán)的有無和大小來判定試驗(yàn)菌對(duì)該抗菌藥物耐藥或敏感。14稀釋法以一定濃度的抗菌藥物與含有待檢細(xì)菌的培養(yǎng)基進(jìn)行一系列不同倍數(shù)稀釋（通常為雙倍稀釋），經(jīng)培養(yǎng)后觀察其最低抑菌濃度。稀釋法瓊脂稀釋法——使用瓊脂培養(yǎng)基肉湯稀釋法——使用肉湯培養(yǎng)基15抗生素連續(xù)梯度法（E-test法）將稀釋法和擴(kuò)散法的原理相結(jié)合，使用預(yù)先設(shè)定的穩(wěn)定且連續(xù)的抗菌藥物濃度梯度，采用瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)以確定不同抗菌藥物對(duì)微生物的最低抑菌濃度（MIC）。16將培養(yǎng)基上分離的可疑致病菌配制成純菌液，放入自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)中，通過計(jì)算機(jī)自動(dòng)掃描、讀數(shù)、分析、最后報(bào)告鑒定及藥敏結(jié)果。摘自《臨床微生物檢驗(yàn)》（第五版）人民衛(wèi)生出版社17自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)藥敏檢測(cè)原理微型化的肉湯稀釋試驗(yàn)根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)得到相應(yīng)敏感度：敏感、中度敏感和耐藥微生物數(shù)碼鑒定原理計(jì)算并比較數(shù)據(jù)庫內(nèi)每個(gè)細(xì)菌條目對(duì)系統(tǒng)中每個(gè)生化反應(yīng)出現(xiàn)的頻率總和性能特點(diǎn)自動(dòng)化程度較高、檢測(cè)速度快、可鑒定細(xì)菌種類及藥敏試驗(yàn)種類多、數(shù)據(jù)處理軟件功能強(qiáng)大、結(jié)果準(zhǔn)確可靠系統(tǒng)組成測(cè)試卡（板）、菌液接種器、培養(yǎng)和監(jiān)測(cè)系統(tǒng)、數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)18（三）細(xì)菌抗原的檢測(cè)凝集試驗(yàn)用已知抗體檢測(cè)待檢標(biāo)本中未知的顆粒性抗原。IgG的Fc段與金葡菌的SPA結(jié)合，F(xiàn)ab段與細(xì)菌抗原結(jié)合后，可使金葡菌發(fā)生肉眼可見的凝集現(xiàn)象。協(xié)同凝集試驗(yàn)用已知的熒光抗體檢測(cè)待檢標(biāo)本中的未知抗原，借助熒光顯微鏡觀察。免疫熒光技術(shù)對(duì)流免疫電泳利用雙向瓊脂擴(kuò)散與電泳技術(shù)相結(jié)合的方法。由于電泳和電滲作用，抗原向正極移動(dòng)，抗體向負(fù)極移動(dòng)，在比例合適處形成肉眼可見的沉淀線。用酶標(biāo)記的抗體檢測(cè)特異性可溶性抗原的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。酶免疫技術(shù)19PCR（含RT-PCR、realtimePCR等）核酸雜交技術(shù)基因芯片技術(shù)16SrRNA基因序列分析（四）細(xì)菌核酸的檢測(cè)20（五）生物芯片技術(shù)將核酸片段、蛋白質(zhì)或酶、抗原或抗體、細(xì)胞及組織等生物樣品有序地固定于硅片、尼龍膜等固相支持物上，在一定的條件下進(jìn)行生化反應(yīng)。用化學(xué)熒光法、酶標(biāo)法或同位素法顯示反應(yīng)結(jié)果，通過特定的儀器讀取與收集數(shù)據(jù)，并用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，從而判斷樣品中靶分子的種類和數(shù)量。21三、細(xì)菌感染的血清學(xué)診斷用已知的細(xì)菌或其特異性抗原檢測(cè)病人血清或其他體液中的抗體及其效價(jià)的變化，可以作為感染性疾病的輔助診斷。由于本實(shí)驗(yàn)多采取病人血清檢測(cè)抗體，故常稱為血清學(xué)診斷（serologicaldiagnosis）。一般適用于抗原性較強(qiáng)的細(xì)菌，以及病程較長(zhǎng)的感染性疾病。也可用于調(diào)查人群對(duì)某病原菌的免疫應(yīng)答水平以及檢測(cè)疫苗接種后的預(yù)防效果。22細(xì)菌性感染的血清學(xué)診斷血清學(xué)試驗(yàn)疾病舉例直接凝集反應(yīng)肥達(dá)試驗(yàn)、外斐試驗(yàn)乳膠凝集試驗(yàn)?zāi)X膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌沉淀試驗(yàn)梅毒間接免疫熒光技術(shù)各類微生物感染補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)Q熱中和試驗(yàn)風(fēng)濕熱（抗O試驗(yàn)）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)各類微生物感染23第二節(jié)細(xì)菌感染的特異性預(yù)防24機(jī)體獲得特異性免疫力的方式自然免疫人工免疫主動(dòng)免疫：疫苗或類毒素等被動(dòng)免疫：抗毒素或丙種球蛋白等主動(dòng)免疫：隱性或顯性感染被動(dòng)免疫：獲得母體的Ab(胎盤/初乳)25一、人工主動(dòng)免疫人工主動(dòng)免疫（artificialactiveimmunization）是將疫苗或類毒素接種于人體，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，機(jī)體主動(dòng)產(chǎn)生獲得性免疫力的一種防治微生物感染的措施，主要用于特異性預(yù)防。采用人工主動(dòng)免疫方法通常稱為預(yù)防接種（prophylacticinoculation）或疫苗接種（vaccination）。特異性預(yù)防疫苗類毒素26疫苗的種類死疫苗：傷寒疫苗、霍亂疫苗活疫苗（減毒活疫苗）：卡介苗（BCG）亞單位疫苗：肺炎鏈球菌莢膜多糖基因工程疫苗載體疫苗核酸疫苗27活疫苗與死疫苗的比較區(qū)別點(diǎn)活疫苗死疫苗制品特點(diǎn)減毒或無毒的疫苗死菌，仍保持免疫原性制備方法通過非正常培養(yǎng)減毒株通過物理化學(xué)方法使病原體失活接種次數(shù)和接種量1次，量小2～3次，量大接種反應(yīng)可在體內(nèi)增殖，類似輕型感染或隱性感染在體內(nèi)不增殖，可出現(xiàn)發(fā)熱、全身或局部腫痛等反應(yīng)免疫的類型體液免疫和細(xì)胞免疫體液免疫免疫效果1～5年0.5～1年毒力回升與安全性有可能，對(duì)免疫缺陷者有危險(xiǎn)不可能，安全性好疫苗的穩(wěn)定性相對(duì)不穩(wěn)定相對(duì)穩(wěn)定保存不易保存，4℃存活2周，真空凍干可長(zhǎng)期保存易保存，4℃可保存1年以上28新型疫苗亞單位疫苗基因工程疫苗核酸疫苗重組載體疫苗29二、人工被動(dòng)免疫人工被動(dòng)免疫（artificialpassiveimmunization）是輸入含有特異性抗體的免疫血清、純化免疫球蛋白抗體或細(xì)胞因子等免疫制劑，使機(jī)體立即獲得特異性免疫力的過程，可用于某些急性傳染病的緊急預(yù)防和治療。30兩種人工免疫方法的比較區(qū)別點(diǎn)人工主動(dòng)免疫人工被動(dòng)免疫免疫物質(zhì)抗原抗體或細(xì)胞因子等接種次數(shù)1～3次1次免疫出現(xiàn)時(shí)間慢（注射后2～4w）快（注射后立即出現(xiàn)）免疫維持時(shí)間長(zhǎng)（數(shù)月～數(shù)年）短（2～3w）用途多用于預(yù)防多用于治療或緊急預(yù)防31第三節(jié)細(xì)菌感染的治療原則32主要采用抗菌藥物來治療細(xì)菌感染?？咕幬镆话闶侵妇哂袣⒕蛞志钚缘乃幬镆约坝晌⑸锖铣傻目股仡愃幬铩Ｕ_合理應(yīng)用抗菌藥物是提高療效、降低不良反應(yīng)發(fā)生率以及減少或減緩細(xì)菌耐藥性發(fā)生的關(guān)鍵。33抗菌藥物治療性應(yīng)用的基本原則診斷為細(xì)菌性感染者，方有指征應(yīng)用抗菌藥物；盡早查明感染病原，根據(jù)病原種類及細(xì)菌藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果選用抗菌藥物；按照藥物的抗菌作用特點(diǎn)及其體內(nèi)過程特點(diǎn)選擇用