方法驗證指導(dǎo)原則-《中國藥典》2022年版第四部9101藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則量。③應(yīng)注意固體制劑的晶型原料藥含量應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。④應(yīng)使用外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)ai2o3對儀器及數(shù)據(jù)進(jìn)行校正。方法3差示掃描量熱法(DSC)定置分析方法，獲得供試品晶型含量數(shù)據(jù)。采用DSC定量分析的晶型物質(zhì)一般應(yīng)具有不同的熔融吸熱峰值，且晶型樣品質(zhì)量與吸熱量呈正比關(guān)系。晶型原料藥分析：精密稱量不同質(zhì)量晶型樣品，建立質(zhì)量與熱量的熱焓值的線性關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量測定樣品的晶型含量?；炀г纤幏治觯寒?dāng)不同晶型含量與熱焓呈正比關(guān)系，采用精密稱量配制不同晶型含量的混晶樣品，建立晶型含量與熱焓值的線性關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量測定混晶樣品中的晶型含量。(c)方法說明：①僅適用于晶型原料藥定量分析。②對熔融吸熱峰值相差大的混晶原料供試品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線時線性范圍較寬；熔融吸熱峰值相差小的混晶樣品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線時線性范圍較窄。③有時DSC法僅能作為限量檢測方法。方法4紅外光譜(IR)定量分析方法，獲得供試品晶型含量數(shù)據(jù)。采用IR法可以對晶型原料藥或固體制劑進(jìn)行定量分析，常用的方法為相對峰強度法。晶型特征峰選取原則：①分別選取2種晶型特有的紅外光譜吸收峰作為特征峰。②2種晶型的特征峰應(yīng)獨立而不受對方干擾。③特征峰強度應(yīng)與晶型成分含量呈對應(yīng)線性關(guān)系。對壓力可致晶型狀態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)變的晶型原料供試品，制樣時應(yīng)避免壓片法。晶型原料藥分析：采用相對峰強度法時分別選擇2種晶型成分的特征吸收峰位置匕與b2,在同一紅外光譜圖上讀取2種晶型成分的特征吸收峰的吸光度值乂1與42，計算二者特征吸收峰的吸光度比值r。通過配制一系列不同晶型比例的混晶樣品，建立特征吸收峰的吸光度比值的對數(shù)值與晶型含量間的線性關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，實現(xiàn)對混晶樣品的晶型含量進(jìn)行定量分析。制劑中晶型原料藥成分分析：采用相對峰強度法時分別選擇晶型原料藥特征吸收峰位置h與空白輔料的特征吸收峰位置b2,在同一紅外光譜圖上讀取2種晶型成分的特征吸收峰的吸光度值八1與A2,計算二者特征吸收峰的吸光度比值~通過配制一系列含有不同質(zhì)量晶型原料與空白輔料比例混合樣品，建立特征吸收峰的吸光度比值的對數(shù)值與晶型原料藥含量間的線性關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，實現(xiàn)對固體制劑中晶型原料藥含量進(jìn)行定量分析。備注：其他國際公認(rèn)用于物相分析的方法也可對多晶型進(jìn)行定性或定量分析。中國藥典2022年版9101藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證的目的是證明采用的方法適合于相應(yīng)檢測要求。在建立藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時，分析方法需經(jīng)驗證；在藥品生產(chǎn)工藝變更制劑的組分變更、原分析方法進(jìn)行修訂時，則質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法也需進(jìn)行驗證。方法驗證理由、過程和結(jié)果均應(yīng)記載在藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草說明或修訂說明中。生物制品質(zhì)量控制中采用的方法包括理化分析方法和生物學(xué)測定方法，其中理化分析方法的驗證原則與化學(xué)藥品基本相同，所以可參照本指導(dǎo)原則進(jìn)行，但在進(jìn)行具體驗證時還需要結(jié)合生物制品的特點考慮；相對于理化分析方法而言，生物學(xué)測定方法存在更多的影響因素，因此本指導(dǎo)原則不涉及生物學(xué)測定方法驗證的內(nèi)容。驗證的分析項目有：鑒別試驗、限量或定量檢查、原料藥或制劑中有效成分含量測定，以及制劑中其他成分（如防腐劑等，中藥中其他殘留物、添加劑等）的測定。藥品溶出度、釋放度等檢查中，其溶出量等的測定方法也應(yīng)進(jìn)行必要驗證。驗證指標(biāo)有：準(zhǔn)確度、精密度（包括重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性）專屬性、檢測限、定量限、線性、范圍和耐用性。在分析方法驗證中，須采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行試驗。由于分析方法具有各自的特點，并隨分析對象而變化，因此需要視具體方法擬訂驗證的指標(biāo)。表1中列出的分析項目和相應(yīng)的驗證指標(biāo)可供參考。表1檢驗項目和驗證指標(biāo)項目雜質(zhì)測定含量測定及鑒別校正因子內(nèi)容定量限度溶出量測定準(zhǔn)確度+++精密度—重復(fù)性-+-++中間精密度—+①-+①+專屬性⑦++++檢測限——③+--定量限-+~-+線性-+~++范圍-+~++耐用性+++巳有重現(xiàn)性驗證，不需驗證中間精密度。如一種方法不夠?qū)?，可用其他分析方法予以補充。③視具體情況予以驗證。一、準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度系指采用該方法測定的結(jié)果與真實值或參考值接近的程度，一般用回收率（％）表示。準(zhǔn)確度應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)測定。中國藥典2022年版化學(xué)藥含量測定方法的準(zhǔn)確度原料藥采用對照品進(jìn)行測定，或用本法所得結(jié)果與已知準(zhǔn)確度的另一個方法測定的結(jié)果進(jìn)行比較。制劑可在處方量空白輔料中，加人已知量被測物對照品進(jìn)行測定。如不能得到制劑輔料的全部組分，可向待測制劑中加人已知量的被測物對照品進(jìn)行測定，或用所建立方法的測定結(jié)果與已知準(zhǔn)確度的另一種方法測定結(jié)果進(jìn)行比較。準(zhǔn)確度也可由所測定的精密度、線性和專屬性推算出來?；瘜W(xué)藥雜質(zhì)定量測定的準(zhǔn)確度可向原料藥或制劑處方量空白輔料中加人已知量雜質(zhì)進(jìn)行測定。如不能得到雜質(zhì)或降解產(chǎn)物對照品，可用所建立方法測定的結(jié)果與另一成熟的方法進(jìn)行比較，如藥典標(biāo)準(zhǔn)方法或經(jīng)過驗證的方法。在不能測得雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的校正因子或不能測得對主成分的相對校正因子的情況下，可用不加校正因子的主成分自身對照法計算雜質(zhì)含量。應(yīng)明確表明單個雜質(zhì)和雜質(zhì)總量相當(dāng)于主成分的重量比（％）或面積比（％）。中藥化學(xué)成分測定方法的準(zhǔn)確度可用對照品進(jìn)行加樣回收率測定，即向已知被測成分含量的供試品中再精密加人一定量的被測成分對照品，依法測定。用實測值與供試品中含有量之差，除以加入對照品量計算回收率。在加樣回收試驗中須注意對照品的加人量與供試品中被測成分含有量之和必須在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍之內(nèi)加人對照品的量要適當(dāng)，過小則引起較大的相對誤差，過大則干擾成分相對減少，真實性差?；厥章剩?（C_A）/S某100%式中A為供試品所含被測成分量；B為加入對照品量；C為實測值。校正因子的準(zhǔn)確度對色譜方法而言，絕對（或定量）校正因子是指單位面積的色譜峰代表的待測物質(zhì)的量。待測定物質(zhì)與所選定的參照物質(zhì)的絕對校正因子之比即為相對校正因子。相對校正因子計算法常應(yīng)用于化學(xué)藥有關(guān)物質(zhì)的測定中藥材及其復(fù)方制劑中多指標(biāo)成分的測定。校正因子的表示方法很多，本指導(dǎo)原則中的校正因子是指氣相色譜法和髙效液相色譜法中的相對重量校正因子。相對校正因子可采用替代物（對照品）和被替代物（待測物）標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率比值進(jìn)行比較獲得；采用紫外吸收檢測器時，可將替代物（對照品和被替代物（待測物）在規(guī)定波長和溶劑條件下的吸收系數(shù)比值進(jìn)行比較計算獲得。數(shù)據(jù)要求在規(guī)定范圍內(nèi)，取同一濃度（相當(dāng)于100%濃度水平）的供試品，用至少測定6份樣品的結(jié)果進(jìn)行評價；或設(shè)計3種不同濃度，每種濃度分別制備3份供試品溶液進(jìn)行測定，用9份樣品的測定結(jié)果進(jìn)行評價。對于化學(xué)藥，一般中間濃度加人量與所取供試品中待測定成分量之比控制在1:1左右，9101藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則建議高、中、低濃度對照品加人量與所取供試品中待測定成分量之比控制在1.2:1,1:1，0.8某1左右，應(yīng)報告已知加人量的回收率（％），或測定結(jié)果平均值與真實值之差及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差或置信區(qū)間（置信度一般為95%）;對于中藥，一般中間濃度加人量與所取供試品中待測定成分量之比控制在1:1左右，建議高、中、低濃度對照品加人量與所取供試品中待測定成分量之比控制在1.5丨1，1:1，0.5某1左右，應(yīng)報告供試品取樣量、供試品中含有量、對照品加入量、測定結(jié)果和回收率（％）計算值，以及回收率（％）的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）或置信K間。對于校正因子，應(yīng)報告測定方法、測定結(jié)果和RSD%。樣品中待測定成分含量和回收率限度關(guān)系可參考表2。在基質(zhì)復(fù)雜、組分含量低于0.01%及多成分等分析中，回收率限度可適當(dāng)放寬。表2樣品中待測定成分含量和回收率限度待測定成分含量回收率限度（％）9810110%951021%921050.1%901080.01%85110lOfig/g(ppm)801151卩g/g75120lOpg/kg(ppb)70125二、精密度精密度系指在規(guī)定的條件下，同一份均勻供試品，經(jīng)多次取樣測定所得結(jié)果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。在相同條件下，由同一個分析人員測定所得結(jié)果的精密度稱為重復(fù)性在同一個實驗室，不同時間由不同分析人員用不同設(shè)備測定結(jié)果之間的精密度，稱為中間精密度；在不同實驗室由不同分析人員測定結(jié)果之間的精密度，稱為重現(xiàn)性。含量測定和雜質(zhì)的定量測定應(yīng)考察方法的精密度。1.重復(fù)性在規(guī)定范圍內(nèi)，取同一濃度(相當(dāng)于100%濃度水平)的供試品，用至少測定6份的結(jié)果進(jìn)行評價；或設(shè)計3種不同濃度，每種濃度分別制備3份供試品溶液進(jìn)行測定，用9份樣品的測定結(jié)果進(jìn)行評價。采用9份測定結(jié)果進(jìn)行評價時，對于化學(xué)藥，一般中間濃度加人量與所取供試品中待測定成分量之比控制在1:1左右，建議髙、中、低濃度對照品加入量與所取供試品中待測定成分量之比控制在1.2:1，1:1，0.8:1左右，對于中藥一般中間濃度加人量與所取供試品中待測定成分量之比控制在1:1左右，建議高、中、低濃度對照品加入量與所取供試品中待測定成分量之比控制在1.5:1,1:1，0.5:1左右。3759101藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則中間精密度考察隨機變動因素如不同日期、不同分析人員、不同儀器對精密度的影響，應(yīng)設(shè)計方案進(jìn)行中間精密度試驗。中國藥典2022年版或氧化等方法進(jìn)行加速破壞，以研究可能存在的降解產(chǎn)物和降解途徑對含量測定和雜質(zhì)測定的影響。含量測定方法應(yīng)比對兩種方法的結(jié)果，雜質(zhì)檢查應(yīng)比對檢出的雜質(zhì)個數(shù)，必要時可采用光二極管陣列檢測和質(zhì)譜檢測，進(jìn)行峰純度檢查。四、檢測限檢測限系指試樣中被測物能被檢測出的最低量。藥品的鑒別試驗和雜質(zhì)檢査方法，均應(yīng)通過測試確定方法的檢測限。檢測限僅作為限度試驗指標(biāo)和定性鑒別的依據(jù)，沒有定量意義。常用的方法如下。直觀法用已知濃度的被測物，試驗出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。重現(xiàn)性國家藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用的分析方法，應(yīng)進(jìn)行重現(xiàn)性試驗，如通過不同實驗室檢驗獲得重現(xiàn)性結(jié)果。協(xié)同檢驗的目的、過程和重現(xiàn)性結(jié)果均應(yīng)記載在起草說明中。應(yīng)注意重現(xiàn)性試驗用樣品質(zhì)量的一致性及貯存運輸中的環(huán)境對該一致性的影響，以免影響重現(xiàn)性結(jié)果。數(shù)據(jù)要求均應(yīng)報告偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差或置信區(qū)間。樣品中待測定成分含量和精密度可接受范圍參考表3。在基質(zhì)復(fù)雜、含量低于0.01%及多成分等分析中，精密度接受范圍可適當(dāng)放寬。表信噪比法用于能顯示基線噪聲的分析方法，即把巳知低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進(jìn)行比較，計算出能被可靠地檢測出的被測物質(zhì)最低濃度或量。一般以信噪比為3:1或2:1時相應(yīng)濃度或注人儀器的量確定檢測限?；陧憫?yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法3樣品中待測定成分含量和精密度RSD可接受范圍重復(fù)性（RSD%）11.52346815待測定成分含量100%10%重現(xiàn)性（RSD%）23468111632按照L0D=3.33/S公式計算。式中LOD:檢測限；響應(yīng)值的偏差；S:標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。占可以通過下列方法測得：①測定空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差；②標(biāo)準(zhǔn)曲線的剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差或截距的標(biāo)準(zhǔn)偏差來代替。數(shù)據(jù)要求1%0.1%0.01%lOfig/g(ppm)lfk/g10pg/kg(ppb)上述計算方法獲得的檢測限數(shù)據(jù)須用含量相近的樣品進(jìn)行驗證。應(yīng)附測定圖譜，說明試驗過程和檢測限結(jié)果五、定量限三、專屬性專屬性系指在其他成分(如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等)存在下，采用的分析方法能正確測定被測物的能力。鑒別反應(yīng)、雜質(zhì)檢查和含量測定方法，均應(yīng)考察其專屬性。如方法專屬性不強，應(yīng)采用多種不同原理的方法予以補充。定量限系指試樣中被測物能被定量測定的最低量，其測定結(jié)果應(yīng)符合準(zhǔn)確度和精密度要求。對微量或痕量藥物分析、定量測定藥物雜質(zhì)和降解產(chǎn)物時，應(yīng)確定方法的定量限。常用的方法如下。1，直觀法用已知濃度的被測物，試驗出能被可靠地定量測定的最低濃度或量。信噪比法1.鑒別反應(yīng)應(yīng)能區(qū)分可能共存的物質(zhì)或結(jié)構(gòu)相似化合物。不含被測成分的供試品以及結(jié)構(gòu)相似或組分中的有關(guān)化合物，應(yīng)均呈陰性反應(yīng)。用于能顯示基線噪聲的分析方法，即把已知低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進(jìn)行比較，計算出能被可靠地定量的被測物質(zhì)的最低濃度或量。一般以信噪比為10某1時相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定定量限。基于響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法2.含量測定和雜質(zhì)測定采用色譜法和其他分離方法，應(yīng)附代表性圖譜，以說明方法的專屬性并應(yīng)標(biāo)明各成分在圖中的位置，色譜法中的分離度應(yīng)符合要求。在雜質(zhì)對照品可獲得的情況下，對于含量測定，試樣中可加入雜質(zhì)或輔料，考察測定結(jié)果是否受干擾，并可與未加雜質(zhì)或輔料的試樣比較測定結(jié)果。對于雜質(zhì)檢查，也可向試樣中加人一定量的雜質(zhì)，考察各成分包括雜質(zhì)之間能否得到分離。按照LOQ=103/S公式計算。式中LOQ:定量限；響應(yīng)值的偏差；S:標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。占可以通過下列方法測得：①測定空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差；②采用標(biāo)準(zhǔn)曲線的剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差或是截距的標(biāo)準(zhǔn)偏差來代替。數(shù)據(jù)要求在雜質(zhì)或降解產(chǎn)物不能獲得的情況下，可將含有雜質(zhì)或降解產(chǎn)、物的試樣進(jìn)行測定，與另一個經(jīng)驗證了的方法或藥典方法比較結(jié)果。也可用強光照射、高溫、高濕、酸（堿）水解上述計算方法獲得的定量限數(shù)據(jù)須用含量相近的樣品進(jìn)行驗證。應(yīng)附測定圖譜，說明測試過程和定量限結(jié)果，包括376中國藥典2022年版準(zhǔn)確度和精密度驗證數(shù)據(jù)。六、線性線性系指在設(shè)計的范圍內(nèi)，測定響應(yīng)值與試樣中被測物濃度呈比例關(guān)系的程度。應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)測定線性關(guān)系?？捎猛粚φ掌焚A備液經(jīng)精密稀釋或分別精密稱取對照品，制備一系列對照品溶液的方法進(jìn)行測定，至少制備5份不同濃度的對照品溶液。以測得的響應(yīng)信號對被測物的濃度作圖，觀察是否呈線性，再用最小二乘法進(jìn)行線性回歸。必要時，響應(yīng)信號可經(jīng)數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換，再進(jìn)行線性回歸計算?；蛘呖刹捎妹枋鰸舛?響應(yīng)關(guān)系的非線性模型。數(shù)據(jù)要求：應(yīng)列出回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性圖（或其他數(shù)學(xué)模型）七、范圍范圍系指分析方法能達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性要求時的高低限濃度或量的K間。范圍應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用及其線性、準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果和要求確定。原料藥和制劑含量測定，范圍一般為測定濃度的80%120%;制劑含量均勻度檢査，范圍一般為測定濃度的70%130%，特殊劑型，如氣霧劑和噴霧劑，范圍可適當(dāng)放寬；溶出度或釋放度中的溶出量測定，范圍一般為限度的士30%，如規(guī)定了限度范圍，則應(yīng)為下限的—20%至上限的+20%;雜質(zhì)測定，范圍應(yīng)根據(jù)初步實際測定數(shù)據(jù)，擬訂為規(guī)定限度的±20%。如果含量測定與雜質(zhì)檢查同時進(jìn)行，用峰面積歸一化法進(jìn)行計算，則線性范圍應(yīng)為雜質(zhì)規(guī)定限度的一20%至含量限度（或上限）的+20%。在中藥分析中，范圍應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用和線性、準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果及要求確定。對于有毒的、具特殊功效或藥理作用的成分，其驗證范圍應(yīng)大于被限定含量的區(qū)間。校正因子測定時，范圍一般應(yīng)根據(jù)其應(yīng)用對象的測定范圍確定。八、耐用性耐用性系指在測定條件有小的變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度為所建立的方法用于日常檢驗提供依據(jù)。開始研究分析方法時，就應(yīng)考慮其耐用性D如果測定條件要求苛刻，則應(yīng)在方法中寫明，并注明可以接受變動的范圍，可以先采用均勻設(shè)計確定主要影響因素，再通過單因素分析等確定變動范圍。典型的變動因素有：被測溶液的穩(wěn)定性、樣品的提取次數(shù)、時間等。高效液相色譜法中典型的變動因素有：流動相的組成和pH值、不同品牌或不同批號的同類型色譜柱、柱溫、流速等。氣相色譜法變動因素有：不同品牌或批號的色譜柱、固定相、不同類型的擔(dān)體、載氣流速、柱溫、進(jìn)樣口和檢測器溫度等。經(jīng)試驗，測定條件小的變動應(yīng)能滿足系統(tǒng)適用性試驗要求，以確保方法的可靠性。9102藥品雜質(zhì)分析指導(dǎo)原則9102