申請代碼受理部門收件日期受理編號檢查保護(hù)國家自然科學(xué)基金申請書(2011版)資助類別：您現(xiàn)在不能檢查保護(hù)文檔或打印文檔，請根據(jù)以下三個(gè)步驟操作：1)如果您是亞類說明：Word2000,wordXP,word2003或以上版本用戶，請把Word宏的安全性設(shè)為附注說明：:"中"方法:Word菜單->工具->宏->安全性->安全級,設(shè)置為"中"項(xiàng)目名稱：(如果您是Word97用戶，繼續(xù)執(zhí)行以下步驟)申請人：電話：(依托單位：如果您是Office2007用戶，點(diǎn)擊word左上角"安全警告"處"選項(xiàng)"中的通訊地址："啟用此內(nèi)容")2)關(guān)閉本文檔，重新打開本文檔郵政編碼：單位電話：3)點(diǎn)電子郵箱：擊"啟用宏"按鈕，即可開始填寫本文檔或打印了申報(bào)日期：2011年2月20日國家自然科學(xué)基金委員會國家自然科學(xué)基金申請書2011版申請者在撰寫報(bào)告正文時(shí)，請遵照以下要求：1、請先選定"項(xiàng)目基本信息"中的"資助類別"，再填寫報(bào)告正文；2、在撰寫過程中，不得刪除系統(tǒng)已生成的撰寫提綱（如誤刪可點(diǎn)擊“查看報(bào)告正文撰寫提綱”按鈕，通過"復(fù)制/粘貼"恢復(fù)）；3、請將每部分內(nèi)容填寫在提綱下留出的空白區(qū)域處；4、本要求將作為申請書正文撰寫是否規(guī)范的評判依據(jù)，請遵照要求填寫。查看報(bào)告正文撰寫提綱報(bào)告正文一、立項(xiàng)依據(jù)與研究內(nèi)容：（一）立項(xiàng)依據(jù)動脈粥樣硬化（atherosclerosis,AS）是心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，表現(xiàn)為大動脈及中動脈的血管內(nèi)壁出現(xiàn)脂質(zhì)沉積，形成分散或成片的粥樣斑塊，造成動脈管腔狹窄，隨后斑塊破裂出血，可在狹窄的動脈內(nèi)形成血栓，導(dǎo)致缺血性腦卒中、心肌梗死發(fā)生。引起AS的原因很復(fù)雜，除高血壓外，脂質(zhì)代謝紊亂，炎癥反應(yīng)以及自身免疫也是重要因素[1,2]。所以，預(yù)防AS，防止其發(fā)生與發(fā)展，對防治心腦血管疾病有重要意義。AS是多因素作用的復(fù)雜病變，巨噬細(xì)胞在AS發(fā)生、發(fā)展中有重要作用[3,4]（圖１）。在AS發(fā)病初期，單核細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞活化時(shí)合成的黏附因子作用下，與內(nèi)皮黏附后向內(nèi)皮下間隙遷移，而單核細(xì)胞本身也被活化，分化為巨噬細(xì)胞，部分通過清道夫受體攝入脂質(zhì)，形成泡沫細(xì)胞。激活的巨噬細(xì)胞能大量分泌多種細(xì)胞因子，如TNFα，IL-1β等。這些細(xì)胞因子分泌增多的結(jié)果主要表現(xiàn)在兩方面：（1）募集更多的單核細(xì)胞、白細(xì)胞到病變處，引發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)；（2）直接刺激和損傷內(nèi)皮細(xì)胞，對AS的發(fā)展起著不同的推動作用。另外，巨噬細(xì)胞還可釋放超氧陰離子自由基（O2-。）、羥自由基（OH。）及過氧化氫（H2O2），它可使低密度脂蛋白（LDL）氧化成氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)，Ox-LDL又被巨噬細(xì)胞攝取變成泡沫細(xì)胞。巨噬泡沫細(xì)胞形成后不斷的堆積，形成動脈壁脂肪條紋。單核巨噬細(xì)胞在AS發(fā)生、發(fā)展中的作用大致可以總結(jié)為以下幾點(diǎn)：(1)單核細(xì)胞的遷移和分化；(2)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞；(3)巨噬細(xì)胞在AS斑塊破裂中的作用；(4)巨噬細(xì)胞和巨噬細(xì)胞源泡沫細(xì)胞增殖與凋亡；(5)單核巨噬細(xì)胞導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。第5頁國家自然科學(xué)基金申請書2011版圖1單核細(xì)胞遷入內(nèi)膜及泡沫細(xì)胞形成模式圖基于以上事實(shí)，進(jìn)一步研究調(diào)控巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)平衡和炎癥反應(yīng)，有可能獲得更大的治療益處。抑制巨噬細(xì)胞脂質(zhì)聚積和炎癥反應(yīng)成為預(yù)防和治療AS的一個(gè)重要方向，但迄今尚未發(fā)現(xiàn)有效靶點(diǎn)。離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)參與調(diào)控細(xì)胞的多種生理功能。離子通道的改變與AS的關(guān)系也有大量報(bào)道[5-13]。Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡與高血壓、冠心病、腦動脈硬化等心腦血管疾病密切相關(guān)，已有的研究表明細(xì)胞膜鈣通道參與調(diào)控巨噬細(xì)胞泡沫化和AS的發(fā)生和發(fā)展[14]，阿莫地平能明顯抑制細(xì)胞內(nèi)膽固醇質(zhì)的聚集和泡沫化過程[15]，這表明巨噬細(xì)胞存在調(diào)控細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)從而影響其功能的途徑。鈣敏感受體(calcium-sensingreceptor,CaSR)是G蛋白耦聯(lián)受體的C家族成員。1993年﹐Brown.etal首次由牛甲狀旁腺克隆出CaSR[16]。CaSR由氨基胞外域（ECD）、7個(gè)跨膜螺旋的跨膜域（TCD）和胞內(nèi)羧基尾部所組成（見圖２）。CaSR主要分布在參與鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的甲狀旁腺、腎腸道、骨組織和腎組織以及其他細(xì)胞（例如，中樞和外周神經(jīng)、肝臟，血細(xì)胞、胰腺β細(xì)胞等）。其功能主要是維持Ca2+和其他金屬離子穩(wěn)態(tài)，尚可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、離子通道開啟、激素分泌等[17]。CaSR的配體主要是細(xì)胞外Ca2＋，Mg2＋、Gd3＋、新霉素、精胺（spermine）等多價(jià)陽離子亦是CaSR的激動劑[18]。廣泛存在于所有真核細(xì)胞的多胺(精胺、精咪和腐胺)，參與了蛋白質(zhì)的磷酸化和合成、細(xì)胞增殖、分化和凋亡以及線粒體膜通透性轉(zhuǎn)變等[19]。第6頁國家自然科學(xué)基金申請書2011版圖2CaSR的分子結(jié)構(gòu)心臟CaSR的研究始于2003年，本教研室與加拿大WangRui教授合作，在國際上首次證明了大鼠心肌有CaSR表達(dá)，精胺呈劑量依賴性使細(xì)胞內(nèi)鈣增加，該論文發(fā)表在Eur.J.Biochem（2003，270：2680–2688)（IF3.579）[20]。在隨后的工作中，我們發(fā)現(xiàn)CaSR參與多種心血管疾病的病理過程，如心肌肥大、缺血再灌注損傷、動脈粥樣硬化等[21,22]。關(guān)于在單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)中CaSR的表達(dá)及作用，盡管國內(nèi)外學(xué)者開展了一些研究，主要圍繞在骨組織中破骨細(xì)胞相關(guān)疾病[23]，但是在動脈粥樣硬化病理過程中巨噬細(xì)胞中CaSR的功能表達(dá)及其病理生理意義，迄今未見有論文發(fā)表。2011.2.20，筆者在網(wǎng)上檢索了PubMed。在“題目/摘要”范疇內(nèi)，以“鈣敏感受體”、“單核巨噬細(xì)胞”、“動脈粥樣硬化”為檢索詞聯(lián)合檢索，結(jié)果為“0”。隨著研究工作的逐漸展開，我們大膽地設(shè)想，單核巨噬細(xì)胞作為AS這一病理過程最為重要的參與者之一，其所表達(dá)的CaSR是否也參與了這一過程？如果參與，究竟在其中發(fā)揮何種作用？基于以上猜想，我們進(jìn)行了如下研究，結(jié)果已發(fā)表[24]：我們選取了被國內(nèi)外學(xué)者廣泛應(yīng)用于研究巨噬細(xì)胞相關(guān)功能的人單核細(xì)胞株THP-1，其PMA誘導(dǎo)后可分化為巨噬細(xì)胞（后均稱為THP-1）。THP-1細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞已廣泛被應(yīng)用于巨噬細(xì)胞相關(guān)的多種病理過程和疾病的研究[25,26]。THP-1細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞在形態(tài)上具有變形，偽足形成等特點(diǎn)，而且在分子結(jié)構(gòu)、受體表達(dá)等方面被認(rèn)為是最貼近天然巨噬細(xì)胞的一種體外誘導(dǎo)分化的巨噬細(xì)胞模型。我們采用Westernblot方法，結(jié)果顯示在THP-1細(xì)胞中，PMA誘導(dǎo)前后均有CaSR蛋白的表達(dá)，表現(xiàn)在110、130kD左右出現(xiàn)2條特異性條帶，分別第7頁國家自然科學(xué)基金申請書2011版為成熟型和成熟前體CaSR(圖3A)。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，CaSR蛋白定位在PMA誘導(dǎo)72h后的THP-1細(xì)胞的胞漿和胞膜(圖3B)。圖3PMA誘導(dǎo)后THP-1細(xì)胞CaSR蛋白的免疫熒光定位（×400）我們在心肌CaSR研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外鈣增加及其它CaSR激動劑(Gd3+、精胺等)可通過G蛋白-PLC-IP3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,引起肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣釋放增加,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離鈣增多，阻斷Na+-Ca2+交換體和L-type鈣通道情況亦然，說明CaSR的激活可介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣的升高[23]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)：[Ca2+]o升高可引起PMA處理72h后的THP-1細(xì)胞[Ca2+]i增加。用鈉鈣交換體抑制劑NiCl2和L型鈣通道抑制劑CdCl2作用后，提高[Ca2+]o仍可升高[Ca2+]i；此作用可被CaSR抑制劑NPS2390、PLC途徑抑制劑U73122或細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵抑制劑TG抑制。用CaSR特異激動劑GdCl3作用于THP-1后獲得相同結(jié)果。我們以上兩部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，CaSR在THP-1細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞不僅存在表達(dá)，而且能夠通過G蛋白-PLC-IP3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引起肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣釋放增加而提高[Ca2+]i。Sugimoto等[27]報(bào)導(dǎo)，提高[Ca2+]o可增加外周血中單核細(xì)胞的化學(xué)趨向性。在我們的實(shí)驗(yàn)中，在用GdCl3處理PMA誘導(dǎo)72h的THP-1細(xì)胞后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、TNFα的含量明顯升高，該作用可被CaSR特異抑制劑NPS2390所抑制(圖4)。第8頁國家自然科學(xué)基金申請書2011版圖4CaSR活化對細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的分泌情況的影響以上的結(jié)果證實(shí)：CaSR在單核巨噬細(xì)胞中有功能性表達(dá)，且能夠影響單核巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌的功能。這些證據(jù)為我們的設(shè)想提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。根據(jù)以上結(jié)果，我們做出了如下假設(shè)(圖5)：圖5試驗(yàn)設(shè)計(jì)及預(yù)想結(jié)果為證明此假說，本項(xiàng)目擬在細(xì)胞水平通過RNA干擾技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)CaSR與細(xì)胞內(nèi)鈣的關(guān)系，明確CaSR參與巨噬細(xì)胞泡沫化和促進(jìn)細(xì)胞因子分泌，并深入探討其機(jī)制。本研究將揭示CaSR與AS發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其信號傳導(dǎo)途徑，無疑具有理論意義和應(yīng)用價(jià)值。課題的實(shí)施可望為AS的防治提供一種新思路和藥物作用新靶點(diǎn)。第9頁國家自然科學(xué)基金申請書2011版參考文獻(xiàn)1.LibbyP,RidkerPM,MaseriAInflammationandatherosclerosis.Circulation.2002Mar5;105(9):1135-1143.2.Theimmunesysteminatherosclerosis.HanssonGK,HermanssonA.NatImmunol.2011;12(3):204-212.3.4.DavisNE.Atherosclerosis--aninflammatoryprocess.JInsurMed.2005;37(1):72-75.BrelandUM,MichelsenAE,SkjellandM,FolkersenL,Krohg-S?rensenK,RussellD,UelandT,YndestadA,Paulsson-BerneG,Dam?sJK,OieE,HanssonGK,HalvorsenB,AukrustP.RaisedMCP-4levelsinsymptomaticcarotidatherosclerosis:aninflammatorylinkbetweenplateletandmonocyteactivation.CardiovascRes.2010;86(2):265-273.5.6.ToyamaK,WulffH,ChandyKG,AzamP,RamanG,SaitoT,FujiwaraY,MattsonDL,DasS,MelvinJE,PrattPF,HatoumOA,GuttermanDD,HarderDR,MiuraH.Theintermediate-conductancecalcium-activatedpotassiumchannelKCa3.1contributestoatherogenesisinmiceandhumans.JClinInvest.2008Sep;118(9):3025-3037.KimMJ,ChengG,AgrawalDK.Cl-channelsareexpressedinhumannormalmonocytes:afunctionalroleinmigration,adhesionandvolumechange.ClinExpImmunol.2004;138(3):453-459.7.8.HenryPD.Atherosclerosis,calcium,andcalciumantagonists.Circulation.1985Sep;72(3):456-459.PittB,ByingtonRP,FurbergCD,HunninghakeDB,ManciniGB,MillerME,RileyW.Effectofamlodipineontheprogressionofatherosclerosisandtheoccurrenceofclinicalevents.PREVENTInvestigators.Circulation.2000Sep26;102(13):1503-1510.9.J?rgensenB,SimonsenS,EndresenK,ForfangK,VatneK,HansenJ,WebbJ,BullerC,GouletG,ErikssenJ,ThaulowE.Restenosisandclinicaloutcomeinpatientstreatedwithamlodipineafterangioplasty:resultsfromtheCoronaryAngioPlastyAmlodipineREStenosisStudy(CAPARES).JAmCollCardiol.2000Mar1;35(3):592-599.10.NakanoK,EgashiraK,OhtaniK,GangZ,IwataE,MiyagawaM,SunagawaK.Azelnidipinehasanti-atheroscleroticeffectsindependentofitsbloodpressure-loweringactionsinmonkeysandmice.Atherosclerosis.2008;196(1):172-179.11.TulenkoTN,Laury-KleintopL,WalterMF,MasonRP.Cholesterol,calciumandatherosclerosis:istherearoleforcalciumchannelblockersinatheroprotection?IntJCardiol.1997;31(2):S55-66.12.DaughertyA,RateriDL,SchonfeldG,SobelBE.Inhibitionofcholesterylesterdepositioninmacrophagesbycalciumentryblockers:aneffectdissociablefromcalciumentryblockade.BrJPharmacol.1987May;91(1):113-118.第10頁國家自然科學(xué)基金申請書2011版13.MasonRP.Mechanismsofplaquestabilizationforthedihydropyridinecalciumchannelblockeramlodipine:reviewoftheevidence.Atherosclerosis.2002Dec;165(2):191-199.14.YamaguchiT,KiforO,ChattopadhyayN,BaiM,BrownEM.(1998)Extracellularcalcium(Ca2+o)-sensingreceptorinamousemonocyte-macrophagecellline(J774):potentialmediatoroftheactionsofCa2+oonthefunctionofJ774cells.JBoneMinerRes13:1390–1397.15.DaughertyA,RateriDL,SchonfeldG,SobelBE.Inhibitionofcholesterylesterdepositioninmacrophagesbycalciumentryblockers:aneffectdissociablefromcalciumentryblockade.BrJPharmacol.1987May;91(1):113-118.16.BrownEM,GambaG,RiccardiD,LombardiM,ButtersR,KiforO,SunA,HedigerMA,LyttonJ,HebertSC.CloningandcharacterizationofanextracellularCa(2+)-sensingreceptorfrombovineparathyroid.Nature.1993Dec9;366(6455):575-580.17.Brown,EdwardM.,andR.JohnMacLeod.ExtracellularCalciumSensingandExtracellularCalciumSignaling.PhysiolRev2001;81:239–297.18.ZiegelsteinRC,XiongY,HeC,HuQ.Epub2006Feb3.Expressionofafunctionalextracellularcalcium-sensingreceptorinhumanaorticendothelialcells.BiochemBiophysResCommun.2006Mar31;342(1):153-163.19.SmajilovicS,HansenJL,ChristoffersenTE,LewinE,SheikhSP,TerwilligerEF,BrownEM,HaunsoS,Tfelt-HansenJ.BiochemBiophysResCommun.Extracellularcalciumsensinginrataorticvascularsmoothmusclecells.2006Oct6;348(4):1215-1223.20.andpolyamineregulatedcalcium-sensingreceptorsincardiactissues.2003Jun;270(12):2680-2688.21.GuoJ,LiHZ,ZhangWH,WangLC,WangLN,ZhangL,LiGW,LiHX,YangBF,WuL,WangR,XuCQ.Increasedexpressionofcalcium-sensingreceptorsinducedbyox-LDLamplifiesapoptosisofcardiomyocytesduringsimulatedischaemia/reperfusion.ClinExpPharmacolPhysiol.2010;37(3):e128-135.22.WangLN,WangC,LinY,XiYH,ZhangWH,ZhaoYJ,LiHZ,TianY,LvYJ,YangBF,XuCQInvolvementofcalcium-sensingreceptorincardiachypertrophy-inducedbyangiotensinIIthroughcalcineurinpathwayinculturedneonatalratcardiomyocytes.BiochemBiophysRes23.RichardC,HuoR,SamadfamR,BolivarI,MiaoD,BrownEM,HendyGN,GoltzmanD.Thecalcium-sensingreceptorand25-hydroxyvitaminD-1alpha-hydroxylaseinteracttomodulateskeletalgrowthandboneturnover.JBoneMinerRes.2010Jul;25(7):1627-1636.24.Yu-huiXi,Hong-zhuLi,Wei-huaZhang,Li-naWang,LiZhang,YanLin,Shu-zhiBai,Hong-xiaLi,Ling-yunWu,RuiWang,Chang-qingXu.TheFunctionalExpressionofCalcium-sensingReceptorintheDifferentiatedTHP-1Cells.MolecularandCellularBiochemistry.第11頁國家自然科學(xué)基金申請書2011版2010;342(1-2):233-240.25.AuwerxJThehumanleukemiacellline,THP-1:amultifacettedmodelforthestudyofmonocyte-macrophagedifferentiation.Experientia.1991;47(1):22-31.26.DaigneaultM,PrestonJA,MarriottHM,WhyteMK,DockrellDHTheidentificationofmarkersofmacrophagedifferentiationinPMA-stimulatedTHP-1cellsandmonocyte-derivedmacrophages.2010;PLoSOne5(1):e866827.SugimotoT,KanataniM,KanoJ,KajiH,TsukamotoT,YamaguchiT,FukaseM,ChiharaK.Effectsofhighcalciumconcentrationonthefunctionsandinteractionsofosteoblasticcellsandmonocytesandontheformationofosteoclast-likecells.JBoneMinerRes.1993;8(12):1445-1452.(二)項(xiàng)目的研究內(nèi)容、研究目標(biāo),以及擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題。1.研究內(nèi)容1.1利用基因沉默技術(shù)進(jìn)一步明確CaSR在THP-1源性巨噬細(xì)胞有功能性表達(dá)文獻(xiàn)報(bào)道，欲證明某組織有CaSR的功能表達(dá)，需證明：（1）Westernblot以及免疫熒光等方法確定存在CaSR蛋白表達(dá)；（2）[Ca2+]o增加可引起[Ca2+]i增加；（3）[Ca2+]i增加源于細(xì)胞鈣庫的動員；（4）細(xì)胞外鈣內(nèi)流不是經(jīng)過電壓依賴性鈣通道，而是通過鈣庫操縱性鈣通道；（5）Ca2+、Gd3+等為CaSR激動劑。本課題組前期試驗(yàn)按上述思路和方法（包括各種相關(guān)阻滯劑），已首次證實(shí)THP-1源性巨噬細(xì)胞有CaSR的功能性表達(dá)（見立題依據(jù)中參考文獻(xiàn)24）。鑒于目前沒有針對CaSR的具有絕對特異性的激動劑和抑制劑，為彌補(bǔ)前期工作的缺陷以及使試驗(yàn)結(jié)果更嚴(yán)謹(jǐn)可靠，本課題將合成針對于CaSR的siRNA，轉(zhuǎn)染THP-1，以沉默CaSR。用未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為對照組，以CaSR沉默細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，重復(fù)前期試驗(yàn)，進(jìn)一步明確CaSR在THP-1源性巨噬細(xì)胞有功能性表達(dá)。1.2觀察Ox-LDL對THP-1源性巨噬細(xì)胞CaSR的表達(dá)和活性的影響無論CaSR的表達(dá)增加，還是活性增強(qiáng)，都能通過G蛋白-PLC-IP3通路引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)鈣釋放（通過受體依賴性鈣通道）和外鈣內(nèi)流（通過鈣庫操縱性鈣通道），結(jié)果引起細(xì)胞內(nèi)鈣([Ca2+]i)增加，后者作為第二信使而發(fā)揮重要的作用。為證明巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)動脈粥樣硬化（AS）發(fā)生的過程中確有CaSR的參與，首先必第12頁國家自然科學(xué)基金申請書2011版須證明Ox-LDL可使THP-1源性巨噬細(xì)胞CaSR的表達(dá)增加和活性增強(qiáng)。為此，我們將利用Westernblot技術(shù)，以PMA誘導(dǎo)后THP-1細(xì)胞為對照，觀察不同濃度Ox-LDL和不同誘導(dǎo)時(shí)間后巨噬細(xì)胞CaSR表達(dá)的變化，用免疫熒光等技術(shù)觀察CaSR在細(xì)胞內(nèi)定位是否發(fā)生變化，用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)比較各組巨噬細(xì)胞[Ca2+]i的變化幅度，來判斷Ox-LDL對CaSR活性的影響。1.3觀察CaSR的活化是否影響巨噬細(xì)胞泡沫化過程巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞，是動脈粥樣硬化斑塊中的重要組成部分。其形成是以O(shè)x-LDL增多為啟動因素。增加的Ox-LDL激活巨噬細(xì)胞表面的清道夫受體-A(scavengerreceptor，SR-A)。SR-A蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行N端糖基化和三聚體排列，三聚體在細(xì)胞表面能結(jié)合其配體之一-Ox-LDL形成受體-配體復(fù)合物，該復(fù)合物聚集形成小泡再轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)，在酸性環(huán)境下，Ox-LDL釋放出來，SR-A再循環(huán)。過多的脂質(zhì)在巨噬細(xì)胞內(nèi)堆積，超過細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)處理能力，巨噬細(xì)胞就轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞，越來越多的泡沫細(xì)胞堆積在一起形成脂質(zhì)條紋乃至脂質(zhì)斑塊，導(dǎo)致動脈粥樣硬化的發(fā)生。巨噬細(xì)胞泡沫化過程直接關(guān)系A(chǔ)S的發(fā)生和發(fā)展。所以，我們在明確CaSR的表達(dá)與活性變化后，繼續(xù)觀察激活CaSR是否可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞的泡沫化而加快AS的進(jìn)展。我們將細(xì)胞分為對照組和CaSR干擾組，以THP-1為對照，在有或無CaSR激活劑或抑制劑的作用下采用形態(tài)學(xué)檢測方法--油紅O染色(細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)為紅色，胞核為藍(lán)色)、膽固醇含量HPLC測定法（具體方法后詳）檢測巨噬細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)膽固醇/脂質(zhì)含量的多少，從而判斷巨噬細(xì)胞泡沫化的程度。根據(jù)以上分組，我們還將用westernblot分析CaSR的活化是否影響巨噬細(xì)胞的清道夫受體的表達(dá)，從而證明CaSR的活化參與巨噬細(xì)胞泡沫化過程的分子機(jī)制。1.4觀察CaSR的活化對泡沫化巨噬細(xì)胞合成分泌細(xì)胞因子功能的影響炎癥反應(yīng)貫穿于AS發(fā)生的始終。在動脈粥樣斑塊中，巨噬細(xì)胞是最重要的炎癥細(xì)胞，即使在吞噬大量脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞后，其也在刺激因素的作用下，合成并釋放大量的炎癥介質(zhì)，如：白細(xì)胞介素-6（IL-6）、TNFα、IL-1等，募集和激活更多炎癥細(xì)胞（包括單核細(xì)胞）遷移至內(nèi)皮下，分化為巨噬細(xì)胞，進(jìn)一步引起急性炎癥反應(yīng)，損傷血管內(nèi)皮組織，加重動脈粥樣硬化的進(jìn)程。第13頁國家自然科學(xué)基金申請書2011版根據(jù)這一事實(shí)，我們將THP-1細(xì)胞分組（詳見技術(shù)路線），在有/無CaSR抑制劑NPS2390前提下，提高細(xì)胞外鈣或釓的濃度激活CaSR，利用RealTime-PCR方法檢測細(xì)胞因子（IL-1β，IL-6，TNFα等）mRNA水平的變化，判斷CaSR對巨噬細(xì)胞合成細(xì)胞因子功能的影響；利用ELISA方法,檢測泡沫化THP-1細(xì)胞培養(yǎng)基中多種細(xì)胞因子的含量，用以判斷CaSR對巨噬細(xì)胞分泌功能的影響。以TNFα為例，其在細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的上游調(diào)控通路主要為NFκB信號通路，NFκB信號通路中的重要調(diào)控蛋白IκBα接受PI3K-PIP2-AKT通路的調(diào)控，而CaSR的激活將影響PI3K-PIP2-AKT通路，所以我們在這一部分將觀察PI3K-PIP2-AKT-NFκB通路的變化，用以證明Ox-LDL激活的CaSR通過PI3K-PIP2-AKT-NFκB通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的分泌功能。我們利用Westernblot技術(shù)分別檢測正常對照組、CaSR激動劑組和CaSR抑制劑組巨噬細(xì)胞的NFκB信號通路相關(guān)蛋白的變化，其中包括PI3K、AKT、IκBα、NFκB-p65、NFκB-p50蛋白表達(dá)變化。由于NFκB的激活與亞單位p65的核轉(zhuǎn)位密切相關(guān)，所以我們利用免疫熒光技術(shù)檢測NFκB-p65和NFκB-p50的細(xì)胞定位。我們還將應(yīng)用NFκB抑制劑（Pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC）抑制NFκB信號通路，利用ELISA技術(shù)分析CaSR激活前后THP-1分泌細(xì)胞因子功能的變化，以證明NFκB信號通路是否參與這一過程。2.研究目標(biāo)（1）采用RNA干擾技術(shù)，在細(xì)胞水平進(jìn)一步證實(shí)CaSR活化與細(xì)胞內(nèi)鈣升高的關(guān)系；（2）從巨噬細(xì)胞泡沫化和細(xì)胞因子分泌的角度，深入探討CaSR與AS發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其信號傳導(dǎo)途徑，為AS的防治提供一種新思路和藥物作用新靶點(diǎn)3.擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題(1)學(xué)術(shù)上的關(guān)鍵問題：既往在AS相關(guān)研究中已證實(shí)，巨噬細(xì)胞活化與Ca2+之間的關(guān)系密切，且都與AS相關(guān)，但三者之間的確切聯(lián)系尚缺少足夠的證據(jù)。本課題擬在明確CaSR與巨噬細(xì)胞[Ca2+]i關(guān)系的基礎(chǔ)上（已基本完成），證明CaSR激活介導(dǎo)的[Ca2+]i的提高通過增加清道夫受體的表達(dá)促進(jìn)巨噬細(xì)胞泡沫化過程，并可通過NFκB信號通路刺激細(xì)胞因子的合第14頁國家自然科學(xué)基金申請書2011版成和釋放。我們的假說將進(jìn)一步揭示AS的發(fā)生機(jī)制，并為其防治提供一種新思路和新靶點(diǎn)。技術(shù)上的關(guān)鍵問題:(1)針對于CaSR的siRNA的設(shè)計(jì)，以及轉(zhuǎn)染平臺的建立由于巨噬細(xì)胞是終末分化的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染相對較難，所以我們打算采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和腺病毒方法同時(shí)進(jìn)行。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法較簡單，而腺病毒轉(zhuǎn)染需要注意如下幾點(diǎn)：Ⅰ純化siRNAⅡ避免RNA酶污染Ⅲ避免使用抗生素Ⅳ通過看家基因作為陽性對照優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測條件(2)細(xì)胞內(nèi)游離鈣的測定激光共聚焦顯微鏡用于細(xì)胞內(nèi)游離鈣的測定，由于鈣離子探針Fluo-3/AM是熒光染料，所以處理后細(xì)胞需要避光放置，并減少各組監(jiān)測時(shí)間差，盡量消除染料自身淬滅而產(chǎn)生的誤差。(3)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的測定細(xì)胞內(nèi)膽固醇的測定需要用到高效液相色譜，對于這一設(shè)備的應(yīng)用，安靜穩(wěn)定的檢測環(huán)境、恒流恒溫的流動項(xiàng)對于獲得可信的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是必須的。膽固醇檢測所需的色譜柱為HypersilC18柱(2.1mm×150mm，3μm)，其運(yùn)行條件是：流動相：甲醇一水(90:10)；流速：0.5mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10μL。（三）擬采取的研究方案及可行性分析。1.技術(shù)路線、實(shí)驗(yàn)手段、關(guān)鍵技術(shù)等說明1)技術(shù)路線（1）利用基因沉默技術(shù)進(jìn)一步明確CaSR在巨噬細(xì)胞中存在功能性表達(dá)第15頁國家自然科學(xué)基金申請書2011版（2）明確巨噬細(xì)胞的CaSR的表達(dá)和活性對Ox-LDL濃度和時(shí)間依賴性(3)明確CaSR對Ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞泡沫化過程的影響及清道夫受體表達(dá)的影響第16頁國家自然科學(xué)基金申請書2011版(4)明確CaSR對泡沫化巨噬細(xì)胞的分泌功能的影響(5)證明CaSR通過PI3K-PIP2-AKT-NFκB通路影響泡沫化巨噬細(xì)胞合成細(xì)胞因子2)實(shí)驗(yàn)手段(1)細(xì)胞培養(yǎng)及建立泡沫細(xì)胞模型將THP－1細(xì)胞置于含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。該細(xì)胞株屬人類單核細(xì)胞系，在培養(yǎng)液中呈簇集狀懸浮生長，倍增時(shí)間大約在26h后。細(xì)胞濃度控制在106/mL，每兩天換液一次，每四天傳代一次。細(xì)胞復(fù)蘇后，傳至3～5代后方可用于建模。(2)建立巨噬細(xì)胞模型取對數(shù)生長期的細(xì)胞，分為正常組和模型組，調(diào)整細(xì)胞濃度為106/mL，接種于6孔培第17頁國家自然科學(xué)基金申請書2011版養(yǎng)板，每孔2mL。正常組在含10％胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)。模型組先置于含160nmol/LPMA的RPMIl640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中培養(yǎng)72h，貼壁后輕輕吸去上清液，PBS洗3遍，更換10％胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液，即得巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞的鑒定已在發(fā)表文獻(xiàn)中完成。(3)建立巨噬源性泡沫細(xì)胞模型將獲得的巨噬細(xì)胞更換含3％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，并加入終濃度為80mg/L的Ox-LDL，共同孵育48h，油紅O染色后，鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)充滿橘紅色脂滴，即得泡沫細(xì)胞模型，此過程即為泡沫化。(4)針對CaSR的siRNA的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染根據(jù)公認(rèn)的siRNA設(shè)計(jì)原則（NatBiotech2004；22：326-330）設(shè)計(jì)針對CaSR的3條siRNA，選用驗(yàn)證后效果最好的一條。同時(shí)合成陽性對照和陰性對照。轉(zhuǎn)染試劑選用Invitrogen公司生產(chǎn)的Lipofectamine?RNAiMAXTransfectionReagent。siRNA目標(biāo)序列的選取原則：Ⅰ從轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3'端的19個(gè)堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。注意：GC含量在45%-55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效；在設(shè)計(jì)siRNA時(shí)不要針對5'和3'端的非編碼區(qū)（untranslatedregions，UTRs)，原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的效果。Ⅱ?qū)撛诘男蛄泻拖鄳?yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人、小鼠或大鼠等）進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。使用/BLAST/）Ⅲ選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。通常一個(gè)基因需要設(shè)計(jì)多個(gè)靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。Ⅳ陰性對照一個(gè)完整的siRNA實(shí)驗(yàn)應(yīng)該有陰性對照，作為陰性對照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。即將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和目的靶細(xì)胞中其他基因沒有同源性。提取蛋白，用RealTime-PCR和WesternBlot技術(shù)驗(yàn)證CaSR的mRNA和蛋白表達(dá)水平，明確siRNA效果。(5)Real-TimePCR第18頁國家自然科學(xué)基金申請書2011版1)細(xì)胞總RNA提取：按Trizol試劑盒說明書進(jìn)行，具體操作步驟如下：在細(xì)胞中加入冰預(yù)冷的Trizol試劑，室溫靜置5min；加200μl氯仿，充分搖勻l5sec，室溫靜置2-3min；4oC，12000rpm離心15min，取上層無色水相層轉(zhuǎn)移至新EP管；加等體積異丙醇，室溫靜置10min，4oC，12000rpm離心10min，管壁底處可見乳白色沉淀，即為RNA；棄上清，加75%乙醇1ml，4oC，7500rpm離心5min，洗滌二次；棄上層乙醇，無菌環(huán)境風(fēng)干RNA沉淀。用20μ1DEPC處理的雙蒸餾水(ddH2O)溶解RNA沉淀，-80oC備用；取4μl總RNA加至200μl滅菌水中，在紫外分光光度儀上測定其OD260和OD280，計(jì)算OD260/OD280。樣品總RNA（ug/μl）=OD260×40×稀釋倍數(shù)（50）/1000。OD260/OD280在1.8-2.0之間為樣品較純。2）反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：在20μl反應(yīng)體積中進(jìn)行，成分如下：總RNA2ug(5μl)，隨機(jī)引物1μl，DEPC處理的ddH2O4.5μl，70oC冰浴10min；加10μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液(10×buffer2μl，MgCL24μl，dNTP2μl，inhibitor0.5μl，逆轉(zhuǎn)錄酶1μl)，42oC冰浴60min，99oC冰浴5min，-20oC保存?zhèn)溆谩?）引物擴(kuò)增設(shè)計(jì)：根據(jù)Genebank序列，設(shè)計(jì)各個(gè)引物序列并合成。4）實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)方法：使用寶生物工程（大連）有限公司的SYRB?PremixExTaqTM和LightCyclerPCR擴(kuò)增儀（Roche）進(jìn)行熒光擴(kuò)增；求出CT值。(6)激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)測定THP-1細(xì)胞內(nèi)游離鈣的變化取6孔板進(jìn)行THP-1細(xì)胞培養(yǎng),事先在6孔板中加入蓋玻片。取6孔培養(yǎng)板中的蓋玻片,D-Hanks液沖洗2遍,用100μL的鈣離子探針Fluo-3/AM與F-127混合工作液(10μmol/LFluo-3/AM,0.02%F-127)滴于蓋玻片上,37℃避光40min，D-Hanks液再次沖洗玻片3遍,洗去多余染料,保留少許D-Hanks液平衡細(xì)胞10min,分組施加因素后,于10min內(nèi)利用LSCM進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度檢測。(7)油紅O染色油紅O屬于偶氮染料，是很強(qiáng)的脂溶劑和染脂劑，與甘油三酯結(jié)合呈小脂滴狀。脂溶性染料能溶于組織和細(xì)胞中的脂類，它在脂類中的溶解度比在溶劑中大。當(dāng)組織切片置人染液時(shí)，染料則離開染液而溶于組織內(nèi)的脂質(zhì)(如脂滴)中，使組織內(nèi)的脂滴呈橘紅色。細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，誘導(dǎo)建模結(jié)束后，吸去上清液，用PBS洗三次，冰凍的4％多聚甲醛固定5min，PBS洗一次，再置于丙二醇中固定5min，輕輕吸去丙二醇，加入第19頁國家自然科學(xué)基金申請書2011版0.5％油紅O的丙二醇溶液，置60℃烤箱中染色15min，用85％丙二醇沖洗5min，再用PBS洗三次，蒸餾水清洗1次，蘇木素復(fù)染2-5min，1%HCL分色及返藍(lán)后封片。置顯微鏡下觀察并攝像，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)為紅色，胞核為藍(lán)色。參考文獻(xiàn)：ZhengXD,LiQ,TangXB,LiangSJ,ChenLP,ZhangS,WangZG,GuoL,ZhangR,ZhuDL.SourceoftheelevationCa2+evokedby15-HETEinpulmonaryarterialmyocytes.EuropeanJournalofPharmacology2008;601:16-22.(8)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的測定細(xì)胞內(nèi)膽固醇的提?。杭?xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)結(jié)束后，吸去上清液，冰預(yù)冷PBS洗三次，用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞，加1mL冰預(yù)冷0.9％生理鹽水重懸細(xì)胞，反復(fù)凍融三次，冰浴中超聲破碎5min，得細(xì)胞裂解液，分裝，每份200μL，-70℃貯存，用于測定總膽固醇和游離膽固醇。總膽固醇的提?。喝?60μL上述細(xì)胞裂解液，加300μLl5％KOH乙醇溶液，50℃水解2h，加正己烷-異丙醇(4:1)500μL，渦漩30s，4℃下3600r/min離心5min，取上層。繼用正己烷-異丙醇(4:1)如上法抽提兩次，合并三次抽提的有機(jī)相，減壓真空干燥，加20μL內(nèi)標(biāo)儲備液，用甲醇并定容至2mL，搖勻，作為總膽固醇供試品溶液。游離膽固醇的提?。喝?60μL上述細(xì)胞裂解液，加300μL乙醇，加正己烷-異丙醇(4:1)500μL渦漩30s，4℃下3600r/min離心5min，取上層。繼用正己烷-異丙醇(4:1)如上法抽提兩次，合并三次抽提的有機(jī)相，減壓真空干燥，加2OμL內(nèi)標(biāo)儲備溶解并定容至2mL，搖勻，作為游離膽固醇供試品溶液。HPLC測定膽固醇：色譜柱：HypersilC18柱(2.1mm×150mm，3μm)；流動相：甲醇一水(90:10)；流速：0.5mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10μL。參考文獻(xiàn)：唐朝克,王佐,易光輝,萬載陽,劉錄山,袁中華,王燕,危當(dāng)恒,阮長耿,楊永宗.Rolipram對THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞膽固醇流出和ABCA1表達(dá)的影響.中國藥理學(xué)通報(bào).2003oct;19(10):1177-82(9)ELISA法檢測細(xì)胞因子的分泌情況按每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于24孔板中，含有160nmol/LPMA的培養(yǎng)液培養(yǎng)72小時(shí)后，PBS洗三遍，各組加入處理因素，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。從平衡至室溫的密封袋中取出實(shí)驗(yàn)所需板條，留空白孔。加0.1ml離心后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液于反應(yīng)孔中，置37℃孵育90分鐘。然后洗板5次。(同時(shí)做空白孔，標(biāo)準(zhǔn)品空)。于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的生物素化抗體工作液0.1ml，37℃孵育1小時(shí)，洗板5次。加酶結(jié)合工作液0.1ml，37℃避光孵育30分鐘，洗板5次。加入0.1ml顯色底物液，37℃避光孵育15分鐘：第20頁國家自然科學(xué)基金申請書2011版于各反應(yīng)孔中加入終止液0.1ml，混勻后即可測量OD450值。(10)WesternBlot檢測蛋白表達(dá)變化1）總蛋白的提取：收集細(xì)胞，加入冰預(yù)冷的蛋白裂解液（lmmol/LPMSF，pH7.4)，混勻，超聲破碎細(xì)胞；4oC，12000rpm，離心15min，取上清液，用考馬斯亮藍(lán)法染色，測定蛋白含量；取上清加入5*上樣緩沖液（體積比4：1），100oC沸水中煮5min，-20oC備用。2）SDS電泳：按照膠配置方法配制不同濃度PAGE膠，電泳置染料抵達(dá)分離膠底部，斷開電源，取下凝膠。切下帶有要轉(zhuǎn)移蛋白泳道的凝膠，右下角作一標(biāo)記以確定方向及正反面。3）轉(zhuǎn)膜：剪1塊與凝膠大小相同的NC膜（不能大于凝膠），右下角作一標(biāo)記，浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中，大約5min。剪8塊濾紙，右下角作一標(biāo)記，其大小略與凝膠相同（不能大于凝膠）。將剪好的濾紙?jiān)谵D(zhuǎn)移緩沖液中浸泡，按陽極到陰極（從下至上）順序安裝轉(zhuǎn)移裝置：平放底部電極，在底部電極上放置4張浸泡好的濾紙，精確對齊，將NC膜放在濾紙上，排除氣泡。把SDS電泳凝膠轉(zhuǎn)移到去轉(zhuǎn)移緩沖液中漂洗，平放于NC膜上，用玻棒擠出所有氣泡，在其上再放置4張浸泡好的濾紙，排出氣泡。將上層電極放于夾層物上，連接電源，根據(jù)凝膠面積按1mA/cm2接通電源。4）封閉：轉(zhuǎn)移結(jié)束后，在TBS-T液內(nèi)清洗20min，加5%脫脂奶粉，37oC封閉1h。5）一抗孵育:封閉結(jié)束后，用TBS-T稀釋第一抗體，將NC濾膜置于其中，4oC震蕩過夜。6）顯跡:TBS-T液漂洗NC膜3次/10min，將膜與TBS-T稀釋二抗孵育，室溫下振蕩1h；TBS-T漂洗NC膜3次/10min；TBS液漂NC膜3次/10min，X光膠片上曝光，隨后顯影、定影，用圖像分析系統(tǒng)測定蛋白條帶的光密度，進(jìn)行定量分析。(11)免疫熒光技術(shù)檢測蛋白表達(dá)定位1)細(xì)胞生長貼在玻片上，細(xì)胞密度適中，大約60-75%滿片即可。2)取出細(xì)胞后用4%多聚甲醛固定15分鐘，現(xiàn)用現(xiàn)配。3)PBS沖洗。4)0.1%Triton作用20分鐘。5)PBS沖洗。6)10%正常血清封閉10分鐘。第21頁國家自然科學(xué)基金申請書2011版7)加入一抗，4度孵育過夜。8)PBS沖洗4次，各5分鐘。9)加入熒光二抗，室溫30分鐘。10)PBS沖洗4次，各5分鐘。11)90%甘油封片。12)避光保存，熒光顯微鏡下觀察并照相記錄。3)關(guān)鍵技術(shù)（詳見：2)實(shí)驗(yàn)手段）(1)CaSR的siRNA的設(shè)計(jì)及轉(zhuǎn)染平臺的建立由于巨噬細(xì)胞是終末分化的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染相對較難。siRNA的轉(zhuǎn)染需要注意如下幾點(diǎn)：Ⅰ純化siRNAⅡ避免RNA酶污染Ⅲ避免使用抗生素Ⅳ通過看家基因作為陽性對照優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測條件。(2)細(xì)胞內(nèi)游離鈣的測定激光共聚焦顯微鏡用于細(xì)胞內(nèi)游離鈣的測定，由于鈣離子探針Fluo-3/AM是熒光染料，所以處理后細(xì)胞需要避光放置，并減少各組監(jiān)測時(shí)間差，盡量消除染料自身淬滅而產(chǎn)生的誤差。(3)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的測定細(xì)胞內(nèi)膽固醇的測定需用高效液相色譜，對于這一設(shè)備的應(yīng)用，安靜穩(wěn)定的檢測環(huán)境、恒流恒溫的流動項(xiàng)對于獲得可信的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是必須的。膽固醇檢測所需的色譜柱為HypersilC18柱(2.1mm×150mm，3μm)，其運(yùn)行條件是：流動相：甲醇一水(90:10)；流速：0.5mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10μL。2．可行性分析(1)理論的可行性眾多研究業(yè)已證明，巨噬細(xì)胞的泡沫化和致炎細(xì)胞因子的過度釋放在動脈粥樣硬化的發(fā)生中起關(guān)鍵作用。我們的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果已揭示CaSR在巨噬細(xì)胞有功能性表達(dá)，并且激活后可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子的釋放。可見，我們的假說在理論上是可行的。（2）研究方法和實(shí)驗(yàn)條件的可行性本項(xiàng)目采用的所有實(shí)驗(yàn)手段是國內(nèi)外研究中廣泛第22頁國家自然科學(xué)基金申請書2011版采用方法，技術(shù)十分成熟，申請者及其他主要實(shí)驗(yàn)者已熟練掌握相關(guān)技術(shù)。哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病生教研室及基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院已具備開展本課題研究所需的實(shí)驗(yàn)條件及儀器設(shè)備。（3）研究隊(duì)伍的可行性本課題組所在研究室在CaSR與心血管相關(guān)疾病的研究上居國內(nèi)外領(lǐng)先水平。到目前為止，我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CaSR在心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、肝細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均有表達(dá)，在缺血再灌注損傷、心肌肥大、動脈粥樣硬化多種病理過程中發(fā)揮重要作用。本課題組成員由具有多年分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)科研經(jīng)驗(yàn)的中青年學(xué)者組成，前期試驗(yàn)結(jié)果已發(fā)表SCI論文多篇。（四）本項(xiàng)目的特色與創(chuàng)新之處。1.本項(xiàng)目首次在巨噬細(xì)胞水平將動脈粥樣硬化這一病理過程與CaSR的功能聯(lián)系起來，國內(nèi)外尚未見類似報(bào)道。研究結(jié)果將從新的視角進(jìn)一步動脈粥樣硬化的發(fā)生機(jī)制，為其有效防治提供新思路和新靶點(diǎn)。2．本試驗(yàn)采用抑制劑的應(yīng)用與siRNA技術(shù)作為平行觀察手段，為以上的結(jié)論打下夯實(shí)的基礎(chǔ)。（五）年度研究計(jì)劃及預(yù)期研究結(jié)果。１.年度研究計(jì)劃1)2012年1月-2012年12月完成CaSR沉默SiRNA的構(gòu)建，并建立穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染平臺，完成對在沉默CaSR后THP-1源性巨噬細(xì)胞的CaSR活性的檢測。2)2013年1月-2013年12月完成觀察Ox-LDL對THP-1源性巨噬細(xì)胞CaSR的表達(dá)和活性的影響，以及檢測CaSR的活化是否影響巨噬細(xì)胞泡沫化過程。3)2014年1月-2014年6月觀察CaSR的活化對泡沫化巨噬細(xì)胞合成分泌細(xì)胞因子功能的影響4)2014年7月-2014年12月完善研究內(nèi)容，根據(jù)需要補(bǔ)充試驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)資料，撰寫論文，結(jié)題。2.預(yù)期研究結(jié)果第23頁國家自然科學(xué)基金申請書2011版(1)研究工作將能夠比較系統(tǒng)地闡明CaSR與巨噬細(xì)胞泡沫化，以及細(xì)胞因子分泌功能之間的聯(lián)系，進(jìn)一步說明CaSR與動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展之間的內(nèi)在聯(lián)系，從而為評估CaSR是否可以作為防治動脈粥樣硬化一系列疾病的新靶點(diǎn)提供充分的理論基礎(chǔ)。(2)本課題所得研究結(jié)果預(yù)計(jì)在國際雜志（SCI）發(fā)表論文2篇，國內(nèi)核心期刊發(fā)表論文2篇。二、研究基礎(chǔ)與工作條件（一）工作基礎(chǔ)1．本課題組對CaSR的研究始于2003年，本與加拿大WangRui教授合作，在國際上首次證明了大鼠心肌有CaSR表達(dá)，精胺呈劑量依賴性使細(xì)胞內(nèi)鈣增加。在隨后的工作中，我們發(fā)現(xiàn)CaSR參與多種心血管疾病的病理過程，如心肌肥大、缺血再灌注損傷、動脈粥樣硬化等，并發(fā)表多篇SCI論文。2．2005年以來，本課題組對鈣敏感受體在單核巨噬細(xì)胞中的作用進(jìn)行了初步研究，獲得一些有意義結(jié)果,其中部分結(jié)果已發(fā)表論文(SCI收錄,詳見申請人介紹)：試驗(yàn)結(jié)果1.PMA刺激前后THP-1細(xì)胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化未刺激時(shí)，THP-1細(xì)胞呈圓形、懸浮生長。PMA刺激24h后，細(xì)胞呈貼壁生長，部分細(xì)胞出現(xiàn)偽足，呈扁型蟲樣；48h后出現(xiàn)梭型轉(zhuǎn)變，并隨著時(shí)間的推移，變形細(xì)胞的比例逐漸增高，72h后細(xì)胞全部變?yōu)橘N壁細(xì)胞(圖6)。2.CaSR在THP-1細(xì)胞中的表達(dá)Westernblot結(jié)果顯示，在THP-1細(xì)胞中，PMA誘導(dǎo)前后均有CaSR蛋白的表達(dá)，表現(xiàn)在110、130kD左右出現(xiàn)2條特異性條帶，分別為成熟型和成熟前體CaSR。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，CaSR蛋白出現(xiàn)在PMA誘導(dǎo)72h后的THP-1細(xì)胞的胞漿和胞膜(圖7)。第24頁國家自然科學(xué)基金申請書2011版圖6倒置相差顯微鏡觀察THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)前后的形態(tài)學(xué)變化（×200）圖7Westernblotting及免疫熒光分析THP-1細(xì)胞CaSR蛋白質(zhì)的表達(dá)（3）激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)測定THP-1細(xì)胞內(nèi)游離鈣的變化用鈉鈣交換體抑制劑NiCl2（100μmol/L），L型鈣通道抑制劑CdCl2（20μmol/L）作用于THP-1細(xì)胞后，提高[Ca2+]o，[Ca2+]i升高。應(yīng)用CaSR抑制劑NPS2390，磷脂酶C（PLC）途徑抑制劑U73122（10μmol/L），或細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵抑制劑TG（thapsigargin，10μmol/L）處理后，提高[Ca2+]o，[Ca2+]i未見升高(圖8A)。用CaSR特異激動劑氯化釓（GdCl3，1mmol/L）作用THP-1后，獲得相同結(jié)果((圖8B)。第25頁國家自然科學(xué)基金申請書2011版圖8Ca2+與Gd3+對細(xì)胞內(nèi)鈣的影響（4）ELISA法檢測細(xì)胞因子IL-1TNF-的分泌情況用脂多糖（1mg/L）作用PMA處理72h后的THP-1細(xì)胞24h后，ELISA法檢測結(jié)果顯示THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、TNFα的含量均明顯高于未處理組；GdCl3處理24h組，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、TNFα的含量亦明顯升高，但該作用可被CaSR特異抑制劑NPS2390（10μmol/L）所抑制(圖9)。這些研究成果，為本項(xiàng)目的順利實(shí)施創(chuàng)造了條件，打下了基礎(chǔ)。圖9CaSR活化對細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的分泌情況的影響（二）工作條件第26頁國家自然科學(xué)基金申請書2011版項(xiàng)目申請人所在的哈醫(yī)大病理生理教研室，是省部共建實(shí)驗(yàn)室，曾承擔(dān)國家七五、八五攻關(guān)課題及十多項(xiàng)國家自然科學(xué)基金課題，發(fā)表論文二百余篇，獲衛(wèi)生部和黑龍江省科技進(jìn)步獎10余次?？蒲蟹较?yàn)樾难芗膊∠嚓P(guān)研究，近年來一直致力于探討CaSR與心血管疾病的關(guān)系。并擁有本課題所需實(shí)驗(yàn)設(shè)備，而且已建立完善的細(xì)胞培養(yǎng)、表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染、激光共聚焦測定[Ca2+]i、免疫熒光、westernblot等實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺。學(xué)校圖書館可做查新檢索，并能全文查閱到國外最新期刊。研究所采用各項(xiàng)技術(shù)，課題組成員均熟悉和掌握。本申請者的基金將主要用于購買本研究所需要的各種試劑和消耗性實(shí)驗(yàn)用品。本試驗(yàn)中所需儀器均具備。其中主要設(shè)備有：1.細(xì)胞培養(yǎng)：BECKMAN低溫高速離心機(jī)，SANYOCO2培養(yǎng)箱（2），SANYO超低溫冰箱，olympus倒置顯微鏡，生物安全柜以及超凈臺。2.分子生物學(xué)：BECKMAN低溫超速離心機(jī)和大容量低溫高速離心機(jī)，Bio-Rad垂直電泳系統(tǒng)和電轉(zhuǎn)裝置（3），Bio-Tek酶標(biāo)儀，BECKMAN紫外/可見光分光光度計(jì)，EppendorfPCR儀，Bio-RadPCR儀，Bio-Rad電轉(zhuǎn)系統(tǒng)，Millipore純水系統(tǒng)3.OLYMPUS倒置熒光相差顯微鏡及相應(yīng)圖像采集分析系統(tǒng)4.OLYMPUS激光共聚焦掃描顯微鏡及相應(yīng)圖像掃描分析處理系統(tǒng)。5.Water’s高效液相色譜儀（三）申請人簡介席玉慧，項(xiàng)目負(fù)責(zé)人，1976年12生。哈爾濱醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，副教授。2010博士畢業(yè)。已發(fā)表多篇論文，承擔(dān)并參與多項(xiàng)課題的研究。熟練掌握本課題相關(guān)的各種試驗(yàn)技術(shù)，如細(xì)胞培養(yǎng)，載體構(gòu)建，細(xì)胞轉(zhuǎn)染，RT-PCR，WesternBlot，原位雜交，免疫熒光，膜片鉗，流式細(xì)胞，ELISA以及激光共聚焦等技術(shù)。近年在國內(nèi)外期刊發(fā)表的主要論著：1.Yu-huiXi,Hong-zhuLi,Wei-huaZhang,Li-naWang,LiZhang,YanLin,Shu-zhiBai,Hong-xiaLi,Ling-yunWu,RuiWang,Chang-qingXu.TheFunctionalExpressionof第27頁國家自然科學(xué)基金申請書2011版Calcium-sensingReceptorintheDifferentiatedTHP-1Cells.MolecularandCellularBiochemistry.2010;342(1-2):233-240.（SCI收錄）2.WangLN,WangC,LinY,XiYH,ZhangWH,ZhaoYJ,LiHZ,TianY,LvYJ,YangBF,XuCQ.Involvementofcalcium