第第頁一種簡便快速提取細菌質粒的方法改進【關鍵詞】質粒；提??；細菌

［摘要］介紹一種簡便快速提取細菌質粒的改進方法，不需要按常規(guī)對細菌培養(yǎng)物離心和用溶液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ處理，而是直接用酚-氯仿(1∶1)處理，離心分層取上清，異丙醇沉淀，所得質粒產量高，純度足以用于酶切。

［關鍵詞］質粒；提??；細菌

ASimpleandRapidMethodtoIsolatePlasmid

Abstract:Asimpleandrapidmethodtoisolateplasmidfrombacteriaisintroduced．BacteriaculturewastreatedbyPhenol-CHCl3(1∶1)，upperaqueousphasewaswithdrawnandplasmidDNAwasprecipitatedbyisopropanol．TheroutinestepssuchascollectingbacteriabycentrifugationandtreatingwithSolutionⅠ，ⅡandⅢwerethusavoided．Theplasmidobtainedwaspureenoughforenzymedigestion．

Keywords：Plasmid；Isolation；Bacilus

提取質?？梢哉f是分子生物學和基因工程研究中最基本常用的方法，在實踐中大多采用堿變性法來提取質粒，該方法需要先離心收集細菌，而后用溶液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ依次處理［1］。在篩選陽性重組克隆時往往需要對大量菌落進行培養(yǎng)后提取質粒進行酶切鑒定，用該方法還是比較費時費力的。目前已經有不少進口及國產的質?？焖偬崛≡噭┖袉柺?，但是它們的基本原理還是堿變性［2］，仍然需要對細菌離心，而后用變性液、中和液處理等。為此，我們經過探索，找到一種提取質粒的改進方法，即簡便快速，而且所得質粒產量純度都很好。原理很簡單：酚-氯仿是變性劑，可以破壞細菌的細胞壁，質粒DNA就釋放出來，而染色體DNA較大，與菌體一起分到下層，取出上層水相(質粒DNA在其中)，用異丙醇沉淀，離心使質粒DNA沉降下來，再用TE或H2O溶解質粒DNA沉淀，質粒即可用于酶切等分子生物學實驗?，F(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1．1試劑質粒載體PHB3，帶有人帶3蛋白cDNA，氨芐青霉素抗性，6．5Kb，酶切片段396bp，由復旦大學生命科學院院長張志鴻教授提供；菌株DH5a由本室凍存；1Kb和10KbMarker，BamHI,EcoRI和RNaseA購自Promega公司；質粒小量抽提試劑盒(上海博光生物科技有限公司)；蛋白胨和酵母提取物(Oxoid公司)；瓊脂糖購自Sigma公司。

1．2常規(guī)方法試劑的配制和使用參照文獻［3］；細胞培養(yǎng)參照文獻［4］，常規(guī)37℃，飽和濕度和5％CO2。所有培養(yǎng)用器具和細菌培養(yǎng)基均經121℃，15磅高壓濕性滅菌20min。質粒轉化采用TSS法制備和轉化感受態(tài)細菌［5］。

1．3質粒提取分別接種含質粒PHB3的DH5a的細菌于2mlLB培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜。取出700μl細菌培養(yǎng)到一個1．5mlEp管中，再加入700μlTris飽和酚-氯仿(體積比1∶1)，混均后12000r離心3min，小心取出上層液相(約600μl)到一新Ep管中，加入等體積異丙醇，混均后12000r離心5min，去上清，用1ml70%乙醇洗滌沉淀，真空或自然干燥后溶于50μl含RNaseA(20μl／ml)的TE中。分光光度計測定質粒DNA的濃度和純度。

1．4酶切鑒定用20μl反應體系，分別取5μl如上所提取的質粒PHB3，BamHI和EcoRI各1．0U及2μl相應10×buffer，剩余體積用ddH2O補齊，37℃水浴1．5h后行1％瓊脂糖凝膠電泳。

2結果和討論

采用以上方法從0．7ml細菌培養(yǎng)物得到4．5μg的PHB3，OD260：OD280為1．8，說明所提取的質粒濃度和純度都較好。圖1為質粒抽提電泳，在6kp處條帶清晰可見；圖2為質粒PHB3酶切產物電泳，在400bp處條帶清晰可見。

圖1質粒PHB3質粒抽體電泳（略）

圖2質粒PHB3酶切產物電泳（略）

我們建立的這種簡便快速提取細菌質粒的改進方法給分子生物學研究提供很好的技術手段，比如我們要克隆一個基因到一個質粒載體上，可以用此方法提取載體，酶切后電泳回收純化，與目的基因連接，轉化，再用此方法提取重組質粒進行酶切鑒定，篩選出陽性克隆。與常規(guī)的堿變性法比較，本方法更快，15min～20min就可完成，全過程室溫操作即可，不需冰浴，而且省去配制溶液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ等步驟，實際操作簡便易行。

參考文獻：

［1］談代明．現(xiàn)代醫(yī)學分子生物學［M］．北京：人民軍醫(yī)出版社，2000：391394．

［2］SambrokJ，F(xiàn)ritschEF，ManiatisT．MolcularCloning［M］．2nded．NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress．1989：125128．

［3］薩姆布魯克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯，等．金冬雁，黎孟楓等譯．分子克隆實驗指南［