細胞工程胚胎干細胞培養(yǎng)第一頁，共五十七頁，2022年，8月28日第一章緒論4個學(xué)時

第二章實驗室配置及基本技術(shù)2個學(xué)時

第三章植物細胞工程的理論基礎(chǔ)4個學(xué)時

第四章植物組織器官培養(yǎng)技術(shù)6個學(xué)時

第五章植物細胞培養(yǎng)及次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)3個學(xué)時

第六章原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細胞雜交3個學(xué)時

第七章人工種子及植物種質(zhì)資源保存2個學(xué)時

第八章胚胎干細胞培養(yǎng)2個學(xué)時第九章動物細胞培養(yǎng)4個學(xué)時

第十章動物細胞融合與單克隆抗體4個學(xué)時

第十一章動物組織與胚胎工程1個學(xué)時

第十二章試管動物與克隆動物1個學(xué)時

課程初步安排：36學(xué)時

第二頁，共五十七頁，2022年，8月28日第七章胚胎干細胞培養(yǎng)干細胞是什么ES/EG細胞的培養(yǎng)及建系技術(shù)ES/EG細胞的體外誘導(dǎo)分化誘導(dǎo)分化細胞的永生化ES/EG細胞技術(shù)學(xué)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用ES/EG細胞技術(shù)學(xué)面臨的問題和研究趨勢第三頁，共五十七頁，2022年，8月28日

一、干細胞（stemcells）是什么?具有無限的或延長的自我更新能力的細胞?能產(chǎn)生至少一種類型的高度分化的細胞第四頁，共五十七頁，2022年，8月28日

從具有的分化潛能上講：--專能干細胞--多能干細胞--全能干細胞第五頁，共五十七頁，2022年，8月28日

從組織發(fā)生即來源上講：

--胚胎性干細胞

--成體干細胞/組織干細胞第六頁，共五十七頁，2022年，8月28日胚胎性干細胞是一類來自早期胚胎、原始生殖細胞等源于胚胎的干細胞，基本特征是有穩(wěn)定地在體外自我更新、穩(wěn)定地維持正常核型和發(fā)育全能或多能性、能夠分化為屬于三胚層范疇的各種類型分化細胞，甚至參與個體發(fā)育。--來自早期胚胎：胚胎干細胞（embryonicstemcells,ES）--來自胚胎生殖嵴中的原始生殖細胞：胚胎生殖細胞（embryonicgermcells,EG）--來自畸胎瘤組織：胚胎性癌細胞（embryonalcarcinomacells,EC）第七頁，共五十七頁，2022年，8月28日－－1981年，Evens和Martin分別成功的分離和體外培養(yǎng)了小鼠的胚胎干細胞；－－1995年，Thomson等人分離建立了第一株靈長類動物的胚胎干細胞；－－1998年，Thomson等建立了第一株人類胚胎干細胞；－－1998年，Shamblott等建立了第一株人類生殖干細胞；－－2002年3月，美國麻省理工學(xué)院科學(xué)家宣布，他們首次利用人體胚胎干細胞培育出毛細血管，證明了胚胎干細胞技術(shù)在治療心血管疾病等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力；－－目前已有報導(dǎo)，ES細胞在離體適當(dāng)條件下分化為心肌細胞，胰島細胞及血管內(nèi)皮細胞，肝細胞等。第八頁，共五十七頁，2022年，8月28日成體干細胞（adultstemcells,AS），也叫作組織干細胞（tissuestemcells）是指一群分布在成體組織中處于尚未分化的、具有自我更新并負有構(gòu)建和補充某種組織的各種類型細胞潛能的干細胞。如骨髓的造血干細胞、間充質(zhì)干細胞；神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)干細胞；肝干細胞；骨骼肌干細胞等。--造血干細胞可分化為血液系統(tǒng)的各種細胞；小腸和皮膚中的干細胞具有分化、補充和更新小腸和皮膚組織的能力。--骨髓干細胞除了形成各種血細胞和衍生于間質(zhì)細胞的各類細胞外，還可被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細胞、肌肉細胞、骨和肝細胞等不同分化細胞。第九頁，共五十七頁，2022年，8月28日第十頁，共五十七頁，2022年，8月28日

二、ES/EG細胞的培養(yǎng)建系技術(shù)

分離囊胚的內(nèi)細胞群與成纖維細胞共培養(yǎng)，ES細胞非分化增殖分離胚胎生殖腺細胞胚胎干細胞的鑒定定向誘導(dǎo)分化功能細胞第十一頁，共五十七頁，2022年，8月28日第十二頁，共五十七頁，2022年，8月28日1、ES/EG細胞的來源(1)發(fā)育良好的囊胚，從中分離ICM，進一步分離培養(yǎng)ES細胞(2)從胚胎生殖腺中分離出EG細胞從畸胎瘤中分離出EC細胞治療性克隆即體細胞核轉(zhuǎn)移（SCNT）途徑分離培養(yǎng)ES細胞

第十三頁，共五十七頁，2022年，8月28日第十四頁，共五十七頁，2022年，8月28日第十五頁，共五十七頁，2022年，8月28日2、ES/EG細胞的分化抑制培養(yǎng)

目前常用的細胞分化抑制物主要有三種:--飼養(yǎng)層細胞(feederlayer)--特殊細胞的條件培養(yǎng)液(conditionedmedium),如BRL(Buffaloratliver)細胞條件培養(yǎng)液--分化抑制因子(differentiationinhibitoryfactor,DIF),如白血病抑制因子(leukemiainhitoryfactor,LIF)第十六頁，共五十七頁，2022年，8月28日飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)法：常用的飼養(yǎng)層細胞有下列兩種：（1）MEF細胞(mouseembryonicfibroblast)，取自各種品系小鼠的12dpc胚胎。經(jīng)剪碎和胰蛋白酶消化，常規(guī)分散細胞培養(yǎng)為單層散布的成纖維細胞。（2）STO細胞，來自SIM小鼠(S)胚胎的對硫代鳥嘌呤(T)和烏本苷(O)有抗性的成纖維細胞系，能分泌干細胞生長因子(stemcellfactor,SCF)以及白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor,LIF)。第十七頁，共五十七頁，2022年，8月28日無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法：飼養(yǎng)層細胞的制備在一定程度上使ES/EG細胞培養(yǎng)顯得較繁雜。近來以添加LIF生長因子或某些特定細胞的條件培養(yǎng)液至含F(xiàn)CS的正常培養(yǎng)液，借此替代飼養(yǎng)層細胞：（1）直接在ES細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入重組LIF（2）Buffalo大鼠肝細胞條件培養(yǎng)液(BRL-CM)（3）2～3周幼年大鼠心肌細胞條件培養(yǎng)液(RH-CM)第十八頁，共五十七頁，2022年，8月28日3、ES/EG細胞系的特性和鑒定（1）形態(tài)學(xué)特征（2）發(fā)育全能性和分化潛能鑒定（3）嵌合體動物第十九頁，共五十七頁，2022年，8月28日（1）形態(tài)學(xué)特征

體外培養(yǎng)小鼠ES/EG細胞在抑制分化培養(yǎng)中呈現(xiàn)一個或幾個核仁、且核質(zhì)比高的圓形或卵圓形細胞，彼此均呈單層或多層緊密堆積而形成島狀或巢狀群體生長形態(tài)，組成克隆的細胞彼此界限不清楚，粘連性強。

人ES與EG細胞的形態(tài)學(xué)特征有所不同，與小鼠ES/EG也有所不同。單層培養(yǎng)時，人體ES細胞呈扁平狀群落，且細胞界限清楚。第二十頁，共五十七頁，2022年，8月28日（2）發(fā)育全能性和分化潛能鑒定

小鼠和包括人在內(nèi)的靈長類動物全能或多能性胚胎性干細胞，具有特有的表達標(biāo)志以及在體內(nèi)外的分化特點。第二十一頁，共五十七頁，2022年，8月28日干細胞標(biāo)記鼠類EC鼠類ES鼠類EG人類EC人類ES人類EGSSEA-1+++--+SSEA-3---+++SSEA-4---+++TRA-1-60---+++TRA-1-80---+++AKP++++++Oct-4++++

？+

小鼠與人類多能干細胞標(biāo)記蛋白表達譜第二十二頁，共五十七頁，2022年，8月28日SSEAs(stage-specificembryonicantigen):時期專一性胚胎抗原TRA-1-60、TRA-1-81:腫瘤排斥抗原AKP：堿性磷酸酶在小鼠及靈長類的ES細胞中活性較高，在已分化細胞中活性明顯降低；

Oct-4:是生殖系專一性轉(zhuǎn)錄因子。作為和胚胎發(fā)育全能/多能性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，Oct-4通過多種調(diào)控機制激活或抑制不同靶基因的轉(zhuǎn)錄，在細胞的全能/多能性及未分化狀態(tài)的調(diào)控和維持中發(fā)揮重要作用。端粒酶(telomerase):一類核糖核蛋白，與維持真核細胞染色體末端的端粒長度和控制細胞壽命有關(guān)。人ES細胞的端粒酶活性高，而分化細胞一般難以檢測到；胚胎干細胞的特異性表達標(biāo)志：第二十三頁，共五十七頁，2022年，8月28日ES/EG細胞在體外被刺激分化為各種類型細胞是其最基本的屬性;ES/EG細胞接種于同一品系的小鼠或免疫缺陷小鼠腹股溝、眼窩、腹腔等可以形成由內(nèi)胚層、中胚層和外胚層細胞構(gòu)成的畸胎瘤。胚胎干細胞的體內(nèi)、外分化特點：第二十四頁，共五十七頁，2022年，8月28日

組織和器官的細胞由含有兩個或兩個以上基因型構(gòu)建而成的完整個體稱為嵌合體動物（chimaera）。把ES/EG細胞注入胚泡或與桑椹胚聚集，使其與正常胚胎結(jié)合在一起，并參與宿主胚胎發(fā)育，可形成嵌合體動物的各種組織和器官，包含生殖系嵌合體動物可通過毛色、皮膚顏色等外觀指標(biāo)進行判定或是取器官組織進行同功酶檢測(3)嵌合體動物第二十五頁，共五十七頁，2022年，8月28日

三、ES/EG細胞的體外誘導(dǎo)分化第二十六頁，共五十七頁，2022年，8月28日1、基本原理

細胞誘導(dǎo)分化是一個細胞與其微環(huán)境相互間復(fù)雜而又精密協(xié)調(diào)的分子細胞學(xué)過程，是胚胎正常發(fā)育過程中重要而基本的現(xiàn)象；

ES細胞是體外研究誘導(dǎo)分化的較理想模型，在體外被誘導(dǎo)分化的途徑可能與在體胚胎細胞的不完全相同；

在體胚胎的細胞分化過程中，誘導(dǎo)作用的結(jié)果不只是決定于各種誘導(dǎo)物質(zhì)的性質(zhì)和專一性，同時也決定于被誘導(dǎo)細胞的反應(yīng)能力(competence)。后者受遺傳、發(fā)育潛能等內(nèi)在因素的限制；第二十七頁，共五十七頁，2022年，8月28日

ES細胞體外誘導(dǎo)分化實驗中，所用誘導(dǎo)物質(zhì)繁多，誘導(dǎo)模式不盡相同，按其作用機理大致分為兩類：--使被誘導(dǎo)細胞可逆性輕度損傷，導(dǎo)致神經(jīng)細胞分化無機物、有機酸、醇、亞甲基鹽、硫氫化物等--誘導(dǎo)物通過其與被誘導(dǎo)細胞表面的受體結(jié)合而誘導(dǎo)細胞分化類固醇激素、維甲酸衍生物、多肽生長因子等

同一種誘導(dǎo)物可以誘導(dǎo)出不同類型細胞或變化多端的構(gòu)造，不僅涉及誘導(dǎo)劑的濃度差別、誘導(dǎo)作用模式和微環(huán)境的未知因素等，而且可能與被誘導(dǎo)細胞本身的發(fā)育潛能和對誘導(dǎo)劑的反應(yīng)性等差別有關(guān)。第二十八頁，共五十七頁，2022年，8月28日

ES細胞體外誘導(dǎo)分化途徑可分為：--譜系分化（lineagedifferentiation），有利于認識組織譜系細胞分化機理和全過程。

ES細胞譜系祖細胞譜系定型細胞終末分化細胞--定向分化（committeddiffereniation），需設(shè)法控制導(dǎo)向產(chǎn)生單一類型的分化細胞。對ES細胞轉(zhuǎn)染細胞專一的轉(zhuǎn)錄因子、標(biāo)志基因、細胞分化因子結(jié)合報告基因和誘導(dǎo)條件選擇等手段，探索定向誘導(dǎo)分化途徑第二十九頁，共五十七頁，2022年，8月28日第三十頁，共五十七頁，2022年，8月28日第三十一頁，共五十七頁，2022年，8月28日2、ES細胞體外誘導(dǎo)分化的基本方法單層ES細胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化：較難分化為單一類型的細胞ES細胞擬胚體形成和誘導(dǎo)分化：相對誘導(dǎo)分化細胞類型較單一,具體方法有：（1）軟瓊脂培養(yǎng)（2）懸滴培養(yǎng)

第三十二頁，共五十七頁，2022年，8月28日制備ES單細胞懸浮液培養(yǎng)皿蓋上接種20ul/滴，直徑10cm的培養(yǎng)皿蓋蓋上帶有懸浮細胞小滴的蓋子培養(yǎng)皿內(nèi)加PBS培養(yǎng)皿邊緣用膜封

置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3d后，轉(zhuǎn)移擬胚體至含細胞分化誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)皿或微孔板進一步培養(yǎng)然后,移放入鋪有0.1%白明膠的培養(yǎng)皿或微孔板內(nèi)在培養(yǎng)液中再培養(yǎng)可被誘導(dǎo)分化為不同類型細胞ES細胞體外懸滴培養(yǎng)第三十三頁，共五十七頁，2022年，8月28日3、ES細胞體外誘導(dǎo)分化舉例

造血細胞內(nèi)皮細胞與血管神經(jīng)細胞脂肪細胞心肌和其他肌肉細胞軟骨細胞胰島細胞第三十四頁，共五十七頁，2022年，8月28日小鼠ES細胞擬胚體在體外可以分化為類似于早期胚胎卵黃囊血島樣的結(jié)構(gòu)并分化產(chǎn)生各種造血系統(tǒng)的細胞：①用胰蛋白酶消化小鼠ES細胞擬胚體成單個細胞，經(jīng)干細胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)和條件培養(yǎng)液處理，誘導(dǎo)其定向分化為造血干細胞；②用原代骨髓基質(zhì)細胞作飼養(yǎng)層和SCF及IL-6細胞因子處理可進一步使ES細胞來源的造血干細胞分化為B淋巴細胞系。造血細胞第三十五頁，共五十七頁，2022年，8月28日內(nèi)皮細胞與血管小鼠ES細胞擬胚體在體外可以分化為類似于早期胚胎卵黃囊血島樣的結(jié)構(gòu)，其中也有內(nèi)皮細胞出現(xiàn)：①利用經(jīng)轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)基因轉(zhuǎn)染的小鼠ES細胞在含RA培養(yǎng)液中經(jīng)懸滴培養(yǎng)形成擬胚體；②再繼續(xù)貼壁培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)擬胚體周圍呈輻射狀長出許多血管樣結(jié)構(gòu)。將外源重組TGF-β1添加至培養(yǎng)液，同樣也能誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞組成的血管樣結(jié)構(gòu)。第三十六頁，共五十七頁，2022年，8月28日心肌和其它肌肉細胞

懸浮或懸滴培養(yǎng)的小鼠ES細胞擬胚體在RA誘導(dǎo)條件下貼壁生長數(shù)天，常出現(xiàn)某些分化細胞集落具有節(jié)律性自發(fā)收縮的現(xiàn)象，顯然是肌細胞：DMSO誘導(dǎo)ES細胞擬胚體可以形成心肌、平滑肌和骨骼肌等多種類型肌細胞，用肌肉專一性的調(diào)節(jié)因子MyoD基因轉(zhuǎn)染ES細胞并結(jié)合DMSO誘導(dǎo)處理，額外表達MyoD基因的ES細胞主要分化為骨骼肌且常融合成肌管。第三十七頁，共五十七頁，2022年，8月28日ES細胞定向誘導(dǎo)分化是至今仍未解決、正在探索中的問題。根據(jù)國外少數(shù)報道和國內(nèi)的經(jīng)驗，對ES細胞轉(zhuǎn)染細胞專一的轉(zhuǎn)錄因子、標(biāo)志基因或是有關(guān)細胞分化因子等遺傳操作，并結(jié)合誘導(dǎo)條件選擇等手段，是一條可能的探索ES細胞定向誘導(dǎo)分化的途徑。第三十八頁，共五十七頁，2022年，8月28日

四、ES/EG細胞誘導(dǎo)分化細胞的永生化

尋找建立ES/EG細胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的分化細胞永生化途徑是目前ES/EG細胞研究領(lǐng)域待解決的問題。第三十九頁，共五十七頁，2022年，8月28日

五、ES/EG培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化的意義哺乳類發(fā)育的體外模型人體的基因和細胞治療組織工程的種子細胞來源第四十頁，共五十七頁，2022年，8月28日第四十一頁，共五十七頁，2022年，8月28日哺乳動物早期胚胎一般體積很小，又在宮內(nèi)發(fā)育，在體內(nèi)研究胚胎發(fā)育和各類細胞分化及其機理幾乎不可能；ES細胞具有完整的發(fā)育潛能性，而且對所有調(diào)節(jié)正常發(fā)育的信號具有應(yīng)答能力。雖然ES細胞體外分化途徑和機制與在體胚胎不完全相同，但在分子水平有共同或相似之處，是研究特定類型細胞分化、某些前體細胞起源和細胞譜系演變較理想的實驗體系；許多國家在法律上禁止以克隆或復(fù)制人為目的的前提下，已允許將人ES細胞類似于小鼠ES細胞體外實驗一樣，用于研究人類胚胎發(fā)育、分化和調(diào)節(jié)信號等事件。哺乳類發(fā)育的體外模型第四十二頁，共五十七頁，2022年，8月28日

人體的基因和細胞治療

這里的基因治療是指用遺傳改造過的人體細胞直接移植或輸入病人體內(nèi)，達到控制和治愈疾病為目的的治療手段，又稱細胞治療。第四十三頁，共五十七頁，2022年，8月28日目前常說的基因治療技術(shù)雖然能把編碼正常序列的基因?qū)胪蛔兗毎雇蛔兓虻墓δ艿玫郊m正，但導(dǎo)入基因的整合和表達難以精確控制，特別是基因插入后對其他基因產(chǎn)生的效應(yīng)尚無法預(yù)知。更大問題是，許多被用作基因操作的細胞在體外不易穩(wěn)定地被轉(zhuǎn)染和增殖傳代；ES細胞是基因治療的較理想的靶細胞，經(jīng)遺傳操作后一般仍能穩(wěn)定地在體外增殖傳代，克服了目前基因治療中需要大量靶細胞來源的主要問題。第四十四頁，共五十七頁，2022年，8月28日定向誘導(dǎo)分化，選擇治療因子基因表達

人ES細胞

基因操作（克服免疫學(xué)障礙）

多種MHC組合的ES細胞庫

組織譜系干細胞（如造血干細胞）

功能性分化細胞（如神經(jīng)細胞）移植移植

不同類型疾病的宿主

基因組被改造的ES細胞異源性基因表達基因修飾

基因敲除、敲入定向誘導(dǎo)分化選擇

組織譜系干細胞或功能性分化細胞移植圖2-2-1用于基因和細胞治療的人ES細胞工程示意圖基本策略1第四十五頁，共五十七頁，2022年，8月28日基本策略2欲接受細胞治療患者的體細胞核導(dǎo)入去核卵細胞體外發(fā)育

胚泡期專用ES細胞

特化細胞分離培養(yǎng)體外誘導(dǎo)分化

回輸?shù)谒氖?，共五十七頁?022年，8月28日細胞治療的臨床應(yīng)用前景神經(jīng)系統(tǒng)疾病骨和軟骨疾病血液病肝病第四十七頁，共五十七頁，2022年，8月28日神經(jīng)系統(tǒng)疾病

根據(jù)小鼠ES/EG細胞研究資料，由于各種類型神經(jīng)細胞因某種原因死亡而成熟神經(jīng)細胞又不能分裂、補充和替代死亡細胞引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病如Parkinson’s疾病，Alzheimer’s病、多發(fā)性硬化癥等，有望通過人ES/EG細胞進行細胞治療。

新近，產(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)細胞已能從小鼠ES細胞衍生而來，為細胞治療Parkinson’s病的ES細胞來源問題提供實驗依據(jù)。第四十八頁，共五十七頁，2022年，8月28日骨和軟骨疾病ES/EG細胞可能在體外被誘導(dǎo)為骨和軟骨，這些細胞被導(dǎo)入骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)軟骨損傷區(qū)域，或因骨折、手術(shù)而引起的較大骨隙中，這類從ES細胞衍生的骨和軟骨細胞在被移植部位自我修復(fù)的優(yōu)點遠遠超過現(xiàn)行的組織移植。第四十九頁，共五十七頁，2022年，8月28日血液病ES和造血干細胞研究有助于產(chǎn)生供細胞移植用的、不含有鐮刀狀血球突變的血細胞。第五十頁，共五十七頁，2022年，8月28日肝病利用肝干細胞移植治療肝病取得了重要進展。第五十一頁，共五十七頁，2022年，8月28日

組織工程的種子細胞來源

人體ES細胞技術(shù)學(xué)的發(fā)生和發(fā)展，有望解決目前組織或器官修復(fù)中的難題。第五十二頁，共五十七頁，2022年，8月28日

設(shè)想是選擇與人體細胞兼容性較好的生物材料，按缺損組織或器官的要求設(shè)計制成模型或支架放在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中，使ES細胞或其定向誘導(dǎo)分化細胞沿著模型或支架不斷地生長擴增，構(gòu)建成新的組織或器官。但ES細胞定向分化和構(gòu)成組織和器官中細胞類型的復(fù)雜性等諸多問題尚待解決；

目前工作是著重于從