微生物:

結構都相當簡單，個體多數(shù)十分微小，通常要用光學顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細胞結構。2、類群1、特點當前1頁，總共55頁。病毒（無細胞結構、寄生生活）當前2頁，總共55頁。細菌

電子顯微鏡下的結核桿菌當前3頁，總共55頁。放線菌當前4頁，總共55頁。真菌青霉菌酵母菌當前5頁，總共55頁。原生生物當前6頁，總共55頁。微生物:1.特點：結構都相當簡單,個體多數(shù)十分微小.通常要用光學顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細胞結構.病毒細菌放線菌真菌原生生物2.微生物的類群無細胞結構原核細胞真核細胞到目前為止，幾十項Nobel生理學和醫(yī)學獎，化學獎都與微生物學有關當前7頁，總共55頁。微生物的分離和純培養(yǎng)技術是微生物最基本的實驗技術，它包括培養(yǎng)基的制備、滅菌和消毒、接種、培養(yǎng)等步驟當前8頁，總共55頁。內容提要：微生物及其分類培養(yǎng)基與各類營養(yǎng)物質無菌技術菌落大腸桿菌的純化培養(yǎng)微生物數(shù)量的測定當前9頁，總共55頁。一、培養(yǎng)基1、概念：人們按照微生物對營養(yǎng)物質的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質。當前10頁，總共55頁。按物理狀態(tài)不同劃分固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基中加入一定量凝固劑，使其成為固體狀態(tài)，瓊脂含量一般為1.5%-2.0%瓊脂含量一般為0.2%-0.7%不加任何凝固劑半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基常用來進行微生物的分離、鑒定、活菌計數(shù)及菌種保藏觀察微生物的運動特征、分類鑒定及噬菌體效價滴定大規(guī)模工業(yè)生產及在實驗室進行微生物的基礎理論和應用方面的研究2、分類當前11頁，總共55頁。按用途不同劃分基礎培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基含有一般微生物生長繁殖所需的基本營養(yǎng)物質的培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）用來將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來的培養(yǎng)基用于鑒別不同類型微生物的培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基微生物產生某種代謝產物，與培養(yǎng)基中的特殊化學物質發(fā)生特定的化學反應，產生明顯的特征變化在培養(yǎng)基中加入相應的特殊營養(yǎng)物質或化學物質，抑制不需要的微生物的生長，有利于所需微生物的生長2、分類當前12頁，總共55頁。選擇培養(yǎng)基應用加入青霉素加入高濃度食鹽不加氮源不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基加入青霉素等抗生素延伸：分離酵母菌、霉菌等真菌分離金黃色葡萄球菌分離固氮菌分離自養(yǎng)型微生物分離導入了目的基因的受體細胞當前13頁，總共55頁。鑒別培養(yǎng)基:加入伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基（EMS培養(yǎng)基）鑒別大腸桿菌現(xiàn)象：藍紫色金屬光澤當前14頁，總共55頁。按成分不同劃分天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基化學成分不恒定的天然有機物牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基。用于工業(yè)生產化學成分完全了解的物質配制而成的培養(yǎng)基高氏1號培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基。用于分類和鑒定2、分類當前15頁，總共55頁。一.培養(yǎng)基：3.基本營養(yǎng)：碳源、氮源、水、無機鹽、生長因子（能源）⑴碳源無機碳源：有機碳源：CO2、CO32-、HCO3-牛肉膏、蛋白胨等自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物⑵氮源無機氮源：有機氮源：NH4＋、NO3-牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等注：含CHON的有機物是異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源（3）能源當前16頁，總共55頁。一.培養(yǎng)基：（4）（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）微生物生長不可缺少的微量有機物如：維生素、氨基酸、堿基等

生長因子：當前17頁，總共55頁。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養(yǎng)基。培養(yǎng)基組分作用瓊脂20g牛肉膏5g蛋白胨10gNaCl5gH2O定容至1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方凝固劑提供碳源、氮源、能源、生長因子碳源、氮源、生長因子、能源無機鹽水、溶劑當前18頁，總共55頁。4.培養(yǎng)基要滿足微生物對環(huán)境條件的需求

：真菌微酸性（5.0-6.0）細菌中性（6.5-7.5）放線菌微堿性（7.5-8.5）大多數(shù)微生物適宜生長的溫度在25-40℃之間厭氧菌需提供無氧條件pH：溫度：氧氣：當前19頁，總共55頁。（1）滅菌：

使用強烈的理化因素殺死物體內外所有的微生物，包括芽孢和孢子。二.無菌技術：泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，防止外來雜菌的污染的方法當前20頁，總共55頁。灼燒滅菌干熱滅菌箱高壓蒸汽滅菌鍋當前21頁，總共55頁。

（2）消毒：使用較為溫和的物理或化學方法殺死物體表面或內部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）煮沸消毒法：100℃5-6min巴氏消毒法：70-75℃30min或80℃15min化學藥劑消毒法：酒精、氯氣紫外線消毒：實驗前30min當前22頁，總共55頁。煮沸消毒法巴氏消毒法化學藥劑（70%酒精等）紫外線針對不耐高溫的液體接種室、超凈工作臺能耐高溫的，需要保持干燥的物品灼燒法干熱滅菌高壓蒸汽滅菌接種工具（接種環(huán)等）實驗操作者的雙手培養(yǎng)皿等玻璃器皿培養(yǎng)基消毒方法滅菌方法實驗操作者的衣服當前23頁，總共55頁。單個或少數(shù)菌體2.特征：大小、形狀、光澤度、顏色、透明度等。3.功能：1.定義：三.菌落鑒定菌種的重要依據(jù)固體培養(yǎng)基上大量繁殖子細胞群體當前24頁，總共55頁。四、大腸桿菌的分離和純培養(yǎng)分散成單個細胞,形成單個菌落1、制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（大腸桿菌分離和純培養(yǎng)）計算、稱量（配制固體培養(yǎng)基要加入瓊脂）溶化調pH(注意：滅菌前調PH)分裝、包扎滅菌（高壓蒸汽滅菌）倒平板當前25頁，總共55頁。倒平板技術1234使瓶口迅速通過火焰在火焰旁打開錐形瓶打開一條稍大于瓶口的縫隙，向培養(yǎng)皿中倒入約10-20ml倒入培養(yǎng)皿，立即蓋上皿蓋。等待平板冷卻凝固后倒置當前26頁，總共55頁。1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。問題討論當前27頁，總共55頁。

2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。當前28頁，總共55頁。3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。當前29頁，總共55頁。

4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？

空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。當前30頁，總共55頁。四.大腸桿菌的純化培養(yǎng)：⑴平板劃線法：2.接種：交叉劃線法連續(xù)劃線法當前31頁，總共55頁。將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)_______在_______旁冷卻接種環(huán)，并打開棉塞將試管口通過火焰.將已______的接種環(huán)伸入菌液中蘸取一環(huán)菌液左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內，劃__________條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養(yǎng)基。.將試管通過火焰，并塞上棉塞火焰冷卻三至五灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的_______開始往第二區(qū)域內劃線。重復以上操作，在三、四、五區(qū)域內劃線。注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連。末端燒紅將平板_____放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

倒置當前32頁，總共55頁。問題討論為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物殺死上次殘留的菌種，保證使下一次劃線時，菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。當前33頁，總共55頁。6支試管，分別加入9ml無菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106⑵稀釋涂布平板法：a.梯度稀釋菌液：菌液當前34頁，總共55頁。b.涂布平坂取0.1ml菌懸液微量移液器當前35頁，總共55頁。當前36頁，總共55頁。將接種后的培養(yǎng)基和一個未接種的培養(yǎng)基，放入37℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)12h-24h,直到長出菌落為止。3、培養(yǎng)當前37頁，總共55頁。Pourplate(3).稀釋倒平板法當前38頁，總共55頁。四.大腸桿菌的純化培養(yǎng)：1.制備培養(yǎng)基2.接種：3.培養(yǎng)：將接種后的培養(yǎng)基和一個未接種的培養(yǎng)基放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h后，觀察并記錄當前39頁，總共55頁。4、實驗結果觀察5、菌株的保存方法固體斜面培養(yǎng)基甘油管藏臨時保存：長期保存：擱置斜面當前40頁，總共55頁。微生物數(shù)量的計算直接計數(shù)法間接計數(shù)法當前41頁，總共55頁。（一）直接計數(shù)法

——顯微鏡直接計數(shù)法將待測樣品制成懸液，然后取一定量的懸液放在顯微鏡下進行計數(shù)。根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來計算出體積內的微生物總數(shù)。一般適用于純培養(yǎng)懸浮液中單細胞菌體的計數(shù)。優(yōu)點：直觀、快速、操作簡單缺點：不能區(qū)分死菌與活菌，所得為總數(shù)，結果往往偏高不適于對運動細菌的計數(shù)需要相對高的細菌濃度個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察當前42頁，總共55頁。1、血球計數(shù)板計數(shù)板是一塊特制的厚玻璃片，玻片上有四個槽構成三個平臺，中央平臺又由一短槽隔成兩半，其上各刻有一小方格網。每個方格網共分九個大格，中央的一大格作為計數(shù)用，稱為計數(shù)室。計數(shù)室體積為l×0.1＝0.1mm3。(注意：1ml＝1000mm3)當前43頁，總共55頁。****#####血球計數(shù)板計數(shù)室有兩種刻度1大格=16中格25×16=400小格1大格=25中格16×25=400小格當前44頁，總共55頁。1、稀釋用無菌生理鹽水將待測菌稀釋成適當濃度的菌懸液。2、鏡檢計數(shù)室加樣前，先對計數(shù)板的計數(shù)室進行鏡檢，若有污物，則用自來水沖洗，95%乙醇棉球輕輕擦洗，然后用吸水紙吸干或電吹風吹干。3、加樣取潔凈的血球計數(shù)板一塊，蓋上蓋玻片。將菌懸液搖勻，用無菌滴管吸取少許，沿蓋玻片邊緣滴入一小滴，讓菌液利用液體的表面張力充滿計數(shù)區(qū)，靜置5min。注：取樣時先要搖勻菌液，加樣時計數(shù)室不可有氣泡產生2、操作步驟當前45頁，總共55頁。4、顯微鏡計數(shù)（以16小格×25中格的規(guī)格為例）在高倍下(40X)計數(shù)對兩個計數(shù)室記數(shù)，方法：每個計數(shù)室選5個中格(4個角和中央的一個中格)中的菌體進行計數(shù)，求得每個中方格的平均值，再乘上25即為大方格中的總菌數(shù)，最后換算成1ml菌液中的總菌數(shù)。注：依照“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右“的原則進行計數(shù)計數(shù)時應不時調節(jié)焦距，才能觀察到不同深度的菌體一般樣品稀釋度要求每小格內約有5—10個菌體為宜計數(shù)的結果是兩個計數(shù)室所記菌數(shù)的平均值5、清洗血球計數(shù)板計數(shù)完畢，將血球計數(shù)板在水龍頭下流水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后電吹風吹干，鏡檢確認計數(shù)區(qū)無殘留菌體或其它沉淀。若不干凈，則必須重復洗滌至干凈為止。當前46頁，總共55頁。3、計數(shù)方法所統(tǒng)計的5個中格的總菌數(shù)A，菌液的稀釋倍數(shù)為B，則1ml菌液含有的菌數(shù)為：

1大格子=25中格當前47頁，總共55頁。（二）間接計數(shù)法

——稀釋平板計數(shù)法將待測樣品按比例做一系列稀釋后，將其中的微生物充分分散成單個細胞，取一定稀釋度、一定量的稀釋樣液接種到平板上，使其均勻分布于平板中的培養(yǎng)基內；或是將一定量的稀釋液，與溶化后冷卻至45℃左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，傾入無菌培養(yǎng)皿中，搖勻、靜置待凝。經過培養(yǎng)，由單個微生物生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個菌落代表樣品中的一個微生物個體。統(tǒng)計培養(yǎng)基中的出現(xiàn)的菌落，即可推算出樣品中的活菌數(shù)。當前48頁，總共55頁。能檢測活菌數(shù)和雜菌數(shù)時間長，繁瑣，測定值時常受各種因素影響由于待測樣品往往不宜完全分散成單個細胞，所以，長成一個單菌落也可能來自樣品中的2-3或更多個細胞。因此，平板菌落計數(shù)的結果往往偏低優(yōu)缺點：當前49頁，總共55頁。編號稀釋菌樣吸取菌樣傾注平板恒溫培養(yǎng)計數(shù)1、操作步驟當前50頁，總共55頁。104105106原樣