.......DNA凝膠電泳操作留意事項1、瓊脂糖：不同廠家、不同批號的瓊脂糖，其雜質(zhì)含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強度，應(yīng)有選擇地使用。2、凝膠的制備：凝膠中所加緩沖液應(yīng)與電泳槽中的相全都，溶化的凝膠應(yīng)準(zhǔn)時倒入板中，避開倒入前凝固結(jié)塊。倒入板中的凝膠應(yīng)避開消滅氣泡，以免影響電泳結(jié)果。3、電泳緩沖液：為保持電泳所需的離子強度和pH，應(yīng)常常更電泳緩沖液。4、樣品參與量：一般狀況下，0.5cm0.5μgDNADNA中片段的數(shù)量和大小而定.當(dāng)加樣孔大時,樣品上樣量應(yīng)相應(yīng)加大,否則會造成條帶淺甚至識別不清;反之則應(yīng)適當(dāng)削減加樣量，但是上樣量過多會造成加樣孔超載，從而導(dǎo)致拖尾或彌散，對于較大的DNA此現(xiàn)象更明顯。5、DNADNA選擇的試驗材料要穎，處理時間不易過長。在參與細胞裂解緩沖液前，細胞必需均勻分散，以削減DNA。提取的DNA不易溶解：不純，含雜質(zhì)較多；加溶解液太少使?jié)舛冗^大。沉淀物太枯燥，也將使溶解變得很困難。DNA。選擇的試驗材料要穎，處理時間不易過長。在參與細胞裂解緩沖液前，細胞必需均勻分散，以削減DNA。提取的DNA不易溶解：不純，含雜質(zhì)較多；加溶解液太少使?jié)舛冗^大。沉淀物太枯燥，也將使溶解變得很困難。DNA。分光光度分析DNA的A280/A2601.8；不純，含有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。在這種狀況下，應(yīng)參與SDS0.52～8。酚/氯仿/異戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸?。汉邼舛鹊腄NA，可加大抽提前緩沖液的量或削減所取組織的量DNA1請問配制聚丙烯酰胺凝膠電泳膠時，促凝的是TEMED過硫酸銨供給驅(qū)動丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所需的自由基，而TEMED通過催化過硫酸銨形成自由基而加速它倆的聚合。膠聚合時間長可能是TEMED一個讓膠很快聚合的方法：AP〔過硫酸銨〕溶液，由于AP很簡潔變質(zhì)。在保證TEMEDAP接稱確定量的APAP25ml0.03AP25ulTEMED，20〔固然這個時候拔梳子，會有少量未凝固的在孔里形成絲狀干擾，使加的樣品看起來不太秀麗，但一般不影響跑膠效果和條帶的外形和位置〕。DNAMARKER1、配制膠時的緩沖液需要和電泳緩沖液不是同時配制的.最好是同時配制.電泳時緩沖液高過液面1－2mm即可。215(3V/cm),等條帶出孔后比較秀麗了.然后再調(diào)電壓。3、上樣時盡量漸漸加樣,等樣品自然沉降后再加電壓。DNA1、DNA2、電泳緩沖液陳舊:電泳緩沖液屢次使用后，離子強度降低，pH果。建議常常更換電泳緩沖液。320V/cm，溫度＜30℃；巨大DNA15℃；核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖力氣。4、DNADNA5、DNA6、有蛋白污染：電泳前酚抽提去除蛋白。7、DNA20mMNaClDNA。DNA1、對于λ/HindIII片段cos65℃加熱DNA552、電泳條件不適宜：電泳電壓不超過20V/cm；溫度＜30℃；常常更換電泳緩沖液。3、DNA20mMNaClBufferDNA，電泳前勿加熱。DNA條帶帶弱或無DNA1、DNADNA降低。2、DNADNA3、DNA4、對于EB染色的DNA，所用光源不適宜??應(yīng)用短波長〔254nm〕的紫外光源。DNA1、假設(shè)是小DNA2、分子大小相近的DNA3、DNA變性：電泳前請勿高溫加熱DNA20mMNaClBufferDNA。DNAPCR489BP500600有時只靠電泳結(jié)果推斷是不準(zhǔn)確的，同樣的片段每次跑的遠近會有不同。有閱歷顯示目的片段是13001000marker490BP.理論上兩個條帶一樣，可是PCR結(jié)果顯示就是大小不全都。然后回收以后的檢測結(jié)果又全部都一樣了，后來又拿去做了下一個測序，才知道根本沒有問題。8markerA：消滅上述狀況，可能有以下幾個緣由：1.marker條帶消滅了降解。請確保在使用過程中避開核酸酶污染；2.電泳緩沖液陳舊。電泳緩沖液屢次使用后，離子濃度降低，pH值上升，緩沖力氣減弱，從而影響電泳效果，建議常常更換電泳緩沖液；3.電泳條件不適宜。電泳時電壓應(yīng)不超過20V/cm30℃；4.marker請依據(jù)說明書選用適宜上樣量；5.凝膠質(zhì)量不好。建議使用質(zhì)量較好的瓊脂糖；此外，凝膠凝固不均勻也會導(dǎo)致條帶模糊。9：為什么marker條帶消滅不規(guī)章的條帶〔如啞鈴狀等〕？A：消滅上述狀況，多與以下幾個緣由有關(guān)：1.電泳緩沖液陳舊。老化的電泳緩沖液離子濃度降低，pH上升，緩沖力氣減弱，從而影響電泳效果，建議常常更換電泳緩沖液；2.電泳條件不適宜。電泳時電壓應(yīng)20V/cm，marker凝膠質(zhì)量差以及凝膠冷卻時凝固不均勻也會導(dǎo)致該現(xiàn)象消滅。10markerA：消滅上述狀況可能是：1.marker上樣量較低，可適當(dāng)增加上樣量；2.凝膠質(zhì)量較差或凝膠凝固不均勻也會導(dǎo)致電泳條帶弱或根本沒有條帶；3.電泳時間過長導(dǎo)致marker條帶跑出凝膠，可縮短電泳時間，降低電壓，增加凝膠濃度。11markerA：對于含有較小片段的marker，假設(shè)消滅缺帶現(xiàn)象，可能是由于：1.小條帶跑出凝膠或分子量大小格外相近的條帶不易識別所致，可適當(dāng)縮短電泳時間，降低電壓，同時增加凝膠濃度；2.凝膠中EBEB當(dāng)增加EB問題 緣由DNA電泳緩沖液陳舊所用電泳條件不合

解決方法避開核酸酶污染電泳緩沖液屢次使用后，離子強度降低，pH減弱，從而影響電泳效果。建議常常更換電泳緩沖液20V/cm，溫度＜30℃；巨大DNA鏈電泳，DNA帶模糊不規(guī)章DNA移帶弱或無DNA

適DNADNA有蛋白污染DNA對于λ/HindIIIcos電泳條件不適宜DNADNADNADNA對于EBDNA，所用光源不適宜

溫度應(yīng)＜15℃；核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖力氣削減凝膠中DNA電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽電泳前酚抽提去除蛋白20mMNaCl緩沖液稀釋DNA65℃加熱DNA55電泳電壓不超過20V/cm；溫度＜30℃；常常更換電泳緩沖液20mMNaClBufferDNA，電泳前勿加熱DNA靈敏度稍高，上樣量可適當(dāng)降低DNA縮短電泳時間，降低電壓，增加凝膠濃度應(yīng)用短波長〔254nm〕的紫外光源DNA帶缺失

DNA分子大小相近的DNADNA變性DNA

縮短電泳時間，降低電壓，增加凝膠濃度增加電泳時間，核準(zhǔn)正確的凝膠濃度電泳前請勿高溫加熱DNA鏈，以20mMNaClBuffer稀釋DNA常規(guī)凝膠電泳不適宜 在脈沖凝膠電泳上分析問題DNAMarker降解DNAMarker無法正確分別條帶黯淡條帶模糊或彌散條帶缺失

可能緣由核酸酶污染保存不當(dāng)瓊脂糖質(zhì)量差電泳緩沖液屢次使用后失效核酸濃度過低核酸降解DNA電泳緩沖液屢次使用后失效核酸局部降解DNA合蛋白或高濃度的鹽份電壓過低，電泳時間過長染色時間過長或拍照前放置過久，DNADNADNA

解決方法4°C4°C或-20°C融；不行加熱使用質(zhì)量牢靠的瓊脂糖制膠更換緩沖液增加上樣量使用不含核酸酶的試劑和耗材制備樣品率一樣的示蹤染料更換緩沖液使用不含核酸酶的試劑和耗材制備樣品酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、鹽份等雜質(zhì)適當(dāng)?shù)碾妷哼M展電泳電泳完畢后準(zhǔn)時觀看、拍照使用脈沖凝膠電泳選擇適當(dāng)?shù)哪z濃度進展電泳開電泳緩沖液使用不當(dāng)

SDTBE的DNATAE緩沖液不適于分別很小的DNA縮短電泳時間，調(diào)整電壓條帶大小不正確

走出凝膠電極插反，DNA核酸降解或形成聚合物*DNAMarkercos

正確連接電極方向加熱處理或重制備樣品65°C55點復(fù)性DNA

分鐘以后再上樣推斷DNA分子是否有特別構(gòu)造，如缺AT堿基的DNAGCDNA慢梳子變形，點樣孔不在同一水平線上帶型特別 不同樣本的上樣條件不同上樣量過大或過小DNA合