圖解RCR的反應(yīng)原理類型應(yīng)用范例第1頁/共41頁P(yáng)CR技術(shù)及其應(yīng)用生物化學(xué)實驗技術(shù)第2頁/共41頁目錄PCR的反應(yīng)原理PCR的類型和應(yīng)用PCR示例第3頁/共41頁

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR：PolymeraseChainReaction)

KaryB.Mullis

PCR是由美國科學(xué)家穆利斯提出的一種體外簡化條件下模擬DNA體內(nèi)復(fù)制的DNA快速擴(kuò)增的方法，此技術(shù)獲得1993年諾貝爾化學(xué)獎。第4頁/共41頁體內(nèi)DNA的復(fù)制體系DNA聚合酶（IIIIII）拓?fù)洚悩?gòu)酶解旋酶類SSB

引物dNTPMg2+5’3’第5頁/共41頁Mullis的PCR構(gòu)思引物引物DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段第6頁/共41頁Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)40506070809010010080604020耐熱DNA聚合酶Saiki（1988）將耐熱DNA聚合酶引入PCR，使利用熱變性解鏈DNA模板可行。第7頁/共41頁P(yáng)CR反應(yīng)循環(huán)72℃94℃55℃PCR循環(huán)變性退火延伸第8頁/共41頁P(yáng)CR的指數(shù)擴(kuò)增（2n）引物延伸延伸5’5’3’3’變性、退火變性、退火變性、退火延伸第9頁/共41頁TaqP1P2PCR反應(yīng)體系dATPdTTPdGTPdCTPMg2+模板：DNA引物：P1+P2DNA聚合酶：TaqE原料：dNTP反應(yīng)緩沖液10xBuffer輔助因子：Mg2+第10頁/共41頁1）PCR反應(yīng)成分（1）模板單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。

DNA模板一般100ng/100L。模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。

PCR反應(yīng)條件第11頁/共41頁（2）引物濃度

0.1-0.5mol/L

濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯配,反應(yīng)特異性下降。（3）Taq

DNA聚合酶

0.5-2.5U/50l

酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。第12頁/共41頁（4）dNTP（10mMor2.5mM）含四種核苷酸dATP、dGTP、dCTP、dTTP

dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長度濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入,濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量

dNTP可與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。第13頁/共41頁（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。濃度為0.5-2.5mmol/L。

Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。

Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合,所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。第14頁/共41頁2）循環(huán)參數(shù)變性

使雙鏈DNA解鏈為單鏈

94℃，30-60秒(2)退火

溫度由引物長度和GC含量決定。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。第15頁/共41頁引物設(shè)計：（1)序列應(yīng)位于高度保守區(qū),與非擴(kuò)增區(qū)無同源序列。（2）引物長度以15-40bp為宜。（3）堿基盡可能隨機(jī)分布,G+C占40-60%。（4）引物內(nèi)部避免形成二級結(jié)構(gòu)。（5）兩引物間避免有互補(bǔ)序列。（6）引物3’端為關(guān)鍵堿基；5’端無嚴(yán)格限制。第16頁/共41頁（3）延伸

70-75℃,一般為72℃

延伸時間由擴(kuò)增片段長度決定（4）循環(huán)次數(shù)

主要取決于模版DNA的濃度一般為25-35次次數(shù)過多：擴(kuò)增效率降低錯誤摻入率增加第17頁/共41頁P(yáng)CR的應(yīng)用

1、特定DNA片段（基因、調(diào)控序列）的鑒定、分離或制備。

A、DNAB、cDNA2、基因表達(dá)分析（原位、離體）

A、基因是否表達(dá)

B、基因表達(dá)水平高低

3、基因突變第18頁/共41頁基因克隆（ＲＴ－ＰＣＲ）逆轉(zhuǎn)錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜交雙鏈PCR擴(kuò)增第19頁/共41頁1.細(xì)胞或組織固定：細(xì)胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理后便適于一般PCR試劑（包括引物和Taq酶）進(jìn)入2.PCR擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)目的片段3.原位雜交檢測擴(kuò)增產(chǎn)物A.陽性對照B.陰性對照C.原位檢測mRNA表達(dá)原位ＰＣＲ分析基因表達(dá)的組織特異性第20頁/共41頁熒光定量PCR（real-timePCR)分析基因表達(dá)水平

通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針,對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤,實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程,結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對結(jié)果進(jìn)行分析,計算待測樣品的初始模板量。內(nèi)摻式染料 SYBRGreenI序列特異性探針 Taqman MolecularBeacons DualProbes(FRET)引物特異性探針

Amplifluor(Intergen)第21頁/共41頁5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenI

第22頁/共41頁反向PCR(reversePCR)擴(kuò)增已知序列兩側(cè)的未知序列

用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段，對某個已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。

未知序列未知序列已知序列第23頁/共41頁已知序列未知序列未知序列限制酶連接酶第24頁/共41頁

實時熒光定量PCR儀梯度PCR儀普通PCR儀第25頁/共41頁第26頁/共41頁1、材料：含0.3Kb插入片段的克隆載體2、儀器：微量移液器及吸頭、PCR儀及PCR管瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備3、試劑：10XPCR 反應(yīng)緩沖液

25mmol/LMgCl2

10mmol/LdNTP10μmol/L引物1和引物2二、實驗材料、儀器和試劑第27頁/共41頁1.反應(yīng)體系（50μl體系）：

10XPCR反應(yīng)緩沖液

25mmol/LMgCl2

10mmol/LdNTP10μmol/L引物110μmol/L引物2

模板DNATaqE

補(bǔ)充水三、操作步驟10XB10XP1P210XT10XE

第28頁/共41頁2.按照如下體積向PCR管中按順序加入各試劑并混勻：

三、操作步驟10XBuffer2.5μL10XP12.5μL10XT2.5μL10XE2.5μL25μL水12.5μL10XP22.5μL第29頁/共41頁3.PCR擴(kuò)增程序：

94℃5-10min（預(yù)變性）

94℃30S55℃30S72℃30S72℃5-10min（后延伸）

4℃

保溫30Cycles第30頁/共41頁屏幕顯示方式第31頁/共41頁Main

RunEnterListEditFileLid運(yùn)行已有程序已有程序菜單刪除已有程序新建反應(yīng)程序編輯已有程序熱蓋關(guān)閉調(diào)節(jié)第32頁/共41頁EnterEnter

abcdefghi#

jklmnopqr#

Name#stuvwxyz#

InUse!.,-+/():=#

Enter

PCR1

ControlMethod

BLOCKSim-Tube

輸入文件名,滿8個字符自動生成程序名,不滿8個字符時用#終止BLOCK:屏幕顯示樣品臺溫度(樣品臺溫控方式)Sim-Tube:屏幕顯示反應(yīng)液溫度(模擬管溫控方式)Enter

PCR1

Segment#1

HoldCycleEND

選擇預(yù)變性保溫第33頁/共41頁循環(huán)內(nèi)第一步溫度和時間Enter

PCR1

Holdat94C

Holdfor5m0s預(yù)變性溫度和時間Enter

PCR1

Segment#2

HoldCycleEND

3stepPCR循環(huán)參數(shù)設(shè)置Step#1

94.0CHold0m30s循環(huán)內(nèi)步驟數(shù)第34頁/共41頁Step#1

Option？

Noyes不需要拓展功能Step#2

55.0CHold0m40s循環(huán)內(nèi)第二步溫度和時間Step#2

Option？

Noyes不需要拓展功能Step#3

72.0CHold0m30s循環(huán)內(nèi)第三步溫度和時間第35頁/共41頁不需要拓展功能設(shè)置循環(huán)數(shù)后延伸保溫后延伸溫度和時間Step#3

Option？

NoyesTotalCycle=35Segment#3

HoldCycleENDHoldat72.0C

Holdfor10m0s第36頁/共41頁Segment#4

HoldCycleEND選擇反應(yīng)完后保溫Holdat4.0C

Holdfor99m0s設(shè)置反應(yīng)完后的保溫溫度和時間Segment#5

HoldCycleEND終止參數(shù)設(shè)置EnterPCR1

EstimatedRunTime：

1h53m05s

Save？YESno預(yù)計反應(yīng)時間，程序是否保存第37頁/共41頁LidLID

Turnoffheated

Lidbelow9C當(dāng)溫度低于9度時，熱蓋自動關(guān)閉第38頁/共41頁RunPC