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實驗五聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳分離血清蛋白

(PolyacrylamideGelElectrophoresis,PAGE)1掌握聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳的原理；學習聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳的操作技術；了解血清蛋白的主要成份。一、實驗目的2二、實驗原理

不連續(xù)系統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠電泳中，蛋白樣品通過濃縮膠的濃縮按分子大小排列成層，然后進入分離膠，隨著電泳的不斷進行，不同大小、電荷的蛋白質分子逐漸被分開。3連續(xù)膠電泳

采用相同孔徑的凝膠和相同的緩沖系統(tǒng)（樣品緩沖液、凝膠緩沖液和電極緩沖液），在pH恒定、離子強度相同的條件下進行。優(yōu)點：制膠簡單、快捷緩沖液pH值恒定，可以防止樣品進膠后因pH值改變發(fā)生的凝聚和沉淀緩沖系統(tǒng)組成簡單，來源廣泛缺點：分辨率不高2、連續(xù)膠和不連續(xù)膠電泳5不連續(xù)膠電泳

采用不相同孔徑的凝膠和不同緩沖系統(tǒng)的電泳方式，在電泳分離過程中，由于濃縮膠的堆積作用，可使樣品在濃縮膠和分離膠界面上先濃縮成一窄帶，然后在一定濃度或濃度梯度的凝膠上進行分離。優(yōu)點：分辨率高用于復雜和特殊樣品的分離6不連續(xù)電泳的三種物理效應樣品的濃縮效應凝膠的分子篩效應電荷效應

電泳的過程三種效應同時存在，對蛋白樣品起協(xié)同作用，使樣品各組分按照帶電量、分子質量及形狀按一定的順序分離。不連續(xù)電泳的四種不連續(xù)體系凝膠的不連續(xù)緩沖液成份的不連續(xù)緩沖液pH值的不連續(xù)電壓梯度的不連續(xù)7分離膠：A:C:D:E＝1:2:3:2（V/V）濃縮膠：B:C:D:E＝2:1:5:2（V/V）A:pH8.9Tris/Hcl緩沖液B:pH6.7Tris/Hcl緩沖液C:30%Acr-Bis貯存液D:水E:過硫酸銨灌裝前加入TEMED，混勻取干凈玻璃管，下端封口膜封好（重要）；用注射器加分離膠至管口1-2cm處，封水（沿管壁，動作要慢）；凝固后棄水、吸干；加濃縮膠距管口2-3mm處、封水；凝固后備用。制膠和灌膠9加樣

用微量注射器取樣品液15μl，針頭伸入玻璃管上口，沿壁加在濃縮膠面上，緩慢注入。電泳連接電極，上負下正；濃縮膠：3mA／管，分離膠：4mA／管；待示蹤染料接近凝膠管底部約0.5cm處，切斷電源。剝膠取下凝膠管，用注射器吸取一定量的蒸餾水，將針頭插入膠柱-與管內壁之間，邊注水邊旋轉玻管，直至膠柱與管壁分離，然后用洗耳球輕輕在玻管的一端加壓，使凝膠柱從玻管緩慢滑出，將凝膠柱置于干凈的試管內，用蒸餾水沖洗幾次。10染色

將凝膠柱置于0.05%氨基黑10B溶液中浸染20

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