動(dòng)物基因組學(xué)基礎(chǔ)第1頁/共47頁2

（二）遺傳標(biāo)記概念的發(fā)展

□形態(tài)學(xué)標(biāo)記

能用肉眼觀察和識(shí)別的外部性狀。例如，動(dòng)物的毛色、角形、耳型、體型、外貌等。此法簡單直觀，但標(biāo)記數(shù)目少、多態(tài)性低、易受環(huán)境影響。

□細(xì)胞遺傳標(biāo)記

主要是指染色體核型（染色體的數(shù)目、大小、隨體、著絲粒位置、核仁組織區(qū)等）、帶型和數(shù)量的變異。此法能反映出染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的多態(tài)性，但由于這些變異往往帶來有害的表型效應(yīng)，生物難以忍受。第2頁/共47頁3

□免疫遺傳標(biāo)記

以動(dòng)物的免疫學(xué)特征為標(biāo)記，主要是紅細(xì)胞抗原多態(tài)性和白細(xì)胞抗原多態(tài)性。

·紅細(xì)胞抗原多態(tài)性——血型，以細(xì)胞表面的抗原而定

·白細(xì)胞抗原多態(tài)性——主要組織兼容性復(fù)合體（MHC），以白細(xì)胞表面的抗原而定?！跎z傳標(biāo)記（蛋白質(zhì)多態(tài)性標(biāo)記）

同一種動(dòng)物中，具有相同功能的蛋白質(zhì)存在兩種以上的變異體，有些可以用電泳方法區(qū)分其中的差異。第3頁/共47頁4

□

分子遺傳標(biāo)記

○分子遺傳標(biāo)記是以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，又稱DNA分子標(biāo)記或多態(tài)性DNA標(biāo)記。

○自20世紀(jì)70年代以來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，相繼建立了多種分子遺傳標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)，例如，RFLP、VNTR、RAPD、AFLP、SNP等。

○分子遺傳標(biāo)記的特點(diǎn)：遺傳多態(tài)性高；檢測(cè)方法簡單快捷；遺傳共顯性，能分離出等位基因的三種基因型。第4頁/共47頁5

二、分子遺傳標(biāo)記

（一）限制性片段長度多態(tài)性（restictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）○RFLPRFLP是1980年建立的第一代分子遺傳標(biāo)記。原理：用限制性內(nèi)切酶切割不同個(gè)體的DNA時(shí)，如果存在酶切位點(diǎn)的變化，就會(huì)產(chǎn)生長度不同的DNA片段，電泳后用克隆探針檢測(cè)時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)泳動(dòng)行為的改變。

基本過程：取得DNA樣本——酶切——電泳——轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上——DNA探針雜交——放射自顯影第5頁/共47頁6圖7-1Southern雜交過程第6頁/共47頁7圖7-2RFLP檢測(cè)第7頁/共47頁8

○聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction,PCR）

PCR是1985年建立的一種體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法。

原理：在反應(yīng)溫度為90—95℃時(shí)，DNA變性成為單鏈；反應(yīng)溫度降至45—65℃時(shí)，兩種引物與兩條單鏈DNA退火而配對(duì)結(jié)合；反應(yīng)溫度升至72℃左右時(shí)，在TaqDNA聚合酶作用下，引物以單鏈DNA為模板逐步延伸成新的單鏈?！白冃浴嘶稹由臁边@一循環(huán)完成后，DNA復(fù)制了一次，由一個(gè)DNA分子成為兩個(gè)DNA分子。第8頁/共47頁9圖7-3DNA

擴(kuò)增原理第9頁/共47頁10

○PCR—RFLP

如果已知多態(tài)性位點(diǎn)周圍的DNA序列，則可用PCR快速而簡單地進(jìn)行RFLP分析。首先根據(jù)多態(tài)位點(diǎn)兩側(cè)序列設(shè)計(jì)和合成引物；以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；用相應(yīng)的內(nèi)切酶進(jìn)行消化；再進(jìn)行電泳，分析PCR區(qū)帶判斷多態(tài)性。

第10頁/共47頁11圖7-4PCR—RFLP第11頁/共47頁12

（二）串聯(lián)重復(fù)序列標(biāo)記（tandemrepeatedsequence,TRS）

○真核基因組序列

單一序列

短片段重復(fù)序列（正向重復(fù)、反向重復(fù)、回文序列）

長片段重復(fù)序列（輕度重復(fù)、中度重復(fù)、高度重復(fù)）

第12頁/共47頁13

高度重復(fù)序列

衛(wèi)星DNA（satelliteDNA）序列中G-C含量約30%，遠(yuǎn)低于基因組中主體DNA（G-C含量約42%）。將DNA切成片段進(jìn)行氯化銫密度梯度離心時(shí)，由于富含A-T浮力密度小，形成一條窄帶在主體DNA外面，故稱衛(wèi)星DNA。

小衛(wèi)星DNA（minisatelliteDNA）

微衛(wèi)星DNA（microsatelliteDNA）第13頁/共47頁14圖7-6衛(wèi)星DNA第14頁/共47頁15

○小衛(wèi)星標(biāo)記

小衛(wèi)星DNA是一種可變數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)（variblenumberoftandemrepeats,VNTR），在不同個(gè)體和基因組的不同位點(diǎn)上數(shù)目都不同。

用內(nèi)切酶把總DNA切成不同長度的片段（VNTR上沒有酶切位點(diǎn)），再以VNTR中的特殊序列為探針進(jìn)行Southern雜交，由于不同個(gè)體的這種串聯(lián)重復(fù)的數(shù)目及位置不同，所以VNTR的Southern雜交譜帶具有高度的個(gè)體特異性，故又稱其為DNA指紋（DNAfingerprints）。第15頁/共47頁16

○微衛(wèi)星標(biāo)記

微衛(wèi)星DNA又稱短串聯(lián)重復(fù)序列（STR），重復(fù)單位的核心序列為2—6bp。

以微衛(wèi)星DNA兩側(cè)特異性序列設(shè)計(jì)探針，用PCR技術(shù)擴(kuò)增微衛(wèi)星片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，不同個(gè)體因核心序列重復(fù)次數(shù)不同而產(chǎn)生DNA多態(tài)性。第16頁/共47頁17真核生物基因組序列第17頁/共47頁18一個(gè)家系的微衛(wèi)星PCR檢測(cè)結(jié)果第18頁/共47頁19

（三）單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（singlenucleotidepolymorphism,SNP）

SNP與RFLP、STR等標(biāo)記不同之處在于不以“長度”差別為檢測(cè)手段，而是直接以序列的變異作為標(biāo)記。

基因組DNA某一特定的核苷酸位置上，可能發(fā)生單個(gè)堿基的變化，如轉(zhuǎn)換、顛換等，使得群體中基因組的某些位點(diǎn)上存在差異。

SNP就是指基因組內(nèi)特定的核苷酸位置上存在兩種以上不同的核苷酸，其中最少一種在群體中的出現(xiàn)頻率不少于1%（低于1%則視為突變）。

第19頁/共47頁20

SNP是出現(xiàn)頻率最高的標(biāo)記，人類基因組中平均每1000bp中就有1個(gè)SNP，總數(shù)可達(dá)300萬個(gè)。位于基因表達(dá)序列內(nèi)的SNP可能會(huì)影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平，對(duì)分析基因與性狀的關(guān)系有重要意義。

SNP是單堿基突變，任何用于單堿基突變的技術(shù)都可用于SNP檢測(cè)，如RFLP、DNA序列分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）等。最先進(jìn)的是微數(shù)列矩陣DNA芯片（DNAchip）技術(shù)。

第20頁/共47頁21

三、分子遺傳標(biāo)記的應(yīng)用

○個(gè)體及親緣關(guān)系的鑒定DNA指紋○遺傳資源的評(píng)估、監(jiān)測(cè)、保護(hù)和利用○基因定位和遺傳圖譜的構(gòu)建○標(biāo)記輔助選擇第21頁/共47頁22

第二節(jié)

基因組作圖一、基本概念

○基因組作圖主要分兩個(gè)范疇：遺傳作圖（geneticsmapping）和物理作圖（physicalmapping）。

○作圖需要界標(biāo)（landmark）或遺傳標(biāo)記（geneticsmarker）。常用的遺傳標(biāo)記（血型、蛋白質(zhì)多態(tài)型、等位基因、特定的DNA序列等）在早期構(gòu)建遺傳圖時(shí)常用作制圖的界標(biāo)。現(xiàn)在主要采用以下的界標(biāo)：限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）微衛(wèi)星DNA多態(tài)性界標(biāo)單核苷酸多態(tài)性（SNP）界標(biāo)非多態(tài)的短單一序列作為界標(biāo)第22頁/共47頁23

二、遺傳圖

（一）基本概念

應(yīng)用遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建能顯示基因以及其它序列特征在基因組上位置的圖。

方法是以多態(tài)的遺傳標(biāo)記作為界標(biāo)，計(jì)算細(xì)胞減數(shù)分裂過程中遺傳標(biāo)記之間發(fā)生重組的頻率，來確定兩個(gè)遺傳標(biāo)記在染色體上的相對(duì)位置。

遺傳標(biāo)記之間的相對(duì)距離即圖距以厘摩（cM，厘摩爾根，centi-Morgan）為單位。當(dāng)兩個(gè)遺傳標(biāo)記之間的重組值為1%時(shí)，圖距即為1cM。第23頁/共47頁24現(xiàn)代遺傳圖的概念是于1980年提出的，就是將單純的表型多態(tài)性界標(biāo)改變?yōu)橐訢NA序列的多態(tài)作為作圖界標(biāo)。

各種遺傳界標(biāo)可在國際互聯(lián)網(wǎng)上可以查閱（）。

當(dāng)用DNA序列多態(tài)作為界標(biāo)的遺傳圖時(shí)，一但確定該DNA界標(biāo)與某一基因的具體位置，便可分離克隆這個(gè)基因。

人類第一張以RFLP為界標(biāo)的遺傳圖發(fā)表于1987年。第24頁/共47頁25

（二）遺傳圖的局限性

分辨率有限

高等真核生物子代數(shù)量有限，只有少數(shù)的減數(shù)分裂事件可供研究，連鎖分析的分辨率受很大限制

人類基因組測(cè)序要求每100kb有一個(gè)標(biāo)記，1996年發(fā)表的人類遺傳圖達(dá)到每0.6Mb一個(gè)標(biāo)記（1Mb=1000kb）

精確度較低

假設(shè)交換是隨機(jī)發(fā)生的，但由于交換熱點(diǎn)的存在使某一區(qū)段的交換頻率遠(yuǎn)高于其它區(qū)段，無法繪制精確的遺傳圖。

第25頁/共47頁26

三、物理圖（一）基本概念

應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)來直接分析DNA分子，從而構(gòu)建能顯示包括基因在內(nèi)的序列特征的位置圖。

以特定的DNA序列為界標(biāo)直接排列在基因組DNA分子上，這些特定的DNA序列可以是多態(tài)的（如RFLP），但主要是非多態(tài)的（如STS、STR、EST）和特定的基因序列等。

物理圖中界標(biāo)之間的距離單位依作圖方法而定，輻射育種作圖單位為厘鐳（cR）;限制性作圖單位元以物理長度，即堿基對(duì)數(shù)目（bp、kb）來表示。第26頁/共47頁27

（二）作圖的基本方法

1．限制性作圖——將限制性酶切位點(diǎn)標(biāo)定在DNA分子的相對(duì)位置上。

限制性內(nèi)切酶有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型，Ⅰ型、Ⅲ型酶位點(diǎn)特殊性不強(qiáng)，Ⅱ型專一性很強(qiáng)。

6bp識(shí)別序列的限制性內(nèi)切酶適用于50kb以下的DNA分子作圖。

限制性作圖方法是：比較一個(gè)DNA分子被兩種酶切割產(chǎn)生的兩套片段。第27頁/共47頁28圖7-16限制性內(nèi)切酶第28頁/共47頁29

3．序列標(biāo)記位點(diǎn)（sequencetaggedsite,STS）作圖——通過PCR或分子雜交將小段DNA順序定位在基因組的DNA區(qū)段中。是目前用于構(gòu)建最為詳盡的大基因組物理圖的主流技術(shù)?！餝TS作圖原理

STS是一段短的DNA序列（100—500）bp，每個(gè)基因組只有一個(gè)拷貝。

當(dāng)兩個(gè)片段含有同一STS時(shí)，可確認(rèn)這兩個(gè)片段重疊。

兩個(gè)不同的STS出現(xiàn)在同一片段的機(jī)會(huì)取決于它們?cè)诨蚪M中的位置，彼此接近，同時(shí)出現(xiàn)在同一片段的機(jī)會(huì)就大，反之則小。

兩個(gè)標(biāo)記間的圖距根據(jù)分離頻率來計(jì)算。第29頁/共47頁30○STS的種類

⑴表達(dá)序列標(biāo)記（expressedsequencetag,EST），是從cDNA克隆中獲得的短序列。EST是獲得基因序列的簡捷方法。

⑵簡單序列長度多態(tài)性（SSLP，小衛(wèi)星和微衛(wèi)星）。

⑶隨機(jī)基因組序列，從克隆的基因組DNA中隨機(jī)測(cè)序獲得。第30頁/共47頁31

第三節(jié)

基因定位方法

動(dòng)物有幾十條染色體，有幾萬個(gè)基因，平均每條染色體有上千個(gè)基因。

確定基因在哪一條染色體的哪一個(gè)座位上就是基因定位。 將定位的基因標(biāo)注在染色體上就可得到基因圖（genemap）

基因定位與基因組作圖和基因克隆關(guān)系密切：基因定位后可以作為一個(gè)界標(biāo)；確定基因的位置后就可按圖去分離克隆基因不同生物的基因定位方法不完全相同?；蚨ㄎ坏姆椒S著遺傳學(xué)的發(fā)展而進(jìn)步。第31頁/共47頁32

一、質(zhì)量性狀的基因定位

質(zhì)量性狀——從表型上可以明顯區(qū)分為不同類型的性狀。（一）家系分析定位法

性連鎖分析是最常用的方法。哺乳動(dòng)物中只出現(xiàn)在雄性的性狀，控制該性狀的基因在Y染色體上。性狀出現(xiàn)隔代交叉遺傳、且雄性出現(xiàn)比例高于雌性，則控制該性狀的基因在Y染色體上。（二）遺傳重組值定位法

摩爾根提出的方法，根據(jù)基因間的重組值與遺傳距離成正比的原理，采用兩點(diǎn)測(cè)交和三點(diǎn)測(cè)交的方法進(jìn)行基因定位。第32頁/共47頁33

（三）體細(xì)胞雜交定位法

不同物種細(xì)胞融合后，雜種細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)排除某一親本染色體的現(xiàn)象，在人鼠雜種細(xì)胞常專一性地排除人的染色體。可以制備含一條（或少數(shù)幾條）人染色體的雜種細(xì)胞?！鸲ㄎ粶y(cè)驗(yàn)法

鑒別雜種細(xì)胞中保留了哪些人染色體，測(cè)定雜種細(xì)胞產(chǎn)生了哪些基因產(chǎn)物，經(jīng)分析可將基因定位在哪一條染色體上。第33頁/共47頁34

（四）原位雜交定位

將待定位基因的特定DNA序列或該基因轉(zhuǎn)錄的RNA作為探針，在標(biāo)記了放射性同位素或非放射性化學(xué)物質(zhì)后，與變性后的染色體DNA雜交，該探針就會(huì)同染色體DNA與其互補(bǔ)的序列結(jié)合成為雙鏈，通過放射自顯影或顯色技術(shù)，就可確定探針（即待定基因）在染色體上的位置。第34頁/共47頁35

二、數(shù)量性狀的基因定位

○數(shù)量性狀——由微效多基因控制的呈連續(xù)變異的性狀。由于每個(gè)基因效應(yīng)值都較小，無法闡明單個(gè)基因的行為和效應(yīng)，只能當(dāng)作一個(gè)整體來分析。同時(shí)，對(duì)控制數(shù)量性狀的基因數(shù)目不能準(zhǔn)確估計(jì)，不能用提供基因的實(shí)際位置和功能上的信息。

隨著分子數(shù)量遺傳學(xué)的發(fā)展，極大地深化了數(shù)量遺傳學(xué)的理倫，提供了在DNA水平研究數(shù)量性狀的先進(jìn)技術(shù)。第35頁/共47頁36

○主效基因——對(duì)某一數(shù)量性狀具有很大的效應(yīng)的等位基因。由于自發(fā)或誘發(fā)突變引起明顯的形態(tài)學(xué)上的變異。如豬的氟烷基因、牛的雙肌基因等?！饠?shù)量性狀基因位點(diǎn)（QTL）

具有相同或相關(guān)功能的基因往往分布在某一染色體區(qū)域內(nèi)，從而形成基因群?？刂仆恍誀畹奈⑿Щ蚩赡艽嬖谟谟邢薜膸讉€(gè)基因群內(nèi)，而一基因群占據(jù)染色體的一定區(qū)域，稱作數(shù)量性狀基因座（quantitativetraitlocus,QTL）

第36頁/共47頁37

一些QTL可以對(duì)數(shù)量性狀有較大的影響（對(duì)數(shù)量性狀的影響超過表型值方差的5%），因而具有選擇價(jià)值一個(gè)數(shù)量性狀往往受多個(gè)QTL的影響，這些QTL分布在基因組的不同位置上。利用特定的遺傳標(biāo)記可以確定影響某一性狀的QTL在染色體上的數(shù)目、位置及其遺傳效應(yīng)，這就是QTL作圖或稱QTL定位

QTL作圖原理：利用特定遺傳分離群體中的遺傳標(biāo)記及相應(yīng)的數(shù)量性狀觀察值，分析遺傳標(biāo)記與性狀之間的連鎖關(guān)系。如果證明遺傳標(biāo)記與性狀連鎖，則可認(rèn)定標(biāo)記附近存在一個(gè)或幾個(gè)QTL第37頁/共47頁38

QTL作圖步驟：

⑴構(gòu)建作圖群體——該群體待測(cè)的數(shù)量性狀存在廣泛變異，如F2群體⑵選用合適的遺傳標(biāo)記——須具備4個(gè)特征：數(shù)量豐富，多態(tài)性好，中性，共顯性。如RFLP、AFLP、RAPD、VNTR、SSR等⑶測(cè)定標(biāo)記的基因型，制作標(biāo)記的遺傳圖譜

——應(yīng)含有P1，P2和雜合型三種帶型（即三種基因型）。⑷測(cè)量數(shù)量性狀——測(cè)定遺傳標(biāo)記時(shí)，測(cè)定其數(shù)量性狀值⑸統(tǒng)計(jì)分析——單標(biāo)記分析、雙分子標(biāo)記分析、多分子標(biāo)記分析。第38頁/共47頁39

定位QTL主要有兩種方法：

基因組掃描——利用遺傳上差異較大的品種進(jìn)行雜交，跟蹤性狀和染色體上的標(biāo)記在多世代家系中的分離情況。

候選基因法——不需特定品種的雜交，只要發(fā)現(xiàn)一個(gè)候選基因位點(diǎn)上存在多態(tài)性，便可直接在商業(yè)品系中研究該多態(tài)性與目標(biāo)性狀之間的相關(guān)性。第39頁/共47頁40

QTL的性質(zhì)

⑴QTL可能是一個(gè)基因，也可能是幾個(gè)基因；⑵數(shù)量性狀受為數(shù)不多、效應(yīng)不等的幾個(gè)QTL影響。少數(shù)位點(diǎn)對(duì)性狀變異貢獻(xiàn)很大⑶由于不同群體的遺傳背景不同，根據(jù)不同群體確定的QTL會(huì)有差異⑷統(tǒng)計(jì)分析確定的QTL的位置并非物理上的位置第40頁/共47頁41

QTL的應(yīng)用

⑴由QTL得到的遺傳圖可進(jìn)一步換算成物理圖，對(duì)QTL進(jìn)行克隆和序列分析，研究控制數(shù)量性狀的基因結(jié)構(gòu)和功能。⑵在育種上進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，利用標(biāo)記與性狀的連鎖提早進(jìn)行識(shí)別和選擇。⑶利用標(biāo)記與性狀的連鎖分析，可以提供與雜種優(yōu)勢(shì)有關(guān)的信息，鑒定與優(yōu)勢(shì)有關(guān)的位點(diǎn)，確定親本在QTL上的差異，可能預(yù)測(cè)雜種優(yōu)勢(shì)。第41頁/共47頁42

第四節(jié)

動(dòng)物基因組學(xué)一、基因組研究的新學(xué)科

基因組學(xué)（genomics）——研究基因組結(jié)構(gòu)與功能的分支學(xué)科，又分為結(jié)構(gòu)基因組學(xué)和功能基因組學(xué)。

轉(zhuǎn)錄物組學(xué)（transcriptomics）——研究某一時(shí)刻某一細(xì)胞里基因組產(chǎn)生的全部轉(zhuǎn)錄物的種類、結(jié)構(gòu)和功能。

蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）——

研究細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的組成及其活動(dòng)規(guī)律的學(xué)科。

表型組學(xué)（phenomics）——研究生物體整個(gè)表型形成的機(jī)制。第42頁/共47頁43

二、人類基因組計(jì)劃

○美國于1990年由能源部和國立衛(wèi)生研究院起動(dòng)了預(yù)算耗時(shí)15年、經(jīng)費(fèi)30億美元的人類基因組計(jì)劃○2001年2月15日，由中、美、英、法、德、日等6國科學(xué)家組成的“人類基因