生物儀器分析一、生物儀器分析的發(fā)展歷程二、儀器分析的基礎(chǔ)知識三、儀器分析的標(biāo)準(zhǔn)方法及其驗證四、生物樣品的預(yù)制備第一章緒論

一、生物儀器分析的發(fā)展歷程1.1儀器分析的作用

獲取有關(guān)物質(zhì)系統(tǒng)的化學(xué)成分與化學(xué)結(jié)構(gòu)等方面定性、定量的相關(guān)信息。1.2儀器分析的發(fā)展歷史上出現(xiàn)過三次巨大變革：

1、19世紀(jì)末→20世紀(jì)初葉：由“技藝”上升到科學(xué)理論。

標(biāo)志工具是：天平的使用。

2、20世紀(jì)四十年代→20世紀(jì)八十年代：由“分析技術(shù)科學(xué)”上升到“化學(xué)信息科學(xué)”。

標(biāo)志工具是：大量電子分析儀器、儀表的使用。3、20世紀(jì)八十年代→21世紀(jì)初：由“化學(xué)信息科學(xué)”上升到“系統(tǒng)信息科學(xué)”。

標(biāo)志工具是：微型計算機控制的現(xiàn)代智能型分析儀器的大量使用。

現(xiàn)代生物儀器分析是一個嶄新而年輕的領(lǐng)域，它是與生物學(xué)、電子學(xué)、計算機科學(xué)、現(xiàn)代信息技術(shù)科學(xué)交叉發(fā)展的而產(chǎn)生的新領(lǐng)域。1.3現(xiàn)代生物科學(xué)儀器的發(fā)展趨勢

1、大型綜合性儀器與小型專一性儀器并行發(fā)展激光掃描共聚焦顯微鏡流式細(xì)胞儀大型綜合性儀器如激光掃描共聚焦顯微鏡用來觀察生物大分子的外部形態(tài)結(jié)構(gòu)，流式細(xì)胞儀用來進(jìn)行活細(xì)胞內(nèi)成分的分析；

小型專一性儀器利用生物反應(yīng)器原理發(fā)展各種快速測定的便攜式儀器設(shè)備將是今后研究和技術(shù)開發(fā)的一個熱點。如北京天躍環(huán)?？萍加邢薰旧a(chǎn)、銷售各種的便攜式分析儀器。2、各領(lǐng)域技術(shù)交叉明顯，共同構(gòu)筑高新技術(shù)平臺3、計算機技術(shù)與自動化、智能化工作站出現(xiàn)4、聯(lián)用技術(shù)具有獨特優(yōu)勢5、資源共享與網(wǎng)絡(luò)化

2.1儀器分析的定義

它以物質(zhì)的某些物理或物理化學(xué)性質(zhì)（光、電、熱、磁等）為基礎(chǔ)，并借助于特殊的儀器，對待測物質(zhì)進(jìn)行定性、定量及結(jié)構(gòu)分析和動態(tài)分析的一類方法。因此，儀器分析方法一般都有獨立的方法原理及理論基礎(chǔ)。二、儀器分析的基礎(chǔ)知識

方法分類主要分析方法被測物理性質(zhì)

光譜分析

發(fā)射光譜分析、火焰光度分析

光的發(fā)射分子發(fā)光分析法、放射分析法紫外-可見分光光度法光的吸收原子吸收分光光度法紅外光譜法、核磁共振波譜法比濁法、拉曼光譜法光的散射折射法、干涉法光的折射

X-射線衍射法、電子衍射法光的衍射圓二色譜法光偏振方向的旋轉(zhuǎn)

電化學(xué)分析

電位法電極電位

電導(dǎo)法電導(dǎo)

極譜法、溶出伏安法電流-電壓色譜分析

氣相色譜法、液相色譜法薄層色譜法

兩相間的分配熱分析

熱導(dǎo)法、差熱分析法熱性質(zhì)質(zhì)量分析質(zhì)譜法

質(zhì)荷比2.2儀器分析方法分類根據(jù)待測量的物理性質(zhì)，儀器分析方法主要分為以下幾類:質(zhì)譜儀氣相色譜儀(島津)液相色譜儀（HP-1100）X射線光電子能譜儀X射線熒光儀UV-vis光譜儀電化學(xué)分析儀熒光光譜儀(日立F-4500)四圓X射線衍射儀2.3分析儀器的基本組成信號發(fā)生器信號檢測器信號處理器取決于所用儀器的原理具有一定的通用性輸出裝置指針表記錄儀顯示器過程控制記錄儀1.信號發(fā)生器

凡能產(chǎn)生測試信號的源叫作信號發(fā)生器。這些測試信號與待測樣品的結(jié)構(gòu)與組分有關(guān)。信號發(fā)生器種類很多，按其性能可劃分為標(biāo)準(zhǔn)信號發(fā)生器、簡易信號發(fā)生器、正弦波信號發(fā)生器、脈沖信號發(fā)生器、電視信號發(fā)生器、函數(shù)信號發(fā)生器、噪聲信號發(fā)生器等。信號發(fā)生器按頻段可劃分為超低頻、低頻、視頻、高頻、甚高頻、超高頻和微波信號發(fā)生器。

標(biāo)準(zhǔn)信號發(fā)生器的基本功能是提供標(biāo)準(zhǔn)正弦載波信號和調(diào)制波信號。

信號發(fā)生器由參考振蕩器、頻率合成單元、調(diào)制單元、電平控制單元等組成。對于光信號發(fā)生器它的參考振蕩器由穩(wěn)定化光源組成。2、信號檢測器對儀器產(chǎn)生的信號進(jìn)行檢測的裝置。光電倍增管：用來進(jìn)行光電效應(yīng)檢測熱電偶：用來進(jìn)行溫度測量電極：用來進(jìn)行電位變化的測量3、信號處理器

對檢測器獲得的信號進(jìn)行各種處理后，輸出分析者所需要的信號的一種裝置。其中最普通的信號處理器就是信號放大裝置。如：各種電流信號放大器；電壓信號放大器；衰減器；積分器；求導(dǎo)器微電流放大器（5×10-14A）

2.4儀器分析的特點1、靈敏度極高，適于微量、超痕量組分的測定；2、選擇性好，適于復(fù)雜組分試樣的分析；3、分析迅速，適于批量樣品的分析；4、組合能力和適應(yīng)性強，能進(jìn)行在線分析；5、具有數(shù)據(jù)采集和處理的功能，易于自動化和智能化；6、能進(jìn)行無損分析；2.5儀器分析的一般過程選擇分析方法樣品的采集及預(yù)處理共存組分分離樣品的信號產(chǎn)生信號檢測及信號加工處理結(jié)果或數(shù)據(jù)顯示數(shù)據(jù)處理分析報告3.1標(biāo)準(zhǔn)分析方法標(biāo)準(zhǔn)分析方法又稱分析方法標(biāo)準(zhǔn)，是技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)中的一種，它是一項文件，是權(quán)威機構(gòu)對某項分析所作的統(tǒng)一規(guī)定的技術(shù)準(zhǔn)則和各方面共同遵守的技術(shù)依據(jù)，它必須滿足以下條件：（1）按照規(guī)定的程序編制。（2）按照規(guī)定的格式編寫。（3）方法的成熟性得到公認(rèn)，通過協(xié)作試驗，確定了方法的誤差范圍。（4）由權(quán)威機構(gòu)審批和發(fā)布。三、儀器分析的標(biāo)準(zhǔn)方法及其驗證

我國標(biāo)準(zhǔn)化工作的組織管理架構(gòu)圖3.2標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證3.2.1目的證明所采用的分析方法適合于相應(yīng)的檢測要求。3.2.2需驗證的分析項目1.鑒別試驗；

2.雜質(zhì)定量或限度檢查；

3.原料或制劑中有效成分含量測定；

4.制劑中其它成分（如防腐劑等）的測定；3.2.3驗證內(nèi)容準(zhǔn)確度精密度（包括重復(fù)性和重現(xiàn)性）選擇性和專屬性檢測限、定量限和靈敏度線性、范圍耐用性1、準(zhǔn)確度（accuracy）它是指用某方法測定的結(jié)果與真實值或參考值接近的程度。

待測物含量測定方法的準(zhǔn)確度評價：用已知純度的對照品與待測樣品的測定結(jié)果進(jìn)行比較；(或者用本法所得結(jié)果與已建立準(zhǔn)確度的測定方法所得結(jié)果進(jìn)行比較)

雜質(zhì)含量測定的準(zhǔn)確度：向樣品中加入已知量的雜質(zhì)后再進(jìn)行測定。數(shù)據(jù)要求：在規(guī)定的范圍內(nèi)，至少要用9次測定的結(jié)果進(jìn)行評價，如制備3個不同濃度的樣品，各測定3次。2、精密度（precision）

精密度是指在規(guī)定條件下，同一個均勻樣品，經(jīng)多次取樣測定所得結(jié)果之間的接近程度。

一般用偏差（d）、標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示。

標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD或S）偏差（d）：測量值與平均值之差

重復(fù)性(repeatability):在相同條件下，由同一個分析人員測定所得結(jié)果的精密度；如把被測物濃度當(dāng)作100%，至少測5次進(jìn)行評價。

重現(xiàn)性(reproducibility)：不同實驗室，不同分析人員測定結(jié)果的精密度。

數(shù)據(jù)要求：通常要求用于計算標(biāo)準(zhǔn)偏差的樣品測量次數(shù)n5。3、選擇性和專屬性選擇性（selectivity）：樣品中有其它物質(zhì)存在下精密測定待測物的能力。用選擇性系數(shù)來評價方法或儀器的選擇性。選擇性系數(shù)為在相同條件下測得的待測物當(dāng)量濃度與共存物當(dāng)量濃度之比。

專屬性（specificity）：在其它成分可能存在下，所采用的方法能準(zhǔn)確測定出被測物的特性。它們都利用在測量樣品中加入雜質(zhì)和不加雜質(zhì)時所測得的結(jié)果的區(qū)別來評價。

檢測限（detectionlimit）：試樣中的被測物在確定的實驗條件下能被檢測出的最低濃度或含量。它分為儀器檢測限，方法檢測限和樣品檢測限三類。4、檢測限、定量限和靈敏度

信噪比法：是把已知低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進(jìn)行比較，算出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。一般以信噪比（S/N）3∶1或2∶1時的相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定檢測限。

儀器檢測限：相對于背景，儀器能檢測到的最少可靠信號，通常采用信噪比法。（1）空白值＝0時；①測定背景10次以上，求出標(biāo)準(zhǔn)偏差σb。②將σb乘以三倍；③在工作曲線上求出3σb相對應(yīng)的濃度Xb；即為樣品的檢測限。

（2）空白值不等于0；①測定背景10次以上，求出標(biāo)準(zhǔn)偏差σb

；②將σb

乘以三倍；③將3σb加上空白時對應(yīng)的檢測值；④在工作曲線上求出③所對應(yīng)的濃度Xb

；即為樣品的檢測限。樣品檢測限:相對于空白可檢測的最小樣本含量；通常采用3倍空白標(biāo)準(zhǔn)偏差的方法來求出。方法檢測限：某方法可檢測的最小濃度。通常采用外推法來求得。具體做法：在低濃度范圍內(nèi)測試3個濃度；每個濃度水平測試多次（n>5)，計算出標(biāo)準(zhǔn)偏差；用線性回歸法繪制標(biāo)準(zhǔn)偏差-濃度回歸線；回歸線延長外推至和縱坐標(biāo)的交點。

定量限（quantitation1imit）

樣品中的被測物能被定量測定的最低量，結(jié)果應(yīng)具有一定準(zhǔn)確度和精密度要求。按1984年國際純粹和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(IVPAC)規(guī)定：用儀器所測空白背景響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）的10倍為估計值，再用試驗來確定定量限。

靈敏度(sensitivity):分析信號隨組分含量變化而變化的程度，它與檢測器的放大倍數(shù)直接相關(guān)。靈敏度S實際上就是標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，S值越大，方法的靈敏度越高。

線性（Linearity）：在設(shè)計的范圍內(nèi)，測試結(jié)果與試樣中被測物濃度呈正比關(guān)系的能力。它通常用最小二乘法處理數(shù)據(jù)求得工作曲線的相關(guān)系數(shù)，用相關(guān)系數(shù)的平方來表示。

范圍（Range）：一個定量分析方法的適用范圍。5、線性和范圍數(shù)據(jù)要求：至少需要五個濃度考察線形，需提供相關(guān)系數(shù)、列出回歸方程和線性圖。

耐用性：指測定條件稍有變動時，結(jié)果不受影響的承受程度。它是衡量實驗室和工作人員之間在正常情況下實驗結(jié)果重現(xiàn)性的尺度。分析方法耐用性的測定是通過在不同的實驗室內(nèi)不同的實驗者對同一樣品的分別測試結(jié)果與正常條件下的結(jié)果進(jìn)行比較，來確定該法的耐用性，或稱粗放度。6、耐用性2、用離子選擇性電極測定濃度為1.010-4mol/L某一價離子i，某二價的干擾離子j的濃度為4.010-4mol/L，則測定的相對誤差為多少(已知Kij

=10-3)？3、某鈉電極，其選擇性系數(shù)KNa+,H+約為30。如用此電極測定PNa等于3的鈉離子溶液，并要求測定誤差小于3%,則試液的pH值應(yīng)大于多少。1、離子選擇性電極的選擇系數(shù)可用于（）。A.估計共存離子的干擾程度；B.估計電極的檢測限；C.估計電極的線性響應(yīng)范圍；D.估計電極的線性響應(yīng)范圍；例題與習(xí)題四、生物樣品的預(yù)制備4.1生物樣品的來源：動物、植物或微生物培養(yǎng)物。4.2目的：將原始樣品預(yù)先適當(dāng)處理成適合分析的狀態(tài)。4.3生物樣品預(yù)制備的一般過程：材料選擇→預(yù)處理（潔凈、切片、風(fēng)干）→破碎→提取純化→濃縮→結(jié)晶→干燥→貯藏4.3.1生物樣品的破碎1.玻璃勻漿器它適用于培養(yǎng)細(xì)胞和軟組織的勻漿；松形錐用來上下抽擠樣品；緊形錐用來勻漿。適合于各種動物、植物細(xì)胞、細(xì)菌和組織的破碎；原理：利用超聲波在液體中產(chǎn)生的空化效應(yīng)；空化效應(yīng)（cavitationeffect）在超聲波的作用下引起介質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)氣體分子、氣泡的振動以及氣泡隨后發(fā)生破裂形成空隙或空囊的作用；2.超聲波細(xì)胞破碎機

它利用高壓產(chǎn)生的擠壓作用使細(xì)胞等材料破碎，適用于厚壁細(xì)胞、細(xì)菌和較濃樣品的破碎，具有快速、方便和無噪聲等特點。處理容量為1-50m1/次，有的可達(dá)20-150m1/次，且可連續(xù)進(jìn)樣，最大破碎壓力為300MPa，使用電壓380V。3、高壓細(xì)胞破碎機4、高速組織搗碎機組織搗碎機適用于較堅硬組織(如肌肉、心肌或果實等植物組織)的勻漿。原理：利用電機的高速旋轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)速可達(dá)20000r/min)驅(qū)動轉(zhuǎn)刀同時進(jìn)行劈裂、碾碎、攪拌等過程。注意：有機溶劑如丙酮不能直接放入塑料容器內(nèi)。4.3.2生物樣品的分離提取1、索氏抽提裝置

這是一種典型的固體提取裝置；它由索氏抽提器、冷凝器和收集瓶三部分組成。使用時將冷凝器與自來水管連接起來；粉末狀樣品裝進(jìn)濾紙筒后放在抽提器內(nèi)；預(yù)裝在收集瓶內(nèi)的有機溶劑在水浴鍋內(nèi)受到加熱后，經(jīng)蒸汽通道上升至冷凝器內(nèi)受到冷卻，冷凝成液滴，直接滴落在樣品上；有機溶劑在抽提器內(nèi)積累的過程中與樣品充分接觸，將可溶性的目的成分抽提出來。當(dāng)溶劑體積達(dá)到虹吸管口部高度后，將發(fā)生虹吸作用，攜帶抽提物一起回流到收集瓶內(nèi)。2、快速溶劑萃取儀美國ASE300快速溶劑萃取儀萃取原理

它是將準(zhǔn)備好的樣品裝入不銹鋼萃取池，擰緊池蓋并放人圓盤式傳送裝置，后者將萃取池送入加熱爐腔中；萃取池在爐腔內(nèi)一定的壓力下自動密封，然后向萃取池中開始注入溶劑，加熱加壓，達(dá)到設(shè)定的溫度后，萃取池在爐腔中開始按設(shè)定的時間、溫度和壓力工作，使分析物及溶劑自動經(jīng)過濾，進(jìn)入收集瓶完成萃取。下一個樣品開始被萃取前，萃取池中被注入新鮮的溶劑并用氮氣吹掃，完成后萃取池返回圓盤傳送裝置。萃取工作原理圖3、固相萃取

固相萃取(extraction)用于樣品分析前的凈化或富集。固相萃取比傳統(tǒng)的液一液萃取更加節(jié)省溶劑和時間，能滿足各種色譜、光譜、質(zhì)譜和核磁共振等分析樣品的制備要求。固相萃取柱的結(jié)構(gòu)

萃取柱由柱管、篩板和固定相三個部分組成。注射器狀的柱管由聚乙烯制成。篩板除支撐固定相外，還起過濾作用。固定相是固相萃取柱中的關(guān)鍵部分，最常見的固定相是鍵合的硅膠材料，硅膠微粒為原材料，然后將各種官能團(tuán)鍵合上去。也有一些非硅膠基質(zhì)的固定相被廣泛應(yīng)用。固定相和洗脫溶劑的選擇應(yīng)根據(jù)待測組分的極性特點而定。固相萃取柱的組成

固相萃取包括四個基本步驟：固定相活化、樣品上柱、淋洗、待測組分洗脫。

(1)液態(tài)或溶解后的固態(tài)樣品倒入活化過的固體萃取柱，(2)然后利用抽真空、加壓或離心方式使樣品進(jìn)入固定相。(3)用一種溶劑淋洗掉弱保留的樣品組分，(4)再用另一種溶劑把目的組分從固定相上洗脫下來。固相萃取的萃取過程4、旋轉(zhuǎn)濃縮儀（rotaryevaporator）Ecospin3180C

真空旋轉(zhuǎn)濃縮儀上海申生的R205B型旋轉(zhuǎn)濃縮儀Lahorota4003旋轉(zhuǎn)濃縮儀濃縮瓶收集瓶電機

為了使液態(tài)樣品受熱均勻，常使用電機使樣品在濃縮瓶內(nèi)旋轉(zhuǎn)，同時為了可連續(xù)地處理大體積的抽提樣品，往往利用負(fù)壓將樣品自動吸入濃縮瓶內(nèi);并附加手動或電動裝置可方便地調(diào)整濃縮瓶在加熱浴槽中的位置。在較低沸點下蒸發(fā)出來的溶劑經(jīng)流水冷凝而收集在收集瓶中可供回收。它特別適用于欲分離的組分不耐較高溫度的熱敏性或高乳度樣品的濃縮。例如色素抽提液、糖類的乙醇抽提液的濃縮等。旋轉(zhuǎn)濃縮儀的組成與工作原理5、離心機(centrifuge)能產(chǎn)生強大離心力的機械裝置就是離心機。利用強大的離心力將物理性質(zhì)(如質(zhì)量、浮力、沉降系數(shù)等)不同的懸浮液微粒進(jìn)行分離、濃縮的技術(shù)稱為離心技術(shù)。離心技術(shù)特別適用于溶液量較小或沉淀乳稠的生物樣品的分離。離心機分類：通常根據(jù)用途將離心機分為制備性離心機和分析性離心機兩類。也可根據(jù)離心機的轉(zhuǎn)速分為低速(<6OOOr/min)、高速(6000-25OOOr/min)和超高速(>30OO0r/min)離心機。從外形上有桌上型臺式、立式、臥式離心機等。超高速離心機已成為分離、提純、鑒別和分析生物大分子的不可或缺的技術(shù)裝備之一。

其中LE-80K立式離心機最高轉(zhuǎn)速90OOOr/min,最大離心力694kg。溫度設(shè)定范圍0-40oC，每次離心容量13.5mL×8.它主要用于生物大分子和亞細(xì)胞器的分離和制備工作。離心機的主要參數(shù)1.相對離心力（RCF）：它是指在離心時作用于顆粒上的離心力相當(dāng)于重力的倍數(shù)。當(dāng)