吸光光度法：分子光譜分析法的一種，又稱分光光度法，屬于分子吸取光譜分析方法基于外層電子躍遷7.1概述吸取光譜放射光譜散射光譜分子光譜原子光譜7.2吸光光度法基本原理一、吸取光譜產(chǎn)生的緣由光譜名稱波長(zhǎng)范圍X射線0.1~10nm遠(yuǎn)紫外光10~200nm近紫外光200~400nm可見光400~750nm近紅外光0.75~2.5um中紅外光2.5~5.0um遠(yuǎn)紅外光5.0~1000um微波0.1~100cm無(wú)線電波1～1000m當(dāng)光子的能量與分子的E匹配時(shí)，就會(huì)吸取光子E=hu=hc/l光:一種電磁波,波粒二象性單色光：具有相同能量(相同波長(zhǎng))的光.混合光：具有不同能量(不同波長(zhǎng))的光復(fù)合在一起。/nm顏色互補(bǔ)光400～450紫黃綠450～480藍(lán)黃480～490綠藍(lán)橙490～500藍(lán)綠紅500～560綠紅紫560～580黃綠紫580～610黃藍(lán)610～650橙綠藍(lán)650～760紅藍(lán)綠二、物質(zhì)顏色和其吸取光關(guān)系例如：CuSO4溶液4吸收黃光透過(guò)藍(lán)光白光→人眼CuSO4試驗(yàn)證明：CuSO4溶液濃度越高，對(duì)黃色光的吸取越多，表現(xiàn)為透過(guò)的藍(lán)色越強(qiáng)，溶液的藍(lán)色也越深。吸取光譜曲線：物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下吸取光的強(qiáng)度大小A～l關(guān)系最大吸取波長(zhǎng)lmax：光吸取最大處的波長(zhǎng)三、一些基本名詞和概念lmax對(duì)比度(Δl):絡(luò)合物最大吸取波長(zhǎng)(lMRmax)與試劑最大吸取波(lRmax)之差ΔlCr2O72-、MnO4-的吸取光譜300400500600700/nm350525545Cr2O72-MnO4-1.00.80.60.40.2Absorbance350原子光譜為線光譜分子光譜為帶光譜電子躍遷能級(jí)分子振動(dòng)能級(jí)分子轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)不同物質(zhì)吸取光譜的形態(tài)以及max不同——定性分析的基礎(chǔ)同一物質(zhì)，濃度不同時(shí)，吸取光譜的形態(tài)相同，Amax不同——定量分析的基礎(chǔ)8四、朗伯-比爾定律I0=Ir+It+IaI0=It+IaI0IrItIaT=It/I0,

T:透射比或透光度

A=lg(I0/It)＝lg(1/T),

A:吸光度朗伯定律:(1760)A=lg(I0/It)=k1b當(dāng)入射光的,吸光物質(zhì)的c確定時(shí),溶液的吸光度A與液層厚度b成正比.比爾定律(1852)A=lg(I0/It)=k2c 當(dāng)入射光的,液層厚度b確定時(shí),溶液的吸光度A與吸光物質(zhì)的c成正比.當(dāng)一束平行單色光垂直照射到樣品溶液時(shí)，溶液的吸光度與溶液中吸光質(zhì)點(diǎn)的濃度及光程（溶液的厚度）成正比關(guān)系－－－朗伯比爾定律－－－光吸取定律數(shù)學(xué)表達(dá)：A＝lg(1/T)=Kbc其中，A:吸光度，T:透射比，K:比例常數(shù)，b:溶液厚度，c:溶液濃度留意：平行單色光均相介質(zhì)無(wú)放射、散射或光化學(xué)反應(yīng)稀溶液吸光度A、透射比T與濃度c

的關(guān)系12AT(%)cA=kbc1.00.80.60.40.2100

80

60

40

20靈敏度表示方法摩爾吸光系數(shù)eA=e

bcA=Kbcc:mol/Lε

表示物質(zhì)的濃度為1mol/L,液層厚度為1cm時(shí)溶液的吸光度。單位：

(L?mol-1?cm-1)

c:g/LA=abca:吸光系數(shù)溶液濃度的測(cè)定A＝bc工作曲線法(校準(zhǔn)曲線)朗伯-比爾定律的分析應(yīng)用01.02.03.04.0c(mg/mL)A。。。。*0.800.600.400.200.00Axcx標(biāo)準(zhǔn)比較法：As=bcs（標(biāo)準(zhǔn)樣品)Ax=bcx（待測(cè)樣品)

留意:用比較法測(cè)定時(shí)，所用標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度應(yīng)與待測(cè)溶液的濃度相接近，且試驗(yàn)條件應(yīng)相同。15五、吸光度的加和性與吸光度的測(cè)量16

A=A1+A2+…+An用參比溶液調(diào)T=100%（A=0），再測(cè)樣品溶液的吸光度，即消退了吸取池對(duì)光的吸取、反射，溶劑、試劑對(duì)光的吸取等。便利、靈敏，但精確度差，常用于限界分析。177.3分析方法和儀器一、目視比色法觀察方向空白c1c2c3c4二、光電比色法光電比色計(jì)結(jié)構(gòu)示意圖通過(guò)濾光片得一窄范圍的光(幾十nm)濾光片吸取濾光片：只允許指定的窄范圍波長(zhǎng)光通過(guò)，其他波長(zhǎng)的光均被吸取。選擇濾光片的原則：濾光片透光率最大的光是溶液吸取最大的光,即濾光片的顏色與有色溶液的顏色互補(bǔ)。三、分光光度法和分光光度計(jì)20通過(guò)棱鏡或光柵得到一束近似的單色光，波長(zhǎng)可調(diào),故選擇性好,精確度高。光源單色器樣品池檢測(cè)器讀出系統(tǒng)1.分光光度計(jì)的基本原件常用光源光源波長(zhǎng)范圍(nm)適用于氫燈185~375紫外氘燈185~400紫外鎢燈320~2500可見，近紅外鹵鎢燈250~2000紫外，可見，近紅外氙燈180~1000紫外、可見（熒光）能斯特?zé)?000~3500紅外空心陰極燈特有原子光譜激光光源特有各種譜學(xué)手段氙燈氫燈鎢燈單色器作用:產(chǎn)生單色光常用的單色器：棱鏡和光柵樣品池（比色皿）

厚度(光程):0.5,1,2,3,5…cm

材質(zhì)：玻璃比色皿－－可見光區(qū)石英比色皿－－可見、紫外光區(qū)檢測(cè)器

作用：接收透射光，并將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)常用檢測(cè)器：光電管光電倍增管光二極管陣列光電管分為紅敏和紫敏，陰極表面涂銀和氧化銫為紅敏，適用625－1000nm波長(zhǎng)；陰極表面涂銻和銫為紫敏，適用200－625nm波長(zhǎng)1)單光束分光光度計(jì)2.分光光度計(jì)的基本類型0.575光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示2)雙光束分光光度計(jì)26雙光束型可以消退光源強(qiáng)度變更的影響。比值光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示光束分裂器多通道儀器（MultichannelInstruments）光電二極管陣列(通常具有316個(gè)硅二極管)photodiodearrays(PDAs)

同時(shí)測(cè)量200～820nm范圍內(nèi)的整個(gè)光譜,比單個(gè)檢測(cè)器快316倍,信噪比增加3161/2倍.

273)其他類型分光光度計(jì)纖維光度計(jì)將光度計(jì)放入樣品中,原位測(cè)量.對(duì)環(huán)境和過(guò)程監(jiān)測(cè)特別重要.7.4顯色反應(yīng)及影響因素要求：a.選擇性好b.靈敏度高(ε>104)c.產(chǎn)物的化學(xué)組成穩(wěn)定d.化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定e.反應(yīng)和產(chǎn)物有明顯的顏色差別(l>60nm)沒有顏色的化合物，須要通過(guò)適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)定量生成有色化合物再測(cè)定－－顯色反應(yīng)一、

顯色反應(yīng)二、

顯色反應(yīng)的影響因素（顯色反應(yīng)條件）a溶液酸度（pH值及緩沖溶液）影響顯色劑的平衡濃度及顏色，變更Δl影響待測(cè)離子的存在狀態(tài)，防止沉淀影響絡(luò)合物組成形式pHλmax(nm)形式pHλmax(nm)H4L+1.2462-465Sn4+1.0530H3L4.8-5.2462,490Ga3+5.0550H2L-8.4-9.0512HL2-11.4-12.0532-538pH對(duì)苯芴酮及其絡(luò)合物的顏色影響b顯色劑的用量稍過(guò)量，處于平臺(tái)區(qū)c顯色反應(yīng)時(shí)間針對(duì)不同顯色反應(yīng)確定顯示時(shí)間顯色反應(yīng)快且穩(wěn)定；顯色反應(yīng)快但不穩(wěn)定；顯色反應(yīng)慢，穩(wěn)定需時(shí)間；顯色反應(yīng)慢但不穩(wěn)定d顯色反應(yīng)溫度加熱可加快反應(yīng)速度，但易導(dǎo)致很多顯色劑或產(chǎn)物分解e溶劑f干擾離子

有機(jī)溶劑，提高靈敏度、顯色反應(yīng)速率消退共存離子干擾的方法：提高酸度，加入隱藏劑，變更價(jià)態(tài)選擇合適參比褪色空白(鉻天菁S測(cè)Al，氟化銨褪色，消退鋯、鎳、鈷干擾)選擇適當(dāng)波長(zhǎng)（一）、無(wú)機(jī)顯色劑鉬酸銨法(測(cè)P、Si、W)，過(guò)氧化氫法(測(cè)V5＋、Ti4＋)（二）有機(jī)顯色劑（主要運(yùn)用）1、O，O給電子螯合劑：鉻天菁S（CAS）、苯基熒光酮（PF）2、O，N給電子螯合劑：偶氮胂III等三、分光光度法常用的顯色劑3、N，N給電子基團(tuán)：鄰二氮雜菲（測(cè)Fe）等4、帶含硫基團(tuán)的螯合劑：雙硫腙（測(cè)Cu、Pb、Zn、Cd、Hg等）7.5光度分析法的設(shè)計(jì)a選擇合適的入射光波長(zhǎng)，無(wú)干擾時(shí)選擇最大吸收峰波長(zhǎng)max。b確定線性區(qū)間。c限制吸光度讀數(shù)范圍在0.2~0.8之間。d選擇適當(dāng)?shù)膮⒈热芤哼M(jìn)行測(cè)量。7.6吸光光度法的誤差非單色光引起的偏移物理化學(xué)因素：非勻整介質(zhì)及化學(xué)反應(yīng)吸光度測(cè)量的誤差對(duì)朗伯-比爾定律的偏移一、非單色光引起的偏移復(fù)合光由l1和l2組成，對(duì)于濃度不同的溶液a和b,引起的吸光度的偏差不一樣，濃度大，復(fù)合光引起的誤差大，故在高濃度時(shí)線性關(guān)系向下彎曲。非勻整介質(zhì)膠體，懸浮、乳濁等對(duì)光產(chǎn)生散射，使實(shí)測(cè)吸光度增加，導(dǎo)致線性關(guān)系上彎二、物理化學(xué)因素離解、締合、異構(gòu)等如：Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H++2CrO42-PAR的偶氮－醌腙式化學(xué)反應(yīng)吸光度標(biāo)尺刻度不勻整三、吸光度測(cè)量的誤差A(yù)＝0.434

，T＝36.8%

時(shí)，測(cè)量的相對(duì)誤差最小A=0.2~0.8,T=15~65%，相對(duì)誤差<4%

dc/c=dA/A=dT/TlnTEr=dc/c×100％=dA/A×100％=dT/TlnT×100％測(cè)量誤差公式推導(dǎo):dA=d(－lgT)=d(－0.434lnT)=－0.434dT/T39A=－

lgT

TlgT最大時(shí)，即(TlgT)′=0時(shí)誤差最小,

算得lgT=－

0.434,

T=36.8%,A=0.434401086420204060800.70.40.20.1AT%Er(36.8)0.434濃度測(cè)量的相對(duì)誤差與T(或A)的關(guān)系實(shí)際工作中，應(yīng)限制T在15～65％,A在0.2～0.8之間實(shí)際工作中為使測(cè)量的濃度相對(duì)誤差較小，吸光度A限制在0.2~0.8之間。措施：通過(guò)富集、稀釋和增減比色皿長(zhǎng)度，使測(cè)量的吸光度范圍在0.2~0.8之間。7.7吸光光度法的應(yīng)用一、單一組分測(cè)定1)金屬離子:Fe-Ssal,Ni-丁二酮肟2)蛋白質(zhì)測(cè)定—溴甲酚綠、考馬司亮藍(lán)等3)氨基酸測(cè)定—茚三酮(紫色化合物)4)水質(zhì)檢測(cè):NH4+、NO2-、Mn2+、Fe2+、Hg2+5)藥物含量測(cè)定—比吸光系數(shù)定量；荷移光譜法測(cè)定。二、多組分的測(cè)定xl1,eyl1,exl2,eyl2由x,y標(biāo)液在1,2處分別測(cè)得.在1處測(cè)組分x,在2處測(cè)組分y.b)在1處測(cè)組分x;在2處測(cè)總吸取,扣除x吸取,可求y.c)x,y組分不能干脆測(cè)定 A1=exl1bcx+eyl1bcy(在1處測(cè)得A1) A2=exl2bcx+eyl2bcy(在2處測(cè)得A2)三、高濃度溶液的示差光度法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液：cs待測(cè)溶液：cx

cx>csAx=abcx

As=abcs

ΔA=ab(cx–cs)=abΔc操作以cs（濃度低于未知溶液）為參比溶液，調(diào)整T=100%(A=0);測(cè)定一系列濃度高于cs的標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度A(即ΔA）；以ΔA～Δc作工作曲線；測(cè)定未知溶液的吸光度Ax（即ΔAx）；cx=cs+Δc原理:參比溶液與未知溶液透光度的比值恒定示差法提高精確度的實(shí)質(zhì)常規(guī)法TxT051050100

落在測(cè)量誤差較大的范圍T051050100TrTsTs

落在測(cè)量誤差較小的范圍結(jié)論：示差法通過(guò)提高測(cè)量的精確度提高了方法的精確度示差法四、光度滴定47NaOH滴定對(duì)硝基酚pKa=7.15

間硝基酚pKa=8.39pKa=1.24V1V2V(NaOH)/mL對(duì)硝基酚間硝基酚酸形均無(wú)色.堿形均黃色典型的光度滴定曲線48依據(jù)滴定過(guò)程中溶液吸光度變更來(lái)確定終點(diǎn)的滴定分析方法。Vsp滴定劑吸收Vsp被滴物吸收Vsp滴定劑與待測(cè)物均吸收Vsp產(chǎn)物吸收五、絡(luò)合物組成的測(cè)定1.摩爾比法:固定cM,變更c(diǎn)R1:13:1c(R)/c(M)A1.02.03,0

2.等摩爾連續(xù)變更法:M:R=1:10.50.33