天津大學(xué)生物化學(xué)酶學(xué)第1頁/共119頁第六章酶學(xué)1（研究發(fā)展)我國幾千年前就開始制作發(fā)酵飲料及食品。西方國家在19世紀初確定了發(fā)酵的總方程式：葡萄糖（C6H12O6）乙醇(CH3CH2OH)+2CO21857年微生物學(xué)家巴斯德（Pasteur）等人提出酒精發(fā)酵是酵母細胞活動的結(jié)果。1878年提出了“酶”這個名稱。1913年Michaslis和Menten提出了酶促動力學(xué)原理—米氏學(xué)說。1926年Sumner第一次從刀豆中提出了脲酶結(jié)晶，并證明此酶具有蛋白質(zhì)的性質(zhì)。第2頁/共119頁第六章酶學(xué)2(總）第一節(jié)酶與一般催化劑的比較第二節(jié)酶的分類和命名第三節(jié)酶的化學(xué)性質(zhì)第四節(jié)酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、酶專一性第五節(jié)酶的作用機理第六節(jié)酶促反應(yīng)的速度及其影響因素第七節(jié)酶的分離提純及活力測定第八節(jié)酶的應(yīng)用

第3頁/共119頁第一節(jié)酶與一般催化劑的比較一、與一般催化劑的共性

二、作為生物催化劑的特性

第4頁/共119頁一、與一般催化劑的共性１．用量少而催化效率高。２．不改變化學(xué)反應(yīng)的平衡點，僅能改變反應(yīng)速度。３．可降低反應(yīng)的活化能。活化能是指在一定溫度下一摩爾底物全部進入活化態(tài)所需要的自由能。第5頁/共119頁二、作為生物催化劑的特性1（總）1．催化效率高。2．具有高度的專一性。3．酶易失活。4．活力受調(diào)節(jié)控制。5．活力與輔酶、輔基有關(guān)。第6頁/共119頁二、作為生物催化劑的特性2（1）催化效率高：比非催化反應(yīng)高108－1020倍，比其它催化反應(yīng)高107－1013倍雙氧水裂解(過氧化氫酶）1第7頁/共119頁二、作為生物催化劑的特性32．具有高度的專一性：一種酶只能作用于某一類或某一種特定的物質(zhì)。3．酶易失活：凡使蛋白質(zhì)變性的因素（強酸、強堿、高溫等）都能使酶被破壞而完全失活４．活力受調(diào)節(jié)控制：如抑制劑調(diào)節(jié)、共價修飾調(diào)節(jié)、反饋調(diào)節(jié)、酶原激活及激素等的控制5．活力與輔酶、輔基及金屬離子有關(guān)：有些酶是復(fù)合酶，若將其中小分子物質(zhì)（輔酶、輔基及金屬離子）除去，酶就失去活性。第8頁/共119頁第二節(jié)酶的分類和命名一、酶的分類

1.根據(jù)催化反應(yīng)類型分

2.根據(jù)類別分二、酶的命名

1.系統(tǒng)命名

2.習(xí)慣命名

第9頁/共119頁第二節(jié)酶的分類和命名(分類1)1.根據(jù)催化反應(yīng)類型分1.氧化還原酶（脫氫酶與氧化酶）(1)脫氫酶

A-H2+B（輔酶）←→

A+B-H2(2)氧化酶

B-H2+O2←→BO+H2O2.轉(zhuǎn)移酶

A-X＋B←→A＋B-X3.水解酶

A-B＋H2O←→AOH＋BH第10頁/共119頁第二節(jié)酶的分類和命名(分類2)1.根據(jù)催化反應(yīng)類型分4.異構(gòu)酶5.裂解酶

A←→B+C6.合成酶

A+B+ATP←→C＋ADP(ATP起提供能量活化反應(yīng)分子的作用)第11頁/共119頁第二節(jié)酶的分類和命名(分類2)2.根據(jù)類別分：類、亞類、亞亞類等每一種酶都有由四個數(shù)字組成的編號，前加EC（酶學(xué)委員會）。四個數(shù)字分別表示：該酶屬于在六大類中的歸屬、在亞類中的歸屬、在亞亞類中的歸屬及該酶在一定亞亞類中的位置，如：

乳酸脫氫酶

EC1．1．1．27

四個數(shù)字分別表示：第一大類（氧化還原酶）、第一亞類（氧化-CHOH）、第一亞亞類（氫受體為NAD＋、乳酸脫氫酶在此亞亞類中的序號)第12頁/共119頁第二節(jié)酶的分類和命名(命名1)1．系統(tǒng)命名：底物的名稱+反應(yīng)的類型

如：乙酰磷酸轉(zhuǎn)移酶、ATP：乙酰磷酸轉(zhuǎn)移酶第13頁/共119頁第二節(jié)酶的分類和命名(命名2)2．慣用命名：比較簡短，使用方便，通常依據(jù)酶所作用的底物及其反應(yīng)類型來命名。如催化乳酸脫氫變?yōu)楸岬拿附腥樗崦摎涿?；水解蛋白的酶叫蛋白水解酶；從來源上還分為胰蛋白酶，胃蛋白酶等。第14頁/共119頁第三節(jié)酶的化學(xué)性質(zhì)（總）一、酶大多是蛋白質(zhì)二、酶的輔因子第15頁/共119頁一、酶是蛋白質(zhì)1．對熱不穩(wěn)定。2．為兩性電解質(zhì)。3．引起蛋白質(zhì)變性的化學(xué)及物理因素，同樣也能使酶失活。4．具有膠體物質(zhì)的一系列特性。5．受蛋白水解酶作用而喪失活性。6．酶的催化活性與蛋白質(zhì)本性密切聯(lián)系。7．許多酶的氨基酸排列順序已陸續(xù)測出。酶有以下性質(zhì)與蛋白質(zhì)極為相似第16頁/共119頁二、酶的輔因子輔因子：酶中除蛋白質(zhì)外的非蛋白小分子物質(zhì)。全酶=酶蛋白+輔因子輔因子類型：金屬離子、小分子有機化合物、有時這兩者協(xié)同作用。作用：作為電子、原子或某些基團的載體參與反應(yīng)，并促進整個催化過程的進行。輔酶：用透析法可除去的小分子有機物，直接參加催化反應(yīng)。輔基：用透析法不易除去的小分子物質(zhì)，如金屬離子，它間接參加反應(yīng)。第17頁/共119頁第四節(jié)酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系、專一性一、酶結(jié)構(gòu)與功能二、酶作用的專一性

第18頁/共119頁一、酶結(jié)構(gòu)與功能（一）活性部位和必需基因（二）酶原的激活（三）同功酶第19頁/共119頁（一）活性部位和必需基團1必需基團：酶分子的某些基團，經(jīng)化學(xué)修飾改變后，則酶的活性即會喪失。活性中心：是指酶分子中直接和底物結(jié)合，并和酶催化作用直接有關(guān)的部位?；钚圆课换钚灾行牡?0頁/共119頁（一）活性部位和必需基團2(1)結(jié)合基團催化基團酶活性部位上的基團有兩類結(jié)合基團：參與和底物結(jié)合的基團第21頁/共119頁（一）活性部位和必需基團2(2)催化基團：直接參與催化反應(yīng)的基團。

胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）

的活性中心第22頁/共119頁（一）活性部位和必需基團2(3)

隨肽鏈的盤繞折疊，構(gòu)成酶活性部位的基團彼此靠近，形成具有一定空間結(jié)構(gòu)的區(qū)域。第23頁/共119頁（一）活性部位和必需基團3（總）1．酶的專一性研究2．酶分子側(cè)鏈基團的化學(xué)修飾3．X－射線晶體衍射法確定酶的活心中心的方法（總）第24頁/共119頁1．酶的專一性研究

通過研究酶的專一性底物的結(jié)構(gòu)，判斷和確定活性中心的結(jié)構(gòu)特點。第25頁/共119頁2．酶分子側(cè)鏈基團的化學(xué)修飾1使用一些對酶分子側(cè)鏈功能基團可進行共價修飾的試劑作用于酶，以查出哪些基團是保持酶活力所必需的。酶分子中可被修飾的基團：硫氫基（巰基）、羥基、咪唑基、氨基及羧基等。可用作化學(xué)修飾的試劑：用的較多的有DFP（二異丙基氟磷酸）。第26頁/共119頁2．酶分子側(cè)鏈基團的化學(xué)修飾2二異丙基氟磷酸（DFP）的作用第27頁/共119頁3．X—射線晶體衍射法直接對酶三維空間結(jié)構(gòu)進行分析實驗證明，大多數(shù)酶分子的絕大部分非極性側(cè)鏈匯集成三維結(jié)構(gòu)的“骨架”，而大部分極性側(cè)鏈則位于酶分子表面，這樣的結(jié)構(gòu)是有利于進行酶的催化反應(yīng)的。

牛胰蛋白酶第28頁/共119頁（二）酶原的激活1酶原的激活：由無活性的酶原變成活性酶的過程。舉例：某些酶特別是一些與消化作用有關(guān)的酶。常見的酶原及其激活劑:(南大P274，表7-5)第29頁/共119頁（二）酶原的激活2(胰蛋白酶的激活)纈天天天天賴異纈甘組SS絲SS腸激酶（激活作用）纈天天天天賴異甘組SS絲纈SS活性中心胰蛋白酶原胰蛋白酶第30頁/共119頁（三）同工酶同工酶：具有不同分子形式，卻催化相同的化學(xué)反應(yīng)的酶。同工酶具有不同的理化性質(zhì)、免疫學(xué)性質(zhì)。這種差異是由于酶蛋白的編碼基因不同，或者由于mRNA或翻譯產(chǎn)物是經(jīng)過不同加工過程產(chǎn)生的。具有不同分子形式的同工酶之所以能催化相同的化學(xué)反應(yīng)，是因為它們的活性部位在結(jié)構(gòu)上相同或者至少非常相似。第31頁/共119頁二、酶作用的專一性（總）含義：酶對所有作用的底物有嚴格的選擇性，一種酶僅能作用于一種物質(zhì)或一類分子結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)，這種選擇性作用稱為酶的專一性。

1．結(jié)構(gòu)專一性

2．立體異構(gòu)專一性第32頁/共119頁1．結(jié)構(gòu)專一性各種酶對底物結(jié)構(gòu)的專一性要求不同：有的酶只對底物分子中其所作用的鍵要求嚴格；而另一些酶對底物的要求更高些。α－葡萄糖苷酶:要求底物必須是D－葡萄糖通過α－糖苷鍵所形成的糖苷，不要求R基團。第33頁/共119頁2．立體異構(gòu)專一性幾乎所有酶對立體異構(gòu)體都具有高度的專一性。酶的立體專一性在實踐很有意義乳酸脫酶：能催化L－乳酸脫氫變?yōu)楸?，對D-乳酸則無作用D－乳酸L－乳酸

乳酸脫酶－2H第34頁/共119頁第五節(jié)酶的作用機理（總）一、酶的催化作用與分子活化能

二、與酶的高效率有關(guān)的因素

第35頁/共119頁一、酶的催化作用與分子活化能1能閾:在一個反應(yīng)體系中，只有那些含能達到或超過某一定限度的活化分子才能在碰撞中發(fā)生化學(xué)反應(yīng),這一限度即為能閾。使反應(yīng)達到一定能閾的途徑有兩條：

1．對反應(yīng)體系加熱或用光照射。

2．使用適當?shù)拇呋瘎?，降低反?yīng)的能閾，使反應(yīng)沿著一個活化能閾較低的途徑進行。第36頁/共119頁一、酶的催化作用與分子活化能2其活化能正常為75.3千焦耳。用膠態(tài)鉑作為催化劑時，活化能降至49.0千焦耳。用過氧化酶催化時，則可降低至8.4千焦耳反應(yīng)速度增加一億倍以上。過氧化氫分解成水和氧的反應(yīng)：第37頁/共119頁一、酶的催化作用與分子活化能3反應(yīng)過程中能的變化第38頁/共119頁一、酶的催化作用與分子活化能3反應(yīng)過程中能的變化第39頁/共119頁二、與酶的高效率有關(guān)因素（總）（一）底物與酶的靠近及定向（二）酶使底物分子中的敏感鍵“變形”

（三）共價催化—中間體學(xué)說（四）酸堿催化（五）酶活性中心是低介電區(qū)域

第40頁/共119頁（一）底物與酶的靠近及定向（1靠進）1．靠近效率：催化基團－COO－愈靠近底物酯鍵，則反應(yīng)速度愈快，在最靠近的情況下，速度可由開始的1增至53000倍。酯酯水解相對速度12053000第41頁/共119頁（一）底物與酶的靠近及定向（2定向1）(1)鎖鑰學(xué)說(2)軌道定向第42頁/共119頁（一）底物與酶的靠近及定向（2定向2）1890年有些學(xué)者提出的，強調(diào)酶對它所作用的底物有著嚴格的選擇性，它只能催化一定結(jié)構(gòu)或一些結(jié)構(gòu)近似的化合物發(fā)生反應(yīng)。(1)鎖鑰學(xué)說第43頁/共119頁（一）底物與酶的靠近及定向（2定向1）1958年由Kosnland提出的，該學(xué)說認為酶表面并沒有一種與底物互補的固定形狀，而只是由于底物的誘導(dǎo)才形成了互補形狀;反應(yīng)后，釋放出產(chǎn)物，酶的構(gòu)象再逆轉(zhuǎn)，回到它們的初始狀態(tài)。（2）軌道定向假說（誘導(dǎo)楔合學(xué)說）第44頁/共119頁（二）酶使底物分子中的敏感鍵“變形”

酶使底物中的敏感鍵發(fā)生“變形”，而易于破裂。酶中的某些基團或離子可以使底物分子內(nèi)敏感鍵中的某些基團的電子云密度增高或降低，產(chǎn)生“電子張力”，使敏感鍵的一端更加敏感，更易于發(fā)生反應(yīng)，此學(xué)說的理論依據(jù)來源于羧肽酶的X—衍射分析結(jié)果。第45頁/共119頁（三）共價催化—中間體學(xué)說1這種方式是底物與酶形成一個反應(yīng)活性很高的共價中間物，它很易變成過渡態(tài)而大大降低反應(yīng)的活化能。證明此學(xué)說的正確與否可用光譜法，甚至用電子顯微鏡觀察中間產(chǎn)物的存在。第46頁/共119頁（三）共價催化—中間體學(xué)說1S+E=SE→E+P←第47頁/共119頁（四）酸堿催化

酶活性部位上的某些基團（如氨基、羥基、硫氫基、咪唑基等）可作為良好的質(zhì)子供體或受體，對底物進行酸堿催化。第48頁/共119頁（五）酶活性中心是低介電區(qū)域

酶的活性中心穴內(nèi)相對地說是非極性的。因此，酶的催化基團被低介電環(huán)境所包圍。在某些情況下，還可能排除高極性的水分子。這樣，底物分子的敏感鍵和酶的催化基團之間就會有很大的反應(yīng)力，這是有助于加速酶反應(yīng)的。第49頁/共119頁第六節(jié)酶促反應(yīng)的速度及其影響因素一、酶反應(yīng)速度的測量

二、影響酶促反應(yīng)速度的因素

第50頁/共119頁一、酶反應(yīng)速度的測量11．測量單位時間內(nèi)底物的消耗量2．測量單位時間內(nèi)產(chǎn)物的生成量第51頁/共119頁一、酶反應(yīng)速度的測量2產(chǎn)物的濃度酶反應(yīng)的速度曲線從圖中可見，開始一段時間，反應(yīng)速度幾乎維持恒定。但隨時間的延長，曲線斜率逐漸減少，反應(yīng)速度逐漸降低。斜率=濃度/時間

=vt第52頁/共119頁一、酶反應(yīng)速度的測量3（1）底物濃度降低、產(chǎn)物濃度上升而逐漸增大了逆反應(yīng)。（2）酶本身在反應(yīng)中失活，產(chǎn)物的抑制等。因此，一般測定酶促反應(yīng)初期的速度，因為此時以上因素還來不及起作用，此速度稱為“反應(yīng)初速度”（條件：底物濃度足夠大時）其原因可能是第53頁/共119頁二、影響酶促反應(yīng)速度的因素（總）（一）酶濃度對酶作用的影響（二）pH對酶作用的影響（三）溫度對酶作用的影響（四）底物濃度對酶作用的影響（五）激活劑對酶作用的影響（六）抑制劑對酶作用的影響第54頁/共119頁（一）酶濃度對酶作用的影響反應(yīng)的速度v酶的濃度（[E])v=k[E]在底物足夠過量而其他條件固定的條件下，酶促反應(yīng)的速度和酶濃度成正比。第55頁/共119頁（二）pH對酶作用的影響相對活力各種酶的pH值的活性曲線2468100最適pH:酶表現(xiàn)出最大活性的pH。生物體內(nèi)大多數(shù)酶的最適pH接近于中性（6.5-8.0）。胃蛋白酶的最適pH為1.5-2.5,胰蛋白酶的最適pH在9左右。溶液pH偏離最適pH時，酶的活性降低，偏離越遠，活性越低。胃蛋白酶胰蛋白酶第56頁/共119頁（三）溫度對酶反應(yīng)的影響1反應(yīng)的速度v溫度tOC低溫時酶的活性低，酶促反應(yīng)速度很慢。溫度升高時，反應(yīng)速度也逐步增加但當溫度增加到一定程度以后，引起酶的變化，酶促反應(yīng)減慢以至消失。第57頁/共119頁（三）溫度對酶反應(yīng)的影響2最適溫度:酶表現(xiàn)最大催化能力時的溫度大多數(shù)酶的最適溫度接近于體溫370C。但也有個別的酶具有較大的抗熱性。酶的反應(yīng)活性在低溫下并不喪失，只是催化活性很微弱，溫度回升活性又可恢復(fù)。反應(yīng)的速度v溫度tOC最適溫度第58頁/共119頁（四）底物濃度對酶作用的影響1一級反應(yīng)：當?shù)孜餄舛容^低時，反應(yīng)速度與底物濃度成正比關(guān)系?；旌霞壏磻?yīng)：隨著底物濃度的增加，反應(yīng)速度不再按正比升高。零級反應(yīng):隨底物濃度的不斷加大，反應(yīng)速度不再上升，趨向一個極限，說明酶已被底物所飽和。一級反應(yīng)v[S]Vmax1/2VmaxKm零級反應(yīng)混合級反應(yīng)第59頁/共119頁（四）底物濃度對酶作用的影響2“中間產(chǎn)物”假說

為了解釋上圖所示現(xiàn)象，曾有許多假說，其中“中間產(chǎn)物”假說是被大家公認的比較合理的假說。它認為酶與底物先結(jié)合成一個絡(luò)合物，即中間產(chǎn)物。此中間產(chǎn)物亦被人們看作為穩(wěn)定的過渡態(tài)物質(zhì)，然后此絡(luò)合物再進一步分解成為產(chǎn)物和游離態(tài)酶。E+SESP+EK1K2K3K4第60頁/共119頁（四）底物濃度對酶作用的影響31．米氏方程的提出

2．米氏常數(shù)的意義及測定第61頁/共119頁1．米氏方程的提出1(方程）1913年Michaelis和Menten提出酶促動力學(xué)的基本原理，并歸納為一個數(shù)學(xué)式加以表達-米氏方程。米氏方程表明了底物濃度與酶反應(yīng)速度間的定量關(guān)系，這就使“中間產(chǎn)物假說”得到了人們的普遍承認，現(xiàn)在一般稱為“米氏學(xué)說”。第62頁/共119頁1．米氏方程的提出2(解釋1）米氏方程圓滿地表示了[s]和V之間的關(guān)系1當?shù)孜餄舛容^低時，Km＞＞[s]，分母中[s]可忽略不計，即：得：

V=（Vmax/km）[s]

即反應(yīng)速度與底物濃度成正比，符合一級反應(yīng)第63頁/共119頁1．米氏方程的提出2(解釋2）米氏方程圓滿地表示了[s]和V之間的關(guān)系2當?shù)孜餄舛群芨邥r[S]＞＞Km，Km可忽略不計，即：得：

V=Vmax

即反應(yīng)速度與底物濃度無關(guān)，符合零級反應(yīng)第64頁/共119頁2．米氏常數(shù)意義及測定1(意義1）

當反應(yīng)速度v等于最大的反應(yīng)速度Vmax的一半時，即v=Vmax/2，代入方程得：簡化得：

Km=[s]第65頁/共119頁2．米氏常數(shù)意義及測定1(意義2）當酶促反應(yīng)速度達到最大的反應(yīng)速度一半時的底物濃度。它的單位是mol/L，與底物濃度單位一致。不同酶促反應(yīng)的Km可相差很大，一般在10-3－10-5mol/L之間。米氏常數(shù)在酶學(xué)研究中是一個極重要的數(shù)據(jù)。米氏常數(shù)的物理意義是：第66頁/共119頁2．米氏常數(shù)意義及測定2（Km特點）

（1）Km是酶的特征常數(shù)之一。（2）如果一種酶有幾種底物，則對每一種底物，各有一個特定的km值,因此，測定酶的Km可以作為鑒別酶的一種手段。（3）Km愈?。?/Km愈大）酶對底物的親和力愈大，達到最大反應(yīng)速度一半時需要的底物濃度就越小。因此Km值最小的底物一般稱為該酶的最適底物或天然底物。（4）可由所要求的v（應(yīng)到達Vmax的百分數(shù)），求出應(yīng)當加入的[S]；反過來，也可根據(jù)已知的[S]，求出該條件下的v。第67頁/共119頁2．米氏常數(shù)意義及測定3（實際意義）(1)鑒定酶(2)判斷酶的最適底物(3)計算一定速率下的底物濃度(4)了解酶的底物在體內(nèi)具有的濃度水平(5)判斷反應(yīng)方向和趨勢(6)判斷抑制類型第68頁/共119頁2．米氏常數(shù)意義及測定4（測定1[1]）linewenver-Burk的雙倒數(shù)作圖法1

1Km11=

+

VVmax[S]Vmax若以1/V對1/[S]作圖,即得:即取米氏方程的倒數(shù)第69頁/共119頁2．米氏常數(shù)意義及測定4（測定1[2]）斜率=Km/Vmax-1/Km1/Vmaxlinewenver-Burk的雙倒數(shù)作圖法2此法因方便而應(yīng)用最廣實驗點過分集中于直線的左端，作圖不易十分準確第70頁/共119頁2．米氏常數(shù)意義及測定4（測定2）以v對v/[S]作圖,得一直線其縱軸截距為Vmax橫軸截距為Vmax/Km斜率為－Km法:

即把米氏方程改寫為：VmaxvVmax/Kmv/[S]斜率為－Km第71頁/共119頁（五）激活劑對酶作用的影響1(概念)激活劑:能增進酶的活性，加速酶促反應(yīng)進行的物質(zhì)。激活:使已有活性的酶活性增高。是由小到大的問題。致活:活性從無到有的問題。如Mg2+是各種磷酸激酶的激活劑；CO2+，Mn2+，Zn2+是某些肽酶的激活劑；Cu2+、Fe2+是某些氧化酶的激活劑。第72頁/共119頁（五）激活劑對酶作用的影響2(機理)

（1）可能是構(gòu)成酶活性中心的成分之一，由于分離提純而喪失，所以加入某些金屬離子有助于增強酶的活性。（2）可能是酶與底物結(jié)合的橋梁。作用機理第73頁/共119頁（六）抑制劑對酶作用的影響1抑制作用:使酶活力下降，但并不引起酶蛋白變性的作用。酶的抑制劑:對酶抑制作用的物質(zhì)。失活作用:使酶變性的作用。抑制作用一般分為兩類：

1．不可逆抑制作用

2．可逆的抑制作用第74頁/共119頁1．不可逆抑制作用1定義:抑制劑與酶結(jié)合后，不能用透析的方法除去抑制劑而恢復(fù)酶活力。舉例:二異丙基氟磷酸（DFP)能夠與胰凝乳蛋白酶或乙酰膽堿酯酶活力中心的絲氨酸殘基反應(yīng)，形成穩(wěn)固的共價鍵，因而抑制酶的活性.不可逆抑制作用1第75頁/共119頁1．不可逆抑制作用2又如碘乙酸、碘乙胺對巰基酶的不可逆抑制不可逆抑制作用2

碘乙酸(碘乙胺)第76頁/共119頁2．可逆的抑制作用可逆的抑制作用:抑制劑與酶的結(jié)合為一可逆反應(yīng),用透析等方法能除去抑制劑使酶恢復(fù)活力它又分為（1）競爭性抑制作用（2）非競爭性抑制作用（3）反競爭性抑制第77頁/共119頁（1）競爭性抑制作用1(定義)定義:當抑制劑與酶結(jié)合后，妨礙了底物與酶結(jié)合，因而降低了酶的活力.第78頁/共119頁（1）競爭性抑制作用2(舉例)

如琥珀酸脫氫酶能催化琥珀酸脫氫生成反丁烯二酸與琥珀酸結(jié)構(gòu)近似的如草酸、丙二酸、草酰乙酸或戌二酸均可作為琥珀脫氫酶的競爭性抑制劑第79頁/共119頁（1）競爭性抑制作用3(式子表示)

競爭性抑制作用可用下式表示：

Ki2第80頁/共119頁（1）競爭性抑制作用4(速度方程1)

按推導(dǎo)米式方程的方法可導(dǎo)出競爭性抑制作用的速度方程

第81頁/共119頁（1）競爭性抑制作用4(速度方程2)從上述速度方程可以看出：有競爭性抑制劑存在時，Km值增大1＋[I]/Ki倍，而且Km值將隨著[I]增高而增大，當[S]＞＞＞km時（也就是[s]使酶飽和時，方程即為v=V，最大反應(yīng)速度不變。競爭性抑制劑存在時，改變Km而不改變V的作用。反映競爭性抑制作用的特點是底物濃度很高時，抑制作用可以被解除，競爭性抑制劑影響Km而不影響V.第82頁/共119頁（1）競爭性抑制作用4(速度方程3)體現(xiàn)在圖中，I存在時與I不在存在時所得直線都在縱軸上交于一點，即縱軸截距相等。而橫軸截距負值減少，斜率增大。其作用機理可能是由于底物與抑制劑結(jié)合在酶分子的同一部位上，也可能是由于底物或抑制劑中的一個與酶結(jié)合后，引起酶發(fā)生變化，產(chǎn)生不利于另一個結(jié)合的構(gòu)象.1/v1/[S]－1/km－1/km（1+[I]/Ki）Vmax正常[I]加大第83頁/共119頁（1）競爭性抑制作用4(速度方程4)Vmax不變Km變大第84頁/共119頁（2）非競爭性抑制作用1(定義1)定義1:有些抑制劑和底物可同時結(jié)合在酶的不同部位上，也就是說抑制劑與酶結(jié)合后，不妨礙酶再與底物結(jié)合。第85頁/共119頁（2）非競爭性抑制作用1(定義2)

但所形成的酶－底物-抑制劑三元復(fù)合物[ESI]不能進一步分解為產(chǎn)物，因此酶活性降低。第86頁/共119頁（2）非競爭性抑制作用2(式子表示)非競爭性抑制作用可用下式表示第87頁/共119頁（2）非競爭性抑制作用3(速度方程1)

推出的速度反應(yīng)方程為雙倒數(shù)法處理第88頁/共119頁（2）非競爭性抑制作用3(速度方程2)

由方程可以看出：非競爭性抑制劑存在時，v減少1＋[I]/Ki倍。而且v將隨[I]增大而降低，但Km值不變。當[S]無限增大時，有I存在時的曲線永遠低于無抑制劑存在的曲線，彼此不能重合。因此，反映出此種抑制不能增大[S]來克服。這種影響v而不改變Km的作用為非競爭性抑制作用的特點第89頁/共119頁（2）非競爭性抑制作用3(速度方程3)

非競爭性抑制作用改變v而不影響Km的效應(yīng)表現(xiàn)在：有I存在時得到的直線和沒有I存在時所得的直線在橫軸上交于一點，即橫軸截距相等。都是－1/km。但縱軸截距和直線斜率增大，并將隨著[I]增大而增大，這個特點也常用來做為判斷非競爭性抑制作用的一個根據(jù)。1/v1/[S]－1/km正常[I]加大第90頁/共119頁（2）非競爭性抑制作用3(速度方程4)

Vmax變小Km不變第91頁/共119頁（2）非競爭性抑制作用3(作用機理4)

抑制作用于酶活性部位中催化基團，也可能是與維持酶分子構(gòu)象的必需基團作用，而使酶的活性降低。非競爭性抑制作用的機理可能是第92頁/共119頁（3）反競爭性抑制1(式子表示)

相對于上述兩種抑制作用，反競爭性抑制存在著下列平衡，抑制劑只能與酶－底物中間復(fù)合物結(jié)合第93頁/共119頁（3）反競爭性抑制2(速度方程)

隨著抑制劑的增加，Vmax和Km均變小，形成的三元復(fù)合物不能分解為產(chǎn)物，因此影響反應(yīng)速度。這類抑制很少見。其動力學(xué)曲線的特征是第94頁/共119頁3.三種不同抑制作用的特點工科P104，南大P281第95頁/共119頁4.對酶的抑制作用研究的意義

酶的抑制作用在醫(yī)學(xué)、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及基礎(chǔ)理論研究上都具有一定的意義。如人服用磺胺藥物后，磺胺藥物即作為競爭性抑制劑，可以和細菌體內(nèi)利用對－氨基苯甲酸的酶結(jié)合。從而使細菌體內(nèi)無法合成其生活所需物－葉酸，而導(dǎo)致代謝紊亂，細菌繁殖受到抑制；在農(nóng)業(yè)上抑制作用常用于設(shè)計新農(nóng)藥第96頁/共119頁第七節(jié)酶的分離提純及活力測定

一、酶的分離提純二、活力測定第97頁/共119頁一、酶的分離提純(總)1．目的2．提純3．制備戰(zhàn)略第98頁/共119頁1．目的（1）研究酶的理化特性、鑒定酶（2）生物試劑及用作藥物（高純度）第99頁/共119頁2．提純酶有兩大類，胞外酶及胞內(nèi)酶。胞外酶易分離。如收集動物胰液即可分離出其中的各種蛋白酶及脂酶。胞內(nèi)酶存在于細胞內(nèi)，必須破碎細胞才能進行分離。第100頁/共119頁3．制備戰(zhàn)略(總)（1）選材（2）破碎細胞（3）抽提（4）濃縮（5）純化第101頁/共119頁3．制備戰(zhàn)略1（1）選材：含量高，易于分離。（2）破碎細胞：研磨，勻漿器，搗碎機。（3）抽提：抽提時注意的因素：pH、溫度、鹽及蛋白酶等。一般在低溫下，調(diào)節(jié)pH至等電點，用鹽析（硫酸銨或氯化鈉）或有機溶劑（乙醇、丙酮、異丙醇等）使酶沉淀。酶是生物活性物質(zhì)，一般在0—50C進行提純。乙醇、丙酮等有機溶劑分級分離時必須在－150C—－200C進行，酶制品一般都應(yīng)在－200C以下低溫保存。第102頁/共119頁3．制備戰(zhàn)略2：

（4）濃縮：抽提液和發(fā)酵液中酶濃度一般都很低，所以，在純化前要進行濃縮，常用的方法有：①蒸發(fā)：高真空的條件下，大面積熱空氣接觸，使水分在瞬時蒸發(fā)，而達到目的。由于水分蒸發(fā)時能帶走熱量，所以，只要真空條件好，受熱并不強。②超過濾。③凝膠過濾。④冰凍濃縮。⑤其他：如聚乙二醇濃縮等。第103頁/共119頁3．制備戰(zhàn)略3：

（5）純化：首先了解所需純化酶的理化性質(zhì)（溶解度、分子大小和解離特性），以及酶的穩(wěn)定性等。判斷所選方法與條件的適當性，控制操作條件。具體純化方法有：①根據(jù)分子大小：凝膠過濾、超濾、超離心等。②根據(jù)解離性質(zhì)：離子交換、電泳、等電聚焦等。③根據(jù)溶解度：鹽析、有機溶劑沉淀等。④酶與底物、輔助因子及抑制劑的專一性親和作用，可采用親和層析。第104頁/共119頁二、活力測定1．酶活力與酶反應(yīng)速度

2．酶的活力(activity)單位

3．酶的比活力(specificactivity)第105頁/共119頁1．酶活力與酶反應(yīng)速度1從圖中可知，反應(yīng)速度只在最初一段時間內(nèi)保持恒定，隨時間延長，酶反應(yīng)速度逐漸下降。研究酶反應(yīng)速度，應(yīng)研究酶促反應(yīng)的初速度。因為此時反應(yīng)速度是成直線上升。產(chǎn)物的濃度酶反應(yīng)的速度曲線斜率=濃度/時間

=v酶活力的大小可以用在一定條件下，它所催化某一化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速度來表示。酶反應(yīng)速度可用單位時間內(nèi)、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示：V=[S]/t[P]t第106頁/共119頁1．酶活力與酶反應(yīng)速度2造成反應(yīng)速度下降的原因：（1）底物濃度降低（2）酶部分失活（3）產(chǎn)物對酶抑制（4）產(chǎn)物濃度增加加速了逆反應(yīng)的進行第107頁/共119頁1．酶活力與酶反應(yīng)速度3測定產(chǎn)物增加量或底物減少量的常用的方法：化學(xué)滴定法、比色、比旋光、氣體測壓、測定紫外線吸收、