基因工程菌發(fā)酵第1頁/共44頁分裂不穩(wěn)定：指工程菌分裂時出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象。結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定：指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變第2頁/共44頁一、質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因常見分裂不穩(wěn)定的兩個因素：⑴含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率；⑵這兩種菌比數(shù)率差異的大小。

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對同一工程菌控制不同的比生長數(shù)率可改變質(zhì)粒的拷貝數(shù)：低拷貝質(zhì)粒工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌頻率高如增加工程菌質(zhì)粒拷貝數(shù)可提高穩(wěn)定性；高拷貝質(zhì)粒工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌頻率低但對穩(wěn)定性不利。第4頁/共44頁

菌體生長數(shù)率對質(zhì)?？截悢?shù)和質(zhì)粒穩(wěn)定性有一影響。高生長數(shù)率時質(zhì)?？截悢?shù)下降，但穩(wěn)定性增加。生長數(shù)率/h0.20.4質(zhì)粒拷貝數(shù)10.5×10950400β-半乳糖苷酶工程菌的連續(xù)養(yǎng)3第5頁/共44頁質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法樣品不含抗性標(biāo)記抗生素

平板培養(yǎng)基10-12h100個菌落含抗性標(biāo)記抗生素平板培養(yǎng)基

10-12h統(tǒng)計生長菌落數(shù)重復(fù)三次,計算比值

(穩(wěn)定性stability)第6頁/共44頁二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法

為了提高質(zhì)粒穩(wěn)定性，工程菌培養(yǎng)采用兩階段培養(yǎng)法：⑴先使菌體生長至一定密度；⑵再誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)第7頁/共44頁

由于第一階段外源基因未表達(dá)，減小了重組菌與質(zhì)粒丟失菌的生長速率的差別，增加了質(zhì)粒穩(wěn)定性。在培養(yǎng)基中加入抗菌素抑制質(zhì)粒丟失菌的生長，提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。調(diào)控環(huán)境參數(shù)如溫度、pH、培養(yǎng)基組分和溶解氧濃度第8頁/共44頁

有些含質(zhì)粒菌對發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒菌反應(yīng)慢，間歇改變培養(yǎng)條件以改變兩種菌比生長速率，可改善質(zhì)粒穩(wěn)定性。通過間歇供氧和改變稀釋數(shù)率，都可以提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。第9頁/共44頁第六節(jié)基因工程菌生長代謝的特點(diǎn)

菌體的生長通常用比生長速率來表示。工程菌培養(yǎng)可通過選用不同的碳源控制補(bǔ)料和稀釋速率等方法來控制菌體的生長?？刂凭w的生長對提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性、減少代謝副產(chǎn)物積累、提高外源蛋白產(chǎn)率有重要意義。第10頁/共44頁

大腸桿菌的蛋白/菌體量的比值是基本恒定的，因而菌體的生長速度反映了蛋白質(zhì)的合成速度。培養(yǎng)條件的改變，都會改變菌體的能量代謝和小分子前體的供應(yīng)，影響生物大分子的和成和菌體的生長。第11頁/共44頁一、菌體的生長與能量的關(guān)系

碳源物質(zhì)是組成培養(yǎng)基的主要成分。碳源物質(zhì)為細(xì)胞提供能量，當(dāng)菌體生長所需能量大于菌體有氧代謝提供的能量時，菌體會產(chǎn)生乙酸，導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH值下降，從而影響菌體的生長。適當(dāng)提高pH，可減少乙酸的抑制作用第12頁/共44頁

分批培養(yǎng)中選擇不同的碳源，連續(xù)培養(yǎng)中控制稀釋速率等都能一定范圍內(nèi)控制菌體的生長，從而控制乙酸的產(chǎn)生，減少它的抑制作用。加入蛋氨酸和酵母提取物都能減少乙酸的產(chǎn)生。第13頁/共44頁

大腸桿菌中克隆攜帶氧能力的VHB蛋白的基因可提高菌體生長速率。采用磷酸乙?；溉毕葜曜鳛樗藿M主細(xì)胞，阻止乙酸產(chǎn)生，可提高產(chǎn)量。第14頁/共44頁二、菌體生長與前體供應(yīng)的關(guān)系

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氨基酸（小分子前體）能使菌體比生長率提高，蛋白合成增加?；蚬こ叹|(zhì)粒的表達(dá)需與宿主細(xì)胞競爭共同的前體和催化結(jié)構(gòu)，致工程菌生長速率降低。第15頁/共44頁

質(zhì)粒存在對菌體代謝的影響：中等拷貝質(zhì)粒（56拷貝）的工程菌中與前體合成有關(guān)的酶增加，這些酶的基因大多受終產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)。高拷貝質(zhì)粒的工程菌（240拷貝）中，生長速率和菌體總蛋白合成均減少。這與工程菌大量前體被利用引起前體不足，從而產(chǎn)生“嚴(yán)緊反應(yīng)”有關(guān)。第16頁/共44頁

“嚴(yán)緊反應(yīng)”是當(dāng)氨酰tRNA不足時,核糖體在密碼子上停留,并合成被稱為魔點(diǎn)的ppGpp的結(jié)果。

ppGpp是一個重要的調(diào)控分子。它通過影響RNA鏈的延深過程減少轉(zhuǎn)錄。第17頁/共44頁

它的濃度增加會導(dǎo)致在合成mRNA和rRNA時RNA聚合酶在模板上的移動產(chǎn)生停頓，RNA鏈延長速度減慢，使游離的RNA聚合酶濃度降低，嚴(yán)緊控制的啟動子如rrnA等的轉(zhuǎn)錄減少。也可能ppGpp是通過干擾RNA聚合酶與PL啟動子專一識別反應(yīng)。第18頁/共44頁第七節(jié)基因工程菌發(fā)酵

基因工程菌的培養(yǎng)過程包括:⑴通過搖瓶操作基因工程菌生長的基礎(chǔ)條件,如溫度、pH、培養(yǎng)基各種組分、碳氧比，分析表達(dá)產(chǎn)物的合成、積累對受體細(xì)胞的影響;⑵通過培養(yǎng)罐操作確定培養(yǎng)參數(shù)和控制方案以及順序。第19頁/共44頁菌種一級種子搖瓶二級種子罐培養(yǎng)擴(kuò)大培養(yǎng)

原料發(fā)酵培養(yǎng)滅菌發(fā)酵生產(chǎn)代謝產(chǎn)物分離基配制

微生物工業(yè)發(fā)酵過程簡圖第20頁/共44頁一、基因工程菌的培養(yǎng)方式基因工程菌的培養(yǎng)方式：補(bǔ)料分批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)、透析培養(yǎng)、固定化培養(yǎng)。第21頁/共44頁⒈補(bǔ)料分批培養(yǎng)補(bǔ)料分批培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng),經(jīng)過一段時間后間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進(jìn)一步生長的方法。第22頁/共44頁二、基因工程菌的發(fā)酵工藝

基因工程菌的發(fā)酵與傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵不同,基因工程菌帶外源基因,發(fā)酵的目的是使外源基因高效表達(dá)。它不僅涉及宿主載體和克隆基因之間的相互關(guān)系還和環(huán)境有關(guān)。第23頁/共44頁

工藝要求：外源基因既高效表達(dá)，又有利于產(chǎn)品分離純化。對發(fā)酵影響較大的幾個因素有：⒈培養(yǎng)基的影響⒉接種量的影響⒊溫度的影響⒋溶解氧的影響⒌誘導(dǎo)時機(jī)的影響⒍pH的影響第24頁/共44頁

⒈培養(yǎng)基的影響培養(yǎng)基的組成既要提高工程菌的生長速率，又要保持工程菌的穩(wěn)定性，使外源基因高效表達(dá)。常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米漿、氨水、硫酸銨、氯化銨等。還有無機(jī)鹽、維生素等。第25頁/共44頁

不同的碳源對菌體的生長和外源基因表達(dá)有較大的影響。使用葡萄糖和甘油對菌體比生長速率及呼吸強(qiáng)度相差不大。但使用甘油菌體得率較大，而使用葡萄糖菌體產(chǎn)生的副產(chǎn)品較多。葡萄糖對lac啟動子有阻遏作用。乳糖對lac啟動子有利。第26頁/共44頁

在氮源中，酪蛋白水解物有利于產(chǎn)物的合成與分泌。色氨酸對trp啟動子控制的基因有影響。無機(jī)磷在許多代謝反應(yīng)中是一個效應(yīng)因子，磷濃度不同，影響菌體生長。第27頁/共44頁⒉接種量的影響接種量是指移入的種子液體積和培養(yǎng)液體積的比例。接種量的大小影響發(fā)酵的產(chǎn)量和發(fā)酵周期。接種量小，菌體延遲期較長，使菌齡老化，不利于外源基因表達(dá)。第28頁/共44頁

接種量大，可縮短生長延遲期，菌體迅速繁衍，很快進(jìn)入對數(shù)生長期，適于表達(dá)外源基因。接種量過高，使菌體生長過快，代謝物積累過多，反而會抑制后期菌體的生長。第29頁/共44頁⒊溫度的影響

溫毒對基因表達(dá)的調(diào)控作用發(fā)生在復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯和小分子調(diào)節(jié)分子的合成等水平上。溫度對發(fā)酵過程的影響是多方面的。它影響各種酶的反應(yīng)速度，改變菌體代謝產(chǎn)物的反應(yīng)方向，影響代謝調(diào)控機(jī)制。第30頁/共44頁

適宜的發(fā)酵溫度是既適合菌體的生長，又適合代謝產(chǎn)物合成的溫度。高溫或低溫都會使發(fā)酵異常，影響終產(chǎn)物的形成并導(dǎo)致減產(chǎn)。溫度還影響蛋白質(zhì)的活性和包含體的形成。第31頁/共44頁⒋溶解氧的影響

對于好氧發(fā)酵,溶解氧濃度是重要的參數(shù)。好氧微生物利用溶解于培養(yǎng)液中的氧氣進(jìn)行呼吸。若能提高溶氧速度和氧的利用率，則能提高發(fā)酵產(chǎn)率。第32頁/共44頁

發(fā)酵時，隨DO2濃度的下降，細(xì)胞生長減慢，ST值下降，發(fā)酵后期下降幅度更大。外源基因的高效表達(dá)需要大量的能量，促進(jìn)細(xì)胞的呼吸作用，提高對氧的需求。維持較高的DO2值，才能提高工程菌的生長，利于外源蛋白產(chǎn)物的形成。第33頁/共44頁

采用調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速的方法,

可改變培養(yǎng)過程中的氧供給，提高活菌產(chǎn)量。第34頁/共44頁⒌誘導(dǎo)時機(jī)的影響

對于λPL啟動子型的工程菌，使用cI阻遏蛋白的溫度敏感型突變株（clts857），在28～300C下培養(yǎng)時，該突變體能合成有活性的阻遏蛋白阻遏PL啟動子的轉(zhuǎn)錄；當(dāng)溫度升高420C時，該阻遏蛋白失活，使啟動子啟動轉(zhuǎn)錄，提高目的基因的表達(dá)效率。一般在對數(shù)生長期或?qū)?shù)生長后期升溫誘導(dǎo)表達(dá)。第35頁/共44頁

在對數(shù)生長期，細(xì)胞快速繁殖，直到細(xì)胞密度達(dá)到109/個為止，這時菌體數(shù)目倍增，對營養(yǎng)和氧需求量急增，營養(yǎng)和氧成了菌群旺盛代謝的限制因素。第36頁/共44頁⒍pH的影響pH對細(xì)胞的正常生長和外源蛋白的高效表達(dá)都有影響，所以應(yīng)根據(jù)工程菌的生長和代謝情況，對pH進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)。第37頁/共44頁

如采取兩段培養(yǎng)工藝，培養(yǎng)前期重點(diǎn)是優(yōu)化工程菌的生長條件，其最佳pH在6.8～7.4左右;培養(yǎng)后期重點(diǎn)是優(yōu)化外源蛋白的表達(dá)條件,其最佳pH為6.0～6.5。第38頁/共44頁

總之,最佳化的工藝是獲得:

最快周期、最高產(chǎn)量、最好質(zhì)量、最低消耗、最大安全性、最周全的廢物處理效果、最佳速度和最低失敗率等。第39頁/共44頁三、基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備

應(yīng)用發(fā)酵罐大規(guī)模培養(yǎng)基因工程菌。它不同于微生物發(fā)酵，微生物發(fā)酵目的是為了獲得初級或次級代謝產(chǎn)物，細(xì)胞生長并非主要目標(biāo)，而基因工程發(fā)酵是為了獲得最大量的基因表達(dá)產(chǎn)物。第40頁/