crispercas基因靶向技術(shù)第1頁/共18頁CRISPR/Cas9System1987年，日本大阪大學(xué)（OsakaUniversity）在對(duì)一種細(xì)菌編碼的堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）基因進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)在這個(gè)基因編碼區(qū)域的附近存在一小段不同尋常的DNA片段，這些片段是由簡(jiǎn)單的重復(fù)序列組成的，而且在片段的兩端還存在一段不太長(zhǎng)的特有的序列，正是這個(gè)特有的序列以后被證明發(fā)揮了DNA的定向識(shí)別功能。2013以后，研究者們?cè)诎ā秙cience》和《naturebiotechnology》等著名雜志上發(fā)表多篇文章介紹CRISPR-Cas系統(tǒng)，并且已成功在人類、小鼠、斑馬魚等物種上實(shí)現(xiàn)精確的基因修飾。第2頁/共18頁CRISPR-Cas主要由兩部分組成：識(shí)別切割Cas（CRISPRassociated）：

存在于CRISPR位點(diǎn)附近，是一種雙鏈DNA核酸酶。

CRISPR-Cas是很多細(xì)菌和大部分古生菌的天然免疫系統(tǒng)。CRISPR（Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats），被稱為規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)，實(shí)際上就是一種基因編輯器，是細(xì)菌用以保護(hù)自身對(duì)抗病毒的一個(gè)系統(tǒng)，也是一種對(duì)付攻擊者的基因武器。后來，研究人員發(fā)現(xiàn)，它似乎是一種精確的萬能基因武器，可以用來刪除、添加、激活或抑制其他生物體的目標(biāo)基因，這些目標(biāo)基因包括人、老鼠、斑馬魚、細(xì)菌、果蠅、酵母、線蟲和農(nóng)作物細(xì)胞內(nèi)的基因，這也意味著基因編輯器是一種可以廣泛使用的生物技術(shù)。第3頁/共18頁CRISPR擔(dān)當(dāng)細(xì)菌的防護(hù)罩

CRISPR簇是一個(gè)廣泛存在于細(xì)菌和古生菌基因組中的特殊DNA重復(fù)序列家族，其序列由一個(gè)前導(dǎo)區(qū)(Leader)、多個(gè)短而高度保守的重復(fù)序列區(qū)(Repeat)和多個(gè)間隔區(qū)(Spacer)組成。前導(dǎo)區(qū)一般位于CRISPR簇上游，是富含AT長(zhǎng)度為300～500bp的區(qū)域，被認(rèn)為可能是CRISPR簇的啟動(dòng)子序列。重復(fù)序列區(qū)長(zhǎng)度為21～48bp，含有回文序列，可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。重復(fù)序列之間被長(zhǎng)度為26～72bp的間隔區(qū)隔開。Spacer區(qū)域由俘獲的外源DNA組成，類似免疫記憶，當(dāng)含有同樣序列的外源DNA入侵時(shí)，可被細(xì)菌機(jī)體識(shí)別，并進(jìn)行剪切使之表達(dá)沉默，達(dá)到保護(hù)自身安全的目的。

第4頁/共18頁通過對(duì)CRISPR簇的側(cè)翼序列分析發(fā)現(xiàn)，在其附近存在一個(gè)多態(tài)性家族基因。該家族編碼的蛋白質(zhì)均含有可與核酸發(fā)生作用的功能域(具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性)，并且與CRISPR區(qū)域共同發(fā)揮作用，因此被命名為CRISPR關(guān)聯(lián)基因(CRISPRassociated)，縮寫為Cas。目前發(fā)現(xiàn)的Cas包括Cas1～Cas10等多種類型。Cas基因與CRISPR共同進(jìn)化，共同構(gòu)成一個(gè)高度保守的系統(tǒng)。

第5頁/共18頁CRISPR的工作原理

當(dāng)細(xì)菌抵御噬菌體等外源DNA入侵時(shí)，在前導(dǎo)區(qū)的調(diào)控下，CRISPR被轉(zhuǎn)錄為長(zhǎng)的RNA前體(PreRISPRRNA，pre-crRNA)，然后加工成一系列短的含有保守重復(fù)序列和間隔區(qū)的成熟crRNA，最終識(shí)別并結(jié)合到與其互補(bǔ)的外源DNA序列上發(fā)揮剪切作用。第6頁/共18頁第7頁/共18頁CRISPR-Cas系統(tǒng)賦予原核細(xì)胞針對(duì)外源DNA特異性免疫，而這種特異性是由間隔序列（spacer）決定的。如果改造成我們的目的基因，就可以定向的進(jìn)行基因修飾第8頁/共18頁目前發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cas系統(tǒng)有三種不同類型即I型、II型和III型，它們存在于大約40%已測(cè)序的真細(xì)菌和90%已測(cè)序的古細(xì)菌中。其中II型的組成較為簡(jiǎn)單，以Cas9蛋白以及向?qū)NA(gRNA)為核心組成，也是目前研究中最深入的類型。第9頁/共18頁在II型系統(tǒng)中pre-crRNA的加工由Cas家族中的Cas9單獨(dú)參與。Cas9含有RuvC和HNH2個(gè)獨(dú)特的活性位點(diǎn)，在crRNA成熟和雙鏈DNA剪切中發(fā)揮作用。此外，pre-crRNA轉(zhuǎn)錄的同時(shí)，與其重復(fù)序列互補(bǔ)的反式激活crRNA(Trans-activatingcrRNA，tracrRNA)也轉(zhuǎn)錄出來，并且激發(fā)Cas9和雙鏈RNA特異性RNaseIII核酸酶對(duì)pre-crRNA進(jìn)行加工。加工成熟后，crRNA、tracrRNA和Cas9組成復(fù)合體，識(shí)別并結(jié)合于crRNA互補(bǔ)的序列，然后解開DNA雙鏈，形成R-loop，使crRNA與互補(bǔ)鏈雜交，另一條鏈保持游離的單鏈狀態(tài)，然后由Cas9中的HNH活性位點(diǎn)剪切crRNA的互補(bǔ)DNA鏈，RuvC活性位點(diǎn)剪切非互補(bǔ)鏈，最終引入DNA雙鏈斷裂(DSB)。第10頁/共18頁CRISPR／Cas9的剪切位點(diǎn)位于crRNA互補(bǔ)序列下游鄰近的PAM區(qū)(ProtospacerAdjacentMotif)的5‘-GG-N18-NGG-3’特征區(qū)域中的NGG位點(diǎn)，而這種特征的序列在每128bp的隨機(jī)DNA序列中就重復(fù)出現(xiàn)一次。研究結(jié)果表明，Cas9還可以剪切線性和超螺旋的質(zhì)粒，其剪切效率堪比限制性內(nèi)切酶。由于crRNA參與并且起到精確導(dǎo)向的作用，所以CRISPR／Cas9打靶系統(tǒng)也被稱為RNA導(dǎo)向(RNAguided)打靶系統(tǒng)。

第11頁/共18頁LimitationsoftheCRISPRimethodFirst,therequirementforanNGGPAMsequenceforS.pyogenes

Cas9limitstheavailabilityoftargetsitesinthegenome.AndrecentstudieshavesuggestedthattheS.pyogenesCas9proteincouldpartiallyrecognizeanNAGPAM,whichmightincreaseboththenumberoftargeta-blegenomesitesandthatofpotentialoff-targetsites.Second,thetargetingspecificityisdeterminedonlybya14-nt-longregion(the12ntofthesgRNAandthe2ntofthePAM),whichmightconferoff-targeteffectsinorganismswithlargegenomes.Thetheoreticalsequencelengthforuniquetargetingwitha14-ntrecognitionsequenceis268Mb(414).第12頁/共18頁P(yáng)rogrammableRNArecognitionandcleavagebyCRISPR/Cas9.一種用來編輯基因組中DNA指令的強(qiáng)大科學(xué)工具現(xiàn)在也可以應(yīng)用于RNA。來自加州大學(xué)伯克利分校和勞倫斯伯克利國家實(shí)驗(yàn)室的一個(gè)研究人員小組，證實(shí)借助于一種方法可以編程CRISPR/Cas9蛋白復(fù)合物在序列特異性的靶位點(diǎn)識(shí)別并切割RNA。這一研究發(fā)現(xiàn)有可能改變RNA功能研究的模式，為檢測(cè)、分析和操控RNA轉(zhuǎn)錄物鋪平了道路。相關(guān)論文發(fā)表在9月28日的《Nature》雜志上。第13頁/共18頁論文核心：就像可以利用Cas9以一種序列特異性方式來切割或結(jié)合DNA一樣，RCas9可以一種序列特異性方式切割或結(jié)合RNA。

Cas9之所以可能具有基因組編輯能力是因?yàn)镻AM的存在，PAM標(biāo)記出了切割的位點(diǎn)，并激活了Cas9酶的切割活性。在這項(xiàng)最新的研究中，Doudna、Mitchell和合作者們證實(shí)，以一種相似的方式PAMmers還可以促進(jìn)對(duì)靶ssRNA的位點(diǎn)特異性內(nèi)切核苷酸切割第14頁/共18頁盡管RNA干擾已被證實(shí)可用于操控某些生物體內(nèi)的基因調(diào)控，我們?nèi)员е鴱?qiáng)烈的興趣開發(fā)出了RCas9這一基于核酸的RNA識(shí)別系統(tǒng)?，F(xiàn)在我們清楚了RCas9的RNA識(shí)別分子基礎(chǔ)，就只需要設(shè)計(jì)并合成出一條匹配的導(dǎo)向RNA和互補(bǔ)PAMmer?！钡?5頁/共18頁RNA-directedg