量表達(dá)蛋白的操作指南第一天9：00：挑一個(gè)單克隆到1.5mlLB(K+)液體培養(yǎng)基中(試管中)，37°C,200rpm培養(yǎng)。培養(yǎng)至OD=0.6?0.8,IPTG誘導(dǎo)(3ulIPTG/支試管)，37C,200rpm培養(yǎng)2h。收菌：取5只1.5ml的EP管，每管加入1ml菌液，13000rpm，離心1min,取1管棄上清，沉淀用30~100ul10mMTris-HCl(pH8.0)溶液吹散(加入緩沖液的量視菌體量而定)，加入與緩沖液等體積的2X溴酚藍(lán)Buffer,100C煮5min，電泳。另4支管的沉淀，共用400ul10mMTris-HCl(pH8.0)溶液吹散，轉(zhuǎn)至1管中，超聲處理，超聲5秒，停5秒，超20次，功率200W,13000rpm,離心10min,取50ul上清至另一EP管，加50ul2X溴酚藍(lán)Buffer,100C煮5min,電泳，上清去除干凈后沉淀用50ul10mMTris-HCl(pH8.0)溶液吹散，加入50ul2X溴酚藍(lán)Buffer,100C煮5min,電泳。第一天10：00：接10ul保菌液到1?2mlLB(K+)液體培養(yǎng)基中，37°C,200rpm,活化菌種。17：00：接1~2ul活化的菌液到250mlLB(K+)液體培養(yǎng)基中，37C,200rpm,過夜培養(yǎng)。第二天9：00：過夜培養(yǎng)的250ml菌液與等體積LB(K+)液體培養(yǎng)基混合，37C,200rpm，培養(yǎng)至OD=0.6?0.8,IPTG誘導(dǎo)(125ulIPTG/250ml菌液)，2h后收菌。小樣收菌檢測：取5只1.5ml的EP管，每管加入1ml菌液，13000rpm,離心1min,棄上清，取1管，沉淀用50ul10mMTris-HCl(pH8.0)溶液吹散，加入50ul2X溴酚藍(lán)Buffer,100C煮5min，電泳。另4支管的沉淀，共用400ul10mMTris-HCl(pH8.0)溶液吹散，轉(zhuǎn)至1管中，超聲處理，超聲5秒，停5秒，超20次,功率200W,13000rpm，離心10min,取50ul上清至另一EP管，力口50ul2X溴酚藍(lán)Buffer,100C煮5min,電泳，上清去除干凈后沉淀用50ul10mMTris-HCl(pH8.0)溶液吹散，加入50ul2X溴酚藍(lán)Buffer,100C煮5min，電泳。大量收菌：50ml圓底離心筒，12000rpm，離心2min。棄上清，沉淀用20?30ml10mMTris-HCl(pH8.0)溶液吹散，超聲，超聲20秒，停20秒，超50次，功率400W,13000rpm，離心10min,根據(jù)小樣超聲的電泳結(jié)果決定留上清還是留沉淀(包涵體)。第一天17：00：取保菌的菌液平板劃線，37°C,過夜培養(yǎng)，活化菌種。第二天9：00：劃線的平板4C保存。15：00：挑一個(gè)單克隆接到5mlLB(K+)液體培養(yǎng)基中，37C,200rpm,過夜培養(yǎng)。第三天9：00：過夜培養(yǎng)的5ml菌液轉(zhuǎn)接到250ml的LB(K+)液體培養(yǎng)基中,37C,200rpm，培養(yǎng)至OD=0.6?0.8,IPTG誘導(dǎo)(125ulIPTG/250ml菌液)，2h后收菌。小樣收菌檢測：取5只1.5ml的EP管，每管加入1ml菌液，13000rpm,離心1min,棄上清，取1管，沉淀用50ul10mMTris-HCl(pH8.0)溶液吹散，加入50ul2X溴酚藍(lán)Buffer,100C煮5min,電泳。另4支管的沉淀，共用400ul10mMTris-HCl(pH8.0)溶液吹散，轉(zhuǎn)至1管中，超聲處理，超聲5秒，停5秒，超20次,功率200W,13000rpm,離心10min,取50ul上清至另一EP管，加50ul2X溴酚藍(lán)Buffer,100C煮5min，電泳，上清去除干凈后沉淀用50ul10mMTris-HCl(pH8.0)溶液吹散，加入50ul2X溴酚藍(lán)Buffer,100C煮5min，電泳。大量收菌：50ml圓底離心筒，12000rpm，離心2min。棄上清，沉淀用20?30ml10mMTris-HCl(pH8.0)溶液吹散，超聲，超聲20秒，停20秒，超50次，功率400W,13000rpm，離心10min,根據(jù)小樣超聲的電泳結(jié)果決定留上清還是留沉淀(包涵體)。第一天10：00：接10ul保菌液到1?2mlLB(K+)液體培養(yǎng)基中，37°C,200rpm,活化菌種。第一天17：00：接1~2ul活化的菌液到5mlLB(K+)液體培養(yǎng)基中，37C,200rpm,過夜培養(yǎng)。第二天9：00：過夜培養(yǎng)的5ml菌液轉(zhuǎn)接到250ml的LB(K+)液體培養(yǎng)基中,37C,200rpm，培養(yǎng)至OD=0.6?0.8,IPTG誘導(dǎo)(125ulIPTG/250ml菌液)，2h后收菌。小樣收菌：取5只1.5ml的EP管，每管加入1ml菌液，13000rpm,離心1min,棄上清，取1管，沉淀用50ul10mMTris-HCl(pH8.0)溶液吹散，加入50ul2X溴酚藍(lán)Buffer,100C煮5min，電泳。另4支管的沉淀，共用400ul10mMTris-HCl(pH8.0)溶液吹散，轉(zhuǎn)至1管中，超聲處理，超聲5秒，停5秒，超20次,功率200W,13000rpm,離心10min,取50ul上清至另一EP管，加50ul2X溴酚藍(lán)Buffer,100C煮5min，電泳，上清去除干凈后沉淀用50ul10mMTris-HCl(pH8.0)溶液吹散，加入50ul2X溴酚藍(lán)Buffer,100C煮5min，電泳。大量收菌：50ml圓底離心筒，12000rpm，離心2min。棄上清，沉淀用20?30ml10mMTris-HCl(pH8.0)溶液吹散，超聲，超聲20秒，停20秒，超50次，功率400W,13000rpm，離心10min,根據(jù)小樣超聲的電泳結(jié)果決定留上清還是留沉淀(包涵體)。大腸系統(tǒng)表達(dá)的包涵體蛋白小量預(yù)洗的操作指南20?30ml10mMTris-HCl(pH8.0)溶液重懸超聲離心得到的沉淀(500ml菌液所得)，取1ml于EP管中，13000rpm，離心2min。棄上清。1.2mlBufferB重懸沉淀，搖動(dòng)或靜置3h。4，13000rpm，離心2min，棄上清(上清留50ul做電泳對比)。5，1.2ml10mMTris-HCl(pH8.0)溶液重懸沉淀，13000rpm，離心2min，棄上清。6，重復(fù)5一次。7，1.2ml含2M尿素的10mMTris-HCl(pH8.0)溶液重懸沉淀，室溫靜置15min。13000rpm，離心2min，棄上清(上清留50ul做電泳對比)。8，1.2ml10mMTris-HCl(pH8.0)溶液重懸沉淀9,重復(fù)8一次。10，1.2ml含8M尿素的10mMTris-HCl(pH8.0)溶液重懸沉淀，取50ul小樣電泳。一、包涵體的純化20?30ml10mMTris-HCl(pH8.0)溶液重懸超聲離心得到的沉淀(500ml菌液所得)，12000rpm，離心10min。棄上清。20?30mlBufferB重懸沉淀，搖動(dòng)或靜置3h。3，12000rpm，離心10min，上清轉(zhuǎn)入另一管中保存(上清留50ul做電泳對比)。4，20?30ml10mMTris-HCl(pH8.0)溶液重懸沉淀，12000rpm，離心10min，棄上清。5，重復(fù)4一次。6,20~30ml含2M尿素的10mMTris-HCl(pH8.0)溶液重懸沉淀，室溫靜置30min。12000rpm，離心10min，上清轉(zhuǎn)入另一離心管中(上清留50ul做電泳對比)。7，20?30ml10mMTris-HCl(pH8.0)溶液重懸沉淀。8，重復(fù)7一次。9,先加入1?2ml的10mMTris-HCl(pH8.0)溶液重懸沉淀，再加5?10ml含8M尿素的10mMTris-HCl(pH8.0)溶液重新溶解沉淀(先加5~10ml，如溶解不好，可增加溶液體積至15~20ml),取50ul小樣電泳。10，上清和沉淀冷凍之前均需要加適量的甘油。BufferB含有：5%Triton50mMTris-HCl(pH8.0)50mM氯化鈉5mMEDTA鎳柱親和層析1，填柱，注意不能有氣泡。2,用純水洗柱，至pH7.0.(流速7)3，掛鎳，至pH2~3.(流速7)純水洗柱至pH7.0(流速7)10mMTris-HCl(pH8.0)溶液平衡鎳柱，約80ml(流速7)。含0.5M氯化鈉的10mMTris-HCl(pH8.0)溶液平衡鎳柱，約80?1OOml。(流速7)標(biāo)定紫外檢測器,A調(diào)0,T調(diào)95.8，上樣。樣品需要事先加入氯化鈉，終濃度為0.5M。注意流速要慢(3?4)。上樣結(jié)束后，用含0.5M氯化鈉的10mMTris-HCl(pH8.0)溶液洗柱，至0D很低且穩(wěn)定。(流速7)15mM咪唑0.5M氯化鈉的10mMTris-HCl(pH8.0)溶液，40ml(0.5MNaCl的10mMTris-HCl(pH8.0)溶液中加1.5M咪唑0.4ml),洗脫，收集蛋白峰。(流速7)60mM咪唑0.5M氯化鈉的10mMTris-HCl(pH8.0)溶液，40ml(0.5MNaCl的10mMTris-HCl(pH8.0)溶液中加1.5M咪唑1.6ml),洗脫，收集蛋白峰。(流速7)300mM咪唑0.5M氯化鈉的10mMTris-HCl(pH8.0)溶液，40ml(0.5MNaCl的10mMTris-HCl(pH8.0)溶液中加1.5M咪唑8ml),洗脫，收集蛋白峰。(流速7)13，拆柱，處理填料。NiSepharose6FastFlow非變性條件純化蛋白ProtocolNiSepharose6FastFlow介質(zhì)的預(yù)處理1，輕柔震蕩，使介質(zhì)均勻重懸。取1.5ml混懸液(介質(zhì)凈體積lml,)/柱，轉(zhuǎn)入15ml離心管中，2500rpm,離心5min,棄上清。加入5ml雙蒸水/柱，輕柔震蕩3min,2500rpm,離心5min,棄上清。加入5mlBufferB/柱，輕柔震蕩3min,2500rpm,離心5min,棄上清。重復(fù)4一次。加入lml/柱的BufferB,制成2ml/柱的50%的混懸液，裝柱。樣品的純化樣品(10mMTris-HCl(pH8.0)體系)溶液中加入咪唑和氯化鈉，使中體系為10mMTris-HCl(pH8.0),500mMNaCl,30mM咪唑,pH8.0。12000rpm，離心10min。留50ul小樣，電泳。樣品溶液加入層析柱,收集流出液,留小樣電泳。10mlBufferB洗柱，分別接第1ml,第6ml和第10ml，電泳10mlBufferW洗柱，分別接第1ml,第6ml和第10ml，電泳10mlBufferE洗脫，每ml接一個(gè)EP管中，第1,2,3,4,7管電泳介質(zhì)的清洗和再生1,5~10mlBufferS洗柱。5~10mlBufferB洗柱。5~10ml雙蒸水洗柱。1.0ml0.1MNiSO4過柱。5~10ml雙蒸水洗柱。5~10mlBufferB洗柱。BufferB(Bindingbuffer):10mMTris-HCl(pH8.0),500mMNaCl,30mM咪唑,pH8.0BufferW(washbuffer):10mMTris-HCl(pH8.0),500mMNaCl,100mM咪唑,pH8.0BufferE(Elutionbuffer):10mMTris-HCl(pH8.0),500mMNaCl,300mM咪唑,pH8.0BufferS(strippingbuffer):10mMTris-HCl(pH8.0),500mMNaCl,50mMEDTA,pH8.0NiSepharose6FastFlow變性條件純化蛋白Protocol一，NiSepharose6FastFlow介質(zhì)的預(yù)處理2，輕柔震蕩，使介質(zhì)均勻重懸。取0.75ml混懸液(介質(zhì)凈體積0.5ml,)/柱，轉(zhuǎn)入15ml離心管中，2500rpm,離心5min，棄上清。加入3ml雙蒸水/柱，輕柔震蕩3min,2500rpm，離心5min,棄上清。加入3mlBferB/柱，輕柔震蕩3min,2500rpm，離心5min,棄上清。重復(fù)4一次。加入0.5ml/柱的BufferB,制成1ml/柱的50%的混懸液，裝柱。包涵體樣品的純化包涵體沉淀先用1ml不含尿素的BferB吹散，再用10?20ml含尿素的BferB溶解，12000rpm,離心10min,上清上柱。留50ul小樣，電泳。樣品溶液加入層析柱,收集流出液,留小樣電泳。5ml