基因重組的課件資料第1頁/共75頁

一.微生物遺傳體制的概念第一節(jié)微生物的雜交和遺傳體制1．雜交：

基因不同的個體或品種間通過接觸使染色體重新搭配（組合）而產(chǎn)生新個體的過程叫雜交。而在雜交的群體中進行選育就叫雜交育種。第2頁/共75頁

基因重組涉及范供受體關(guān)系整套染色體部分染色體個別或少數(shù)基因細胞融合真菌有性生殖真菌準性生殖細胞暫時溝通細菌雜交F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)R因子轉(zhuǎn)移細胞不接觸轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)化基因重組類別2.微生物遺傳體制第3頁/共75頁

對于高等動，植物而言，他的某些細胞（精原細胞和卵原細胞都是二倍體（2n），通過減數(shù)分裂而產(chǎn)生單倍體的生殖細胞，通過受精作用又成為二倍體細胞，并進一步發(fā)育為雙倍體的個體，這一過程稱為生活史。二、微生物雜交和他們生活史的關(guān)系所謂生活史：第4頁/共75頁（一）高等動植物生活史雙倍體細胞減數(shù)分裂單倍體細胞雙倍體細胞減數(shù)分裂單倍體細胞個體配偶子異核體細胞（暫時存在）雙倍體細胞（結(jié)合子）(二）大腸桿菌k-12生活史單倍體細胞單倍體細胞無性繁殖系異核體細胞（暫時存在）雙倍體細胞減數(shù)分裂單倍體細胞第5頁/共75頁（三）不完全菌生活史單倍體細胞單倍體細胞無性繁殖系異核菌絲體（暫時存在）雙倍體菌絲減數(shù)分裂單倍體細胞無性繁殖系無性繁殖系第6頁/共75頁1．高等動植物以雙倍體為主，細菌以單倍體為主，真菌介于兩者之間，但更接近于細菌；細菌，真菌同高等動，植物生活史的比較：2．高等動植物的雙倍體分化形成二倍體個體，細菌的單倍體分裂而形成無性繁殖系，真菌雖是多細胞的，但他可以由單一體細胞生長成獨立的菌株，它的單倍體，雙倍體或異核體都能形成無性繁殖系；3．就“性”的分化而言，微生物中沒有嚴格的性細胞和體細胞之分（除個別能產(chǎn)生有性孢子的真菌種類之外），而高等動植物中性，體細胞區(qū)分明顯。第7頁/共75頁一.紅色面包霉（NeurosporaCrassa）的生活史和遺傳規(guī)律第二節(jié)真菌的有性生殖1、生活史：第8頁/共75頁nAnaAaAaAAaa2n2nnnnAnAnananAnAnAnAnananana紅色面包霉雜交的遺傳分析(第一次分裂分離)2、紅色面包霉雜交的遺傳分析第9頁/共75頁1)AAAAaaaa2)aaaaAAAA3)AAaaAAaa4)aaAAaaAA5)AAaaaaAA6)aaAAAAaa第一次分裂分離第二次分裂分離為什么會出現(xiàn)第二次分裂分離的子囊呢？如下圖8個子囊孢子排列的六種方式：第10頁/共75頁nAnaAaAa2n2nnnAnanAnAnanaAaanAnanAnananAnA第二次分裂分離第11頁/共75頁

在減數(shù)分裂的第一次核分裂時，如果來自一個親本的二個基因（如圖二個A）趨向一極，而來自另一個親本的二個基因（如圖二個a）趨向另一極這種分裂方式稱為還原分裂（意思是指分裂后還原到雜交之前的二個親本的狀態(tài)）。

如果來自親本的各一個基因一起趨向一極，另外各一個基因（如圖中Aa）趨向另一極，意思是分裂后的二個核中各含有相等的基因這種分裂方式稱為均等分裂。還原分裂：均等分裂：第12頁/共75頁2)很容易觀測到一次減數(shù)分裂所產(chǎn)生的四分體中一對基因的分離現(xiàn)象，從而證明相對性狀的基因在數(shù)目上大致相等的；3)根據(jù)子囊排列的方式推算出某一基因與著絲粒之間的相對距離：

3、以紅色面包霉作為遺傳分析的材料有什么優(yōu)越性1)能直接測定某個基因的存在；某一基因與著絲粒的距離=圖距單位=第二次分裂分離子囊數(shù)×1/2子囊總數(shù)4)利用測定某一基因與著絲粒的距離，從而間接測出基因與基因的距離?！?00%第13頁/共75頁1．酵母菌的生活史：二、酵母菌的雜交及遺傳分析形成成熟子囊4個單倍體的核AAaaAAaaaAaAaA出芽出芽減數(shù)分裂體細胞(2n)出芽核配質(zhì)配第14頁/共75頁

2．酵母菌的遺傳分析四分體

四分體內(nèi)容

類型結(jié)合相AB×ab

排斥相Ab×aBPDABABababAbABaBaBNPDAbAbaBaBABABababTABAbaBabAbABabaB雙基因雜交的四分體類型第15頁/共75頁有連鎖關(guān)系的二個基因之間雜交產(chǎn)生的子囊類型AbAbaBaBAAbbaaBBAbAbaBaBAAbbaaBBABABababAAbbaaBBAAbbaaBBAbABabaBAbABabaB第16頁/共75頁ABab聯(lián)會AaBb第一次核分裂同源染色體分開第二次核分裂ABABababAbaBAbaBABabAAbbABABBBaabbaann2n2nnnnnAB.AB.ab.ab(PD)Ab.Ab.aB.aB(NPD)沒有連鎖關(guān)系的二個基因之間，三種子囊類型出現(xiàn)的比例：雜交型：AB×ab在染色體分離時，二個基因與著絲粒之間都未發(fā)生交換，結(jié)果只會出現(xiàn)PD和NPD兩種類型，并且比例是PD:NPD=1:1第17頁/共75頁ABab聯(lián)會AaBb第一次核分裂同源染色體分開第二次核分裂aBABabAbAbABabaBABabAabbBBAabbAan2n2nnnnAB.aB.Ab.ab(T)Ab.ab.AB.aB(T)nABaBn

當(dāng)二個基因有一個基因在染色體分離時與著絲粒之間發(fā)生交換，而另一個基因未發(fā)生交換，則會出現(xiàn)一種類型的子囊，即T型。第18頁/共75頁如果二個基因同時都與著絲粒發(fā)生交換，根據(jù)同樣的道理就有可能出現(xiàn)三種類型的子囊：PD:T:NPD=1:2:1

基因連鎖

基因不連鎖交換四分體類型和著絲粒的交換四分體類型不交換PD

二個染色體都不交換1PD:1NPD單交換T

一個發(fā)生交換T

雙交換1PD:2T:1NPD二個同時交換1PD:2T:1NPD多交換1PD:4T:1NPD

第19頁/共75頁PD(AbAbaBaB)PD(AbAbaBaB)NPD(abABabAB)AabBAabBAabBabBAbBAabBAa不交換單交換二線雙交換三線雙交換三線雙交換四線雙交換T(AbabABaB)T(abABAbaB)T(AbaBabAB)0%50%0%50%50%100%交換類型染色體圖象重組四分體類型

染色體交換和重組及四分體類型的關(guān)系第20頁/共75頁第三節(jié)、真菌的準性生殖一、準性生殖的概念：

準性生殖是指真菌中，不通過減數(shù)分裂而導(dǎo)致基因重組的一種生殖方式。他的整個過程包括幾個相互聯(lián)系的階段，即：異核體的形成，雜合二倍體的形成，體細胞雜交及染色體單倍化。第21頁/共75頁（一）異核體的形成（二）雜和二倍體的形成1.互養(yǎng)解釋的排除2.單倍重組體和二倍體的排除（三）體細胞重組1.染色體交換2.染色體單倍化二、準性生殖過程第22頁/共75頁三、準性生殖和有性生殖的異同點準性生殖和有性生殖的共同點：

準性生殖和有性生殖有類似的遺傳現(xiàn)象。如：核融合，形成雜合二倍體、隨后染色體再分離、染色體之間進行交換，出現(xiàn)重組體等。由此可見，準性生殖和有性生殖最根本的相同之處就是均能導(dǎo)致基因重組，從而豐富遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)，出現(xiàn)子代多樣性。準性生殖和有性生殖的不同點：1.有性生殖導(dǎo)致產(chǎn)生有性孢子，有性孢子在形態(tài)、生理上與體細胞有一定的區(qū)別，且基因重組一般是發(fā)生在性細胞中；準性生殖的細胞與體細胞無區(qū)別，基因重組是發(fā)生在有絲分裂的體細胞交換中，沒有性過程,沒有性孢子。

2.有性生殖是通過減數(shù)分裂進行基因重組，減數(shù)分裂是一個有規(guī)律的協(xié)調(diào)的過程；準性生殖過程中染色體交換和染色體單倍體化都是不規(guī)律的偶然發(fā)生的過程，且頻率極低。第23頁/共75頁ABCabcABCabcABCabcABCabcABCabcABCabcABCAbcaBCabc體細胞交換模式圖(A)(B)

(A)不發(fā)生交換(B)發(fā)生交換第24頁/共75頁ABCabcEDFedfGHTghtEDFedfGHTghtABCabcABCabcEDFedfGHTGHTghtABCabcEDFedfght

染色體的不分離行為第25頁/共75頁2．異核體可以作為細胞質(zhì)基因測定的工具。四、研究異核體的意義1．異核體在遺傳分析中可以用來測定等位基因和非等位基因；第26頁/共75頁第四節(jié)細菌的接合作用一、細菌基因重組的發(fā)現(xiàn)和證實（一）細菌基因重組的發(fā)現(xiàn)（二）細菌基因重組的證實標記：

以基因發(fā)生突變的特點來標記某菌株的性質(zhì)，這種突變的基因就稱為該菌株的標記（簡單的說突變的基因表型就是標記）。第27頁/共75頁完全培養(yǎng)基A-B+lac-STT1SA+B-lac+SST1T2×1061061062×106基本培養(yǎng)基大腸桿菌k-12菌株的基因重組第28頁/共75頁1.排除遺傳物質(zhì)的滲入非選擇標記：

在某種培養(yǎng)條件下，可能起到排除親本的某些基因標記。雜交個體單倍體的證實：2.排除細胞的互養(yǎng)3.排除回復(fù)突變菌株A菌株B通過濾器圖一種U型管，一臂放菌株A,一臂放菌株B，中間由濾器隔開，未發(fā)現(xiàn)有原養(yǎng)型細胞出現(xiàn)第29頁/共75頁二、致育因子和細菌雜交F因子的基因結(jié)構(gòu)如下：（一）F因子：第一區(qū)段：控制自主復(fù)制的區(qū)段第二區(qū)段：控制細菌間傳遞作用的區(qū)段第三區(qū)段：重組區(qū)段

repincoriVreporiTfinP復(fù)制自主復(fù)制fexIS3rδIS2IS3插入與切除重組區(qū)段ZIDTSGHOFNUCWV轉(zhuǎn)移操縱子傳遞大腸桿菌F質(zhì)粒的基因圖第30頁/共75頁點樣法（—）（—）+A(—）+B(—）+A+B依次點種①②③④一.四種都不長A+B+二.1.3不長，2.4長A-B+三.1.2不長，3.4長，A+B-四.1.2.3不長，4長A-B-

A-B+A+B-第31頁/共75頁第一區(qū)段：控制自主復(fù)制的區(qū)段第二區(qū)段：控制細菌間傳遞作用的區(qū)段第三區(qū)段：重組區(qū)段

repincoriVreporiTfinP復(fù)制自主復(fù)制fexIS3rδIS2IS3插入與切除重組區(qū)段ZIDTSGHOFNUCWV轉(zhuǎn)移操縱子傳遞大腸桿菌F質(zhì)粒的基因圖第32頁/共75頁(二)三種狀態(tài)的E.coli細菌之間的關(guān)系1、F+和F-能雜交，Hfr和F-也能雜交，F(xiàn)-和F-則不能雜交，說明F-不同于F+與Hrf，F(xiàn)+與Hfr有相同的地方；2、從F+細胞群中可以得到Hfr菌株，從Hfr菌株中也可以得到

F+的菌株，而從F-中則不可能得到Hfr和F+菌株，說明F+與

Hrf都含有F因子，而F-沒有；3、F+和F-雜交后，后代轉(zhuǎn)變?yōu)镕+，在雜交過程中出現(xiàn)的重組頻率大約只有10-6；而Hfr與F-和F-雜交后，后代仍然是F-，但重組頻率都高于上種好多倍。這說明F+與Hrf雖然都能導(dǎo)致基因重組，但它們是有區(qū)別的；4、F+細胞經(jīng)吖啶類藥物處理后轉(zhuǎn)變成F-（這種藥物濃度很低，不致于抑制細菌生長）；而Hfr細胞經(jīng)同樣處理后性質(zhì)仍然不變。這說明F+與Hrf雖都含有F因子，但它們在細胞中存在的狀態(tài)不一樣。第33頁/共75頁(三)大腸桿菌雜交的幾種可能

1.F+×F-雜交

2.Hfr×F-雜交

3.F’×F-雜交

利用Hfr×F-的二個菌株結(jié)合，在連續(xù)間斷的不同時間內(nèi)取樣，放在中斷器內(nèi)，以人為機械的方法，中斷Hfr×F-的接合，分別將接合子涂在一系列不同的選擇培養(yǎng)基上，通過在不同的選擇培養(yǎng)基上在不同時間內(nèi)出現(xiàn)的重組子，可以將某一基因的位置確定下來。這一方法稱為中斷雜交。利用中斷雜交可以進行基因定位。三、中斷雜交第34頁/共75頁F-F+F自然丟失自主復(fù)制F+F重組脫離FHfrFFF’細菌染色體DNA第35頁/共75頁F+F-性纖毛F+×F-F質(zhì)粒第36頁/共75頁F++F-F+F-5’F+F-5’F+F-性傘毛F+×F-的接合作用第37頁/共75頁123456123456123456123456123456metstrserhisgallacproleuthrmetstrserhisgallacproleuthrmetstrserhisgalleuthrprolac123456metstrserhisgalthr123456lacproleu（A）（B）（C）（D）（E）第38頁/共75頁

一、轉(zhuǎn)化的定義：（一）體內(nèi)轉(zhuǎn)化實驗第五節(jié)細菌的轉(zhuǎn)化

把一個細胞的遺傳物質(zhì)抽提出來轉(zhuǎn)移到另一個受體細胞中，使其能在受體細胞中表達的過程。二．轉(zhuǎn)化現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)SⅢ（活）小白鼠死亡RⅡ（活）小白鼠存活SⅢ（加熱）小白鼠存活RⅡ（活）+SⅢ（加熱）小白鼠死亡SⅢ（活）

注射

注射

注射

注射分離第39頁/共75頁（二）體外實驗蛋白質(zhì)+RⅡ→RⅡ

RNA+RⅡ→RⅡ

多糖+RⅡ→RⅡ

其它+RⅡ→RⅡ

DAN+RⅡ→RⅡ（大量）+SⅢ

（少量）SⅢ細胞抽提物

分離第40頁/共75頁理化分析結(jié)果：

1．在理論上，它證實了在生物（包括微生物）中，DNA是決定遺傳的主要物質(zhì)；（三）細菌轉(zhuǎn)化現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)的意義1．所含元素在成份和重量上與DNA相似；2．只有DNA酶才能降解這種物質(zhì)；3．電泳的位置與DNA相同，對紫外線的吸收峰與DNA一致。2．運用轉(zhuǎn)化作用可以深入研究遺傳物質(zhì)的本質(zhì)，作用方式以及結(jié)構(gòu)與功能等問題之間的關(guān)系，從而更好地去認識基因的物質(zhì)基礎(chǔ)。3．在育種實踐上，為定向培育提供了一條新的育種途徑。第41頁/共75頁三、轉(zhuǎn)化過程（一）感受態(tài)的出現(xiàn)感受態(tài)：

細菌能夠從周圍環(huán)境中吸取DNA分子，使之不被DNA酶破壞，能接受轉(zhuǎn)化因子的這一時刻，細菌出現(xiàn)的一種生理狀態(tài)。第42頁/共75頁

這種假設(shè)認為細菌表面的細胞壁是阻礙轉(zhuǎn)化因子進入細胞的障礙，在某些情況下，當(dāng)細菌局部失去了細胞壁，轉(zhuǎn)化因子能通過膜而進入細菌。關(guān)于感受態(tài)出現(xiàn)的假說：1.局部原生質(zhì)化假說：

這一假說認為感受態(tài)細胞的特征是細胞表面出現(xiàn)DNA的結(jié)合位點，這種結(jié)合位點能吸附游離的DNA，實驗證明它只能與雙鏈DNA結(jié)合不能與單鏈DNA結(jié)合，并且證明這種結(jié)合能力是受一種酶的作用。2．酶受體假說：第43頁/共75頁1051041031022040608010012014010010細菌的生長量培養(yǎng)時間（min)

肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化鏈霉素抗性的感受態(tài)曲線虛線表示受體細菌的生長曲線；實線表示每毫升中轉(zhuǎn)化子的變化。第44頁/共75頁（三）轉(zhuǎn)化因子的整合（二）轉(zhuǎn)化因子的結(jié)合與進入1．表面結(jié)合的證實2．轉(zhuǎn)化因子的進入1．整合前轉(zhuǎn)化因子的狀態(tài)第45頁/共75頁2．轉(zhuǎn)化因子整合的過程123456

轉(zhuǎn)化過程第46頁/共75頁1．受體細胞的感受態(tài)，它決定轉(zhuǎn)化因子能否進入細胞；轉(zhuǎn)化效率決定下列三個內(nèi)在因素：2．受體細胞的限制酶系統(tǒng)，它決定轉(zhuǎn)化因子在整合前是否被分解；3．受體和供體的同源性，它決定轉(zhuǎn)化因子的整合。第47頁/共75頁

經(jīng)噬菌體為媒介，把一個細菌的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)到另一個細胞中去表達的過程。

感染細菌后，宿主體內(nèi)很快繁殖，最后使宿主細胞裂解的噬菌體。第六節(jié)細菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)（一）噬菌體的概念

感染細菌后，能與宿主細胞的DNA整合在一起，并以原噬菌體的狀態(tài)存在細胞內(nèi)。一、轉(zhuǎn)導(dǎo)的概念：1．烈性噬菌體：2．溫和噬菌體：第48頁/共75頁

在溶源性細胞中沒有感染力的噬菌體，這種噬菌體是以整合在宿主染色體上的形式存在。1．在遺傳上是穩(wěn)定的；（三）“λ”噬菌體使大腸桿菌形成溶源性細菌的原因

帶有原噬菌體的細菌。（二）溶源性細菌的遺傳特征2．可以自然裂解，但裂解頻率很低，在約只有10-2-10-5，經(jīng)過誘導(dǎo)后（如經(jīng)U.V處理）裂解率可以提高到90%以上；3．對于外來同源噬菌體的感染具有免疫力。3．原噬菌體：4．溶源性細菌：第49頁/共75頁1．“λ”的基因結(jié)構(gòu)及其功能把環(huán)狀“λ”DNA拉成直線可以變成如下圖：左段AWBCDEFZUVGTHMLKJG5’中段b2PP’attIntxisredβγcⅡNnexcⅠcrocⅡOP右段QSRA5’第50頁/共75頁A-F7個基因：形成“λ”頭部蛋白的結(jié)構(gòu)基因；

Z-J11個基因：形成“λ”尾部蛋白的結(jié)構(gòu)基因：int:編碼的酶控制“λ”的整合；xis:編碼剪切酶,int和xit共同作用控制“λ”原噬菌體的切割；att：整合區(qū)，大約15bp；red：它包括redα、redβ、redγ三個部分，它們的功能是促進一般性重組；左段AWBCDEFZUVGTHMLKJG5’中段b2PP’attIntxisredβγcⅡNnexcⅠcrocⅡOP右段QSRA5’第51頁/共75頁N：起促進轉(zhuǎn)錄的作用；ci:產(chǎn)生阻遏蛋白，阻遏“λ”的整個基因駔轉(zhuǎn)錄；rex：產(chǎn)生免疫蛋白；cro：關(guān)閉ci基因，促進裂解作用；o、p：起調(diào)控作用；Q：促進R2轉(zhuǎn)錄子的轉(zhuǎn)錄；s.R:直接與裂解反應(yīng)有關(guān)；m——m/：粘性末端約12bp。左段AWBCDEFZUVGTHMLKJG5’中段b2PP’attIntxisredβγcⅡNnexcⅠcrocⅡOP右段QSRA5’第52頁/共75頁PLOLPRORN左右rexcⅠcro2．產(chǎn)生溶源化的大致過程如下圖：第53頁/共75頁K2(裂解區(qū)段）R1L1L2(重組區(qū)段）L1(免疫區(qū)）AttintxisredcⅢNJLZFIAMM’RSQPOrexcⅠ

crocⅡpreλ第54頁/共75頁

包括局限轉(zhuǎn)導(dǎo)和普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)（完全轉(zhuǎn)導(dǎo)、流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)）兩個類型。

只能使供體性狀的一種或少數(shù)幾種以噬菌體為媒介轉(zhuǎn)移到受體中表達的過程稱為局限轉(zhuǎn)導(dǎo)。二、轉(zhuǎn)導(dǎo)的發(fā)現(xiàn)三、轉(zhuǎn)導(dǎo)的類型（一）局限轉(zhuǎn)導(dǎo)第55頁/共75頁K12菌株溶源細菌裂解液感染不同的缺陷的大腸桿菌，涂選擇平板（-）gal。gal-大腸桿菌形成淺色菌苔加裂解液1．局限轉(zhuǎn)導(dǎo)的發(fā)現(xiàn)和證實第56頁/共75頁2．“λ”

噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)gal基因的過程坎貝爾模型（campbell）解釋局限轉(zhuǎn)導(dǎo)機制galchlDattNRm’mλjatt

biochlA

BP’PB’BP’PB’NRmmAjbiochlABB’PP’NRmmAjbiochlA

細菌染色體attmAj

NRm’λ染色體溶源性細菌染色體galchlDgalchlDPP’第57頁/共75頁attattBP’PB’attBP’轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的形成galbioattBP’galgalmm’mm’NNRm’mAAR第58頁/共75頁4．低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)和高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)：由單重溶源化細菌導(dǎo)致的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用?！唉恕鞭D(zhuǎn)導(dǎo)的gal+基因的頻率大約只有10-6。3．轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致的結(jié)果1）穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)2）不穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)：由雙重溶源化細菌導(dǎo)致的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率占50%。第59頁/共75頁ABC+gal+PP’BP’gal-BB’BP’BP’gal+gal-PB’BP’gal+gal-PB’BP’λgalλ第60頁/共75頁1．普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的機理（二）普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)：

凡是染色體上的各個單基因或是緊密聯(lián)系鎖的兩個基因都有可能被某一種噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用。

普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的機理是由選擇性包裹模型進行解釋。第61頁/共75頁選擇性包裹模型Leu+Leu-Leu+Leu+Leu-Leu+Leu-Leu-第62頁/共75頁1）完全轉(zhuǎn)導(dǎo)：2．普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)果2）流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)：

由轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體導(dǎo)入的片段與寄主染色體發(fā)生交換，整合在寄主染色體上，并和寄主染色體同步復(fù)制，在細胞分裂時，每一個子細胞都獲得有導(dǎo)入的DNA，從而恢復(fù)每一細胞的正常生長。

由