化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析法檢測(cè)梅毒螺旋體抗體西北大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)第1頁(yè)/共42頁(yè)西北大學(xué)Contents1.背景介紹3.全文總結(jié)2.實(shí)驗(yàn)部分第2頁(yè)/共42頁(yè)梅毒

●

梅毒螺旋體

●嚴(yán)重性傳播疾病

●發(fā)病率不斷上升

2010年4月國(guó)家衛(wèi)生部全國(guó)法定傳染病疫情報(bào)告：全國(guó)乙類法定傳染病發(fā)病第３位梅毒檢測(cè)：●孕前檢查

●供血者血液常規(guī)篩選檢查西北大學(xué)第3頁(yè)/共42頁(yè)醫(yī)院常用梅毒螺旋體免疫學(xué)檢測(cè)方法快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)（RPR）和甲苯胺紅試驗(yàn)(TRUST)初篩假陽(yáng)性高判斷主觀梅毒螺旋體血球凝集試驗(yàn)（TPHA）和梅毒螺旋體明膠凝集試驗(yàn)（TPPA）

確認(rèn)判斷主觀操作繁瑣要求嚴(yán)格梅毒ELISA實(shí)驗(yàn)靈敏度有待進(jìn)一步提高

西北大學(xué)第4頁(yè)/共42頁(yè)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)免疫分析系統(tǒng)化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)（抗原、抗體，免疫反應(yīng)）★免疫分析高特異性及化學(xué)發(fā)光高靈敏度于一體（酶的化學(xué)發(fā)光底物或氧化劑）西北大學(xué)梅毒螺旋體抗體化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)靈敏度極高自動(dòng)化第5頁(yè)/共42頁(yè)第6頁(yè)/共42頁(yè)第7頁(yè)/共42頁(yè)聚乙烯酶標(biāo)板●板表面包被面積有限●反應(yīng)空間有限●靈敏度受限化學(xué)發(fā)光固相載體的選擇磁性微?！癖缺砻娣e大●分散性好●易分離●靈敏度更高西北大學(xué)第8頁(yè)/共42頁(yè)金磁微粒化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法GoldMag-AS微米金磁微粒1.生物分子固定化容量大

2.超順磁性，易分離

西北大學(xué)第9頁(yè)/共42頁(yè)包被反應(yīng)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)原理西北大學(xué)第10頁(yè)/共42頁(yè)第一部分方法的優(yōu)化1HRP標(biāo)記抗原稀釋液的確定2包被抗原最佳用量及酶標(biāo)抗原最佳工作濃度的確定3樣本稀釋液的確定4保護(hù)劑的選擇西北大學(xué)第11頁(yè)/共42頁(yè)HRP標(biāo)記抗原稀釋液的確定aPBST+20%小牛血清bPBST+0.1%BSAcPBST+0.5%BSAdPBST+1%BSAePBST+1.5%BSA降低非特異性吸附：

加入非特異性蛋白與表面活性劑陰性樣本的發(fā)光值西北大學(xué)第12頁(yè)/共42頁(yè)包被抗原和酶標(biāo)抗原最佳工作濃度的確定

抗原包

被量(ng/孔)酶標(biāo)抗原稀釋度

701402102803501:2000PN660271652562954603945677336671:3000PN21742744571735502494644947601:4000PN13746543501538501816563171541:5000PN1404247850118142554342943341:6000PN12142319386574249434201927最佳抗原包被量：210ng/孔；最佳酶標(biāo)抗原工作濃度：1：3000西北大學(xué)第13頁(yè)/共42頁(yè)樣本稀釋液的確定陽(yáng)性血清稀釋倍數(shù)檢測(cè)結(jié)果1×PBS生理鹽水PBS+0.1%BSA

正常人血清1:25++++1:50++++1:100++++1:200++++1:400++++1:800++++1:1600++++1:3200++++1:6400+-+-++1:12800--++1:25600--+-+-1:51200----最佳樣本稀釋液：PBS+0.1%BSA檢測(cè)靈敏度與正常人血清相當(dāng)西北大學(xué)第14頁(yè)/共42頁(yè)保護(hù)劑的選擇保護(hù)劑X對(duì)HRP標(biāo)記抗原的保護(hù)作用良好HRP標(biāo)記抗原置于37℃、放置6天西北大學(xué)第15頁(yè)/共42頁(yè)保護(hù)劑X對(duì)包被抗原金磁微粒的保護(hù)作用包被抗原金磁微粒置于37℃、放置6天穩(wěn)定性很好西北大學(xué)第16頁(yè)/共42頁(yè)保護(hù)劑Proclin300與保護(hù)劑X的對(duì)比實(shí)驗(yàn)選定濃度為0.05%的Proclin300作為保護(hù)劑西北大學(xué)第17頁(yè)/共42頁(yè)保護(hù)劑Proclin300對(duì)HRP標(biāo)記抗原的保護(hù)作用含0.05%Proclin300的HRP標(biāo)記抗原置于37℃、放置6天西北大學(xué)第18頁(yè)/共42頁(yè)第一部分實(shí)驗(yàn)小結(jié)

在初步建立的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)梅毒螺旋體抗體方法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化，確定各最佳工作條件如下：1.HRP標(biāo)記抗原稀釋液：PBST+1%BSA作為HRP標(biāo)記抗原稀釋液；2.抗原包被量：210ng/孔(7μg/mg)；3.酶標(biāo)抗原稀釋濃度：1:3000時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到最佳；4.血清樣本稀釋液：PBS+0.1%BSA；5.保護(hù)劑：濃度為0.05%Proclin300的PBS緩沖液。西北大學(xué)第19頁(yè)/共42頁(yè)4參考值6對(duì)比實(shí)驗(yàn)1穩(wěn)定性3標(biāo)準(zhǔn)曲線25精密度特異性第二部分實(shí)驗(yàn)方法的評(píng)價(jià)西北大學(xué)第20頁(yè)/共42頁(yè)穩(wěn)定性化學(xué)發(fā)光試劑分別置于4℃冰箱和37℃生化培養(yǎng)箱中放置6天將陽(yáng)性血清分別稀釋50倍、100倍、200倍、400倍后進(jìn)行檢測(cè)西北大學(xué)第21頁(yè)/共42頁(yè)精密度國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（≤15%）批內(nèi)差：

2.86%～5%次數(shù)檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性檢測(cè)平均值RSD（%）1PN542315573523624915605715574715594923586052PN59982359232363941561251558762359721560483.103PN60741562491563022365151561561560221562192.864PN62871561662367432365341559832360122362884.775PN59232357991564011561372361171560932360783.38西北大學(xué)第22頁(yè)/共42頁(yè)批間差：

5.1%～9.7%西北大學(xué)次數(shù)

檢測(cè)結(jié)果

批次1批次2批次3陽(yáng)性檢測(cè)平均值RSD（%）1PN389515391884829154822154487846921544419.72PN432915405284723154810154541154752845346.53PN3987841891544288478384431154246843446.24PN3995840968462415474284267843681543496.75PN401615397984572154226841461541441541815.1第23頁(yè)/共42頁(yè)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品10次重復(fù)測(cè)定結(jié)果質(zhì)控品：抗-TP標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（2NCU/mL）相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差：5.42%西北大學(xué)第24頁(yè)/共42頁(yè)標(biāo)準(zhǔn)曲線將梅毒螺旋體抗體質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品（4NCU/mL）梯度稀釋，在0.25～4NCU/mL范圍內(nèi)線性良好Y=599.1X-165.9R2=0.9980西北大學(xué)第25頁(yè)/共42頁(yè)參考值（臨界值確定）檢測(cè)100例臨床陰性血清樣本臨界值：⑴P/N≥2.8，計(jì)算得出該方法的臨界值為：COV=72.8⑵P≥X+3SD，計(jì)算可得臨界值為：COV=47.6⑶P/N≥2.1，計(jì)算可得臨界值為：COV=54.6發(fā)光值=54.6西北大學(xué)第26頁(yè)/共42頁(yè)特異性陰性符合率均為100%·80例臨床血清樣本·20例乙肝陽(yáng)性血清樣本（TP陰性）·20例丙肝陽(yáng)性血清樣本（TP陰性）本次實(shí)驗(yàn)：COV=N×2.1=54.6發(fā)光值西北大學(xué)第27頁(yè)/共42頁(yè)乙肝陽(yáng)性樣本檢測(cè)結(jié)果丙肝陽(yáng)性樣本檢測(cè)結(jié)果COV=54.6COV=54.6發(fā)光值發(fā)光值乙肝血清樣本丙肝血清樣本陰性符合率均為100%西北大學(xué)第28頁(yè)/共42頁(yè)化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析法與商品化化學(xué)發(fā)光試劑盒對(duì)比靈敏度比商品化化學(xué)發(fā)光試劑盒提高4倍陽(yáng)性血清稀釋倍數(shù)檢測(cè)結(jié)果商品化試劑盒化學(xué)發(fā)光磁酶免法(MECLIA)1:100++1:200++1:400++1:800++1:1600++1:3200++1:6400-+1:12800-+1:25600-+-1:51200--西北大學(xué)第29頁(yè)/共42頁(yè)

化學(xué)發(fā)光磁酶免法（COV=N×2.1=53.2）商品化化學(xué)發(fā)光試劑盒COV=N×2.1=26151）特異性對(duì)比實(shí)驗(yàn)：二者相當(dāng)，陰性符合率均100%發(fā)光值發(fā)光值20例陰性血清樣本20陰性血清樣本COV=53.2COV=26151西北大學(xué)第30頁(yè)/共42頁(yè)西北大學(xué)第二部分實(shí)驗(yàn)小結(jié)國(guó)家法規(guī)：《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》·分析性能評(píng)估資料：分析靈敏度、分析特異性、檢測(cè)范圍批內(nèi)不精密度、批間不精密度等項(xiàng)目·參考值（參考范圍）確定·穩(wěn)定性研究資料《發(fā)光免疫分析試劑生產(chǎn)及質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》根據(jù)各個(gè)試劑盒的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或者制檢規(guī)程進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)指標(biāo)一般包括準(zhǔn)確性、靈敏度、特異性、精密性（批內(nèi)差）、相關(guān)性等，均應(yīng)達(dá)到相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。第31頁(yè)/共42頁(yè)穩(wěn)定性：4℃，及37℃加速破壞性實(shí)驗(yàn)，均顯示保存穩(wěn)定性良好；精密度：批內(nèi)差在2.86～5%，批間差在5.1～9.7%，對(duì)質(zhì)控品重復(fù)10次檢測(cè)，變異系數(shù)為5.42%，均達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（≤15%）方法評(píng)價(jià)結(jié)果西北大學(xué)第32頁(yè)/共42頁(yè)標(biāo)準(zhǔn)曲線：在0.25～4NCU/mL范圍內(nèi)線性范圍良好臨界值：臨界值為陰性對(duì)照血清均值的2.1倍特異性：檢測(cè)臨床TP抗體陰性血清，陰性符合率為100%，特異性良好對(duì)比實(shí)驗(yàn)：靈敏度較商品化化學(xué)發(fā)光試劑盒提高4倍，特異性二者相當(dāng)西北大學(xué)第33頁(yè)/共42頁(yè)●穩(wěn)定性●精密度●線性范圍●參考值●特異性●對(duì)比實(shí)驗(yàn)●HRP標(biāo)記抗原稀釋液●抗原包被量●酶標(biāo)抗原稀釋濃度●血清樣本稀釋液●保護(hù)劑對(duì)方法進(jìn)行比較全面的評(píng)價(jià)方法的進(jìn)一步優(yōu)化初步建立的化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析法全文總結(jié)：西北大學(xué)第34頁(yè)/共42頁(yè)試劑盒研制成功中試放大梅毒抗體臨床科研血清盤梅毒螺旋體抗體診斷試劑國(guó)家參考品臨床試驗(yàn)西北大學(xué)第35頁(yè)/共42頁(yè)主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系研究資料

半成品試劑盒的檢定成品試劑盒的檢定

Company

Logo第36頁(yè)/共42頁(yè)

包被抗原酶標(biāo)抗原試劑盒陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品研制Company

Logo主要原材料研究資料第37頁(yè)/共42頁(yè)穩(wěn)定性研究資料

批間穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性檢測(cè)試劑盒成品穩(wěn)定性檢測(cè)試劑盒開封穩(wěn)定性Company

Logo第38頁(yè)/共42頁(yè)性能評(píng)估資料試劑靈敏度的考察試