基因工程的基本操作程序--公開課1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細胞4、目的基因的檢測與鑒定一、目的基因的獲取1.目的基因符合人們需要，能編碼蛋白質(zhì)的基因2.基因文庫P9將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。種類基因組文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫某種生物的全部DNA限制酶DNA片段DNA片段與載體連接重組DNA基因組文庫導入受體菌中儲存①基因組文庫的構(gòu)建生物某個發(fā)育時期的mRNA單鏈DNA雙鏈cDNA片段重組DNA與載體連接cDNA文庫反轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶導入受體菌中儲存②cDNA文庫的構(gòu)建-----逆轉(zhuǎn)錄法：

基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較3.獲取目的基因的方法（1）從基因文庫中獲?。?）利用PCR技術(shù)擴增（3）人工合成依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性（1）從基因文庫中獲取目的基因（2）利用PCR技術(shù)擴增目的基因①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復制___________的核酸合成技術(shù)。②原理：__________多聚酶鏈式反應(yīng)體外特定DNA片段DNA復制模板DNAPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點50℃引物1引物2DNA引物95℃PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點72℃第1輪結(jié)束第2輪開始PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點72℃第2輪結(jié)束③過程：a、變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA在受熱下，_____斷裂，形成________b、復性（55℃-65℃）：溫度降低，引物與單鏈DNA結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈④方式：以_____方式擴增，即____⑤條件：前提條件:________________⑥結(jié)果：指數(shù)2n短時間內(nèi)大量擴增目的基因已知基因的核苷酸序列DNA復制PCR技術(shù)場所解旋方式酶PCR技術(shù)擴增與DNA復制的比較高溫解旋酶體外復制主要在細胞核內(nèi)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細胞內(nèi)的DNA聚合酶（3）人工合成法：

在基因較小，核苷酸序列已知的情況下，可以利用DNA合成儀人工合成化學合成法、反轉(zhuǎn)錄法蛋白質(zhì)mRNADNA推測推測DNADNA合成儀合成根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：二、基因表達載體的構(gòu)建（核心）

1.目的A.使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并遺傳給子代B.同時使目的基因能表達和發(fā)揮作用2.基因表達載體的組成：a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標記基因質(zhì)粒目的基因限制酶DNA連接酶重組DNA3.基因表達載體的構(gòu)建過程（1）用_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)切口露出____________。（2）用___________切割目的基因，使其產(chǎn)生_________________。（3）將目的基因插入質(zhì)粒的______處，加入___________，形成了一個重組DNA分子限制酶黏性末端同種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同三、將目的基因?qū)胧荏w細胞

------轉(zhuǎn)化目的基因進入_________內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持_____和_____的過程穩(wěn)定表達受體細胞1、將目的基因?qū)胫参锛毎?）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法特點:a.能感染雙子葉植物和祼子植物,對單子葉植物無感染能力b.Ti質(zhì)粒的T—DNA可轉(zhuǎn)移至受體細胞并整合到其染色體上Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達載體導入植物細胞整合植物細胞染色體DNA表達新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌（2）基因槍法------單子葉植物（3）花粉通道法我國轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是用這種方法獲得2、將目的基因?qū)雱游锛毎俜椒ǎ猴@微注射法②程序：目的基因表達載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵新性狀動物3、將目的基因?qū)胛⑸锛毎?）方法：Ca2+處理法（增加細胞壁通透性）（2）微生物作受體細胞原因：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少（3）過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA四、目的基因的檢測與鑒定檢測（分子水平）:是否插入目的基因是否轉(zhuǎn)錄是否翻譯鑒定:個體生物學水平鑒定（1）檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因①首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA；A方法:DNA分子雜交B過程:②將含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標記,以此做探針；③使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明目的基因已插入染色體DNA中。1.檢測基因探針通過分子雜交與目的基因結(jié)合，產(chǎn)生雜交帶，能從浩翰的基因組中把目的基因顯示出來。

(2)檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA①方法:分子雜交法②過程:用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA。（3）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法:抗原-抗體雜交提取方法——抗原-抗體雜交蘇云金桿菌Bt毒素蛋白將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體抗體蛋白質(zhì)

出現(xiàn)雜交帶脫分化組織培養(yǎng)2.鑒定（個體生物學水平）抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等目的基因的表達和檢測抗蟲鑒定