本文格式為Word版，下載可任意編輯——中藥材中蛋白質(zhì)含量測定方法的研究

近年來,隨著基因工程學(xué)、分子生物學(xué)和現(xiàn)代分開技術(shù)的快速進(jìn)展,蛋白質(zhì)也成了一項(xiàng)質(zhì)量和資源評價(jià)的指標(biāo),故探索測定蛋白質(zhì)含量的方法有著重要的意義[1]。目前測定蛋白質(zhì)含量的常用方法有凱氏定氮法、考馬斯亮藍(lán)法、紫外分光光度法、雙縮脲法、Folin酚試劑法和雙辛可寧酸法[2]等。這些方法也分別應(yīng)用于測定不同中藥材中蛋白質(zhì)含量。

1考馬斯亮藍(lán)法

考馬斯亮藍(lán)法是Bradford于1975年建立的一種色素結(jié)合法。其主要原理是考馬斯亮藍(lán)G250在酸性溶液中與蛋白質(zhì)通過范德瓦爾引力結(jié)合形成最大吸收峰為595nm的復(fù)合物,其吸光度與蛋白質(zhì)含量在200～1400μg/ml之間呈線性關(guān)系,故可用于蛋白質(zhì)含量的測定[3]。趙英永[1]等探討了考馬斯亮藍(lán)G250染色法測定草烏藥材中可溶性蛋白質(zhì)含量的方法,并建立了快速、靈敏的測定蛋白質(zhì)的方法。

由于植物粗提液中含有大量其他物質(zhì),如酚類物質(zhì)、核酸等,而且蛋白質(zhì)的含量對比低,因而諸如Folin酚法,雙縮脲法,紫外吸收法等的應(yīng)用受到了確定的限制,而考馬斯亮藍(lán)法靈敏度高,操作簡便,特異性強(qiáng),快速,且不受酚類物質(zhì)的影響,因而往往在植物組織粗提液中可溶性蛋白質(zhì)含量的測定中被采用[4]。但是,目前還不領(lǐng)會(huì)是否全體的植物蛋白質(zhì)都可以用這種方法測定[5]。

2凱氏定氮法

凱氏定氮法[6]為經(jīng)典的測定蛋白質(zhì)的方法。是目前分析有機(jī)化合物含氮量常用的方法,是測定試樣中總有機(jī)氮最切實(shí)的方法之一,被國際國內(nèi)較多作為法定的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法[7]。周燕等[8]舉行了八味沉香膠囊中總蛋白質(zhì)的含量測定,結(jié)果穩(wěn)當(dāng),細(xì)致度高,重現(xiàn)性好,可作為該品的質(zhì)量操縱方法。韓定獻(xiàn)[9]等也采用此法舉行了天力保膠囊中蛋白質(zhì)和氨基酸的含量測定,測得蛋白質(zhì)含量為23.00%。利用凱氏定氮法對金銀花枝葉中蛋白質(zhì)含量舉行了測定,結(jié)果顯示,金銀花葉中的蛋白質(zhì)含量與花中含量極為相近[10]。

雖然,凱氏定氮法為測定含氮量抽象算蛋白質(zhì)的方法,測定結(jié)果的重復(fù)性和重現(xiàn)性都很好。但此法操作繁瑣,試劑消耗量大,消化時(shí)排放的SO2對人體健康造成直接危害,而且費(fèi)時(shí)、費(fèi)電、費(fèi)水。

3雙縮脲法

雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量的原理是,在強(qiáng)堿性溶液中,雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物,這種紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比,而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān),故可用來測定各種蛋白質(zhì)含量[11]。汪良駒等[5]探討了用此法測定銀杏葉片可溶性蛋白質(zhì)含量,結(jié)果說明雙脲試劑與銀杏葉片可溶性蛋白質(zhì)回響急速、穩(wěn)定,適合于這種果樹葉片可溶性蛋白質(zhì)測定。應(yīng)用雙縮脲法測定決明子中蛋白質(zhì)含量結(jié)果說明,決明子中蛋白質(zhì)含量較高[12]。

4Folin酚試劑法

Folin酚試劑法最早由Lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測定的根本步驟。以后在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。這個(gè)測定法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高(比雙縮脲法靈敏得多),缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)間較長[13],要精確操縱操作時(shí)間,標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式,且專一性較差,干擾物質(zhì)較多?？禆|周[14]等認(rèn)為用Lowry法測定蛋白質(zhì)含量時(shí),酚類、單糖類等干擾測定,因此需先經(jīng)過蛋白沉淀的處理過程,擯棄干擾物質(zhì)的影響。吳瑾瑾[15]等采用Folin酚試劑法測定了康克膠囊中可溶性蛋白質(zhì)的含量,結(jié)果蛋白質(zhì)在25～300μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,r≥0.9990,方法靈敏、切實(shí)、重復(fù)性好。利用此法測定靈芝產(chǎn)品中多糖肽的含量,結(jié)論是本法穩(wěn)定穩(wěn)當(dāng)、簡便快速,可作為靈芝及其產(chǎn)品質(zhì)量操縱指標(biāo)[16]。

5紫外分光光度法

蛋白質(zhì)分子中,一些氨基酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵,使蛋白質(zhì)在280nm處有吸收,其光密度值與蛋白質(zhì)含量成正比,可用于蛋白質(zhì)含量的測定[11]。本方法定量過程中無試劑參與,蛋白可回收,且方法簡便[17]。曹艷等[18]用紫外吸收法測定了半夏總蛋白含量,結(jié)論是由于不同樣品中干擾成分差異較大,致使280nm紫外吸收法的切實(shí)性稍差。故本測驗(yàn)只適用于總蛋白的含量測定。因此,就含有大量繁雜成分的中藥材中蛋白質(zhì)含量測定而言,最好是先舉行蛋白純化后在用紫外分光光度法測定。

6其他方法

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)的深入進(jìn)展,蛋白質(zhì)組學(xué)在根基研究、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥學(xué)研究中得到廣泛的利用,近年來也應(yīng)用于中藥材鑒別和蛋白質(zhì)的半定量。如在二維電泳根基上的染色方法舉行蛋白質(zhì)的定量是應(yīng)用較多的方法之一。唐任能[19]等采用SDS聚丙烯酰銨凝膠電泳和BCA蛋白含量測定法對比了鹿茸、鹿托盤、鹿骨水溶性總蛋白差異。結(jié)論是SDS聚丙烯酰銨凝膠電泳法及BCA蛋白含量測定法是鑒別鹿茸、鹿托盤及鹿骨有效方法。另外,利用凱氏定氮法對板藍(lán)根、南板藍(lán)根和大青葉的生藥和相應(yīng)的嶄新植物組織中的總蛋白含量舉行測定,提取液中的蛋白質(zhì)組分應(yīng)用SDS2PAGE電泳舉行分析,表明了三種藥材的蛋白質(zhì)種類和含量有確定區(qū)別,且同種藥材的嶄新植物組織和生藥蛋白質(zhì)組分在含量和種類上有明顯區(qū)別[20]。

7終止語

總之,雖然蛋白質(zhì)含量的測定方法好多,但是,還沒有一個(gè)完備的測定中藥材中蛋白質(zhì)含量的方法