石韋醇提物抑菌活性的初步研究李雁群，黎樺，陳超君，覃鋒，王愛勤，黃榮韶，林偉國(guó)【內(nèi)容摘要】目的研究石韋地上部醇提物的石油醚、醋酸乙酯、正丁醇和水4個(gè)極性部位對(duì)大腸桿菌、普通變形桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、藤黃八疊球菌、黃曲霉、青霉、黑曲霉等8種常見菌的抑制造用。方法采取紙片擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，觀察并測(cè)量抑菌環(huán)的大小。結(jié)果石韋醇提物的醋酸乙酯、正丁醇和水相萃取物對(duì)供試細(xì)菌均有不同水平的抑制造用。其中正丁醇相萃取物和水相萃取物的抑菌效果較好。石油醚相萃取物對(duì)這8種供試菌均無(wú)明顯抑菌效果，各相萃取物對(duì)黃曲霉、青霉和黑曲霉也沒明顯抑菌效果。結(jié)論較強(qiáng)極性的提取物對(duì)5種細(xì)菌抑菌效果較為突出。【本文關(guān)鍵詞語(yǔ)】石韋；極性部位；抑菌活性石韋pyrrosialingua〔thunb.〕farw.又名金茶匙、小葉石韋、象皮草、石茶、牛皮茶等，為水龍骨科多年生常綠附生草本蕨類，作為常用中藥之一，石韋主治腎炎水腫、膀胱炎、泌尿系結(jié)石、肺性氣管炎，哮喘、肺膿瘍、咯血、吐血和尿血等［1］。我們國(guó)家石韋資源豐富，在廣西境內(nèi)分布較廣，武鳴、藤縣、金秀、桂平、梧州、資源和環(huán)江均有分布，重要生長(zhǎng)在海拔100～1800m的石壁或樹干上。據(jù)研究，石韋的重要藥用成分是芒果苷〔具抗菌、抗單純皰疹病毒〕、異芒果苷〔鎮(zhèn)咳祛痰、抗單純皰疹病毒作用〕、綠原酸〔抗菌、興奮中樞神經(jīng)等作用〕［2～4］，但有關(guān)石韋化學(xué)成分的抑菌性研究卻很少，藥用狀態(tài)復(fù)雜，為深切進(jìn)入開發(fā)這一豐富天然資源，本文對(duì)石韋地上部醇提物石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水不同極性溶劑得到的各部位提取物進(jìn)行抑菌活性研究，以期探明石韋重要抑菌活性成分的極性部位和適宜的提取溶劑，并為石韋的合理開發(fā)提供根據(jù)。1儀器與材料1.1儀器與材料超凈工作臺(tái)、手提式滅菌鍋、恒溫控制箱、冰箱、游標(biāo)卡尺、鑷子、接種針、三角瓶等；石油醚、醋酸乙酯、乙醇、正丁醇等試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)材料于200711采自廣西武鳴大明山國(guó)家級(jí)水源林保衛(wèi)區(qū)海拔1200m的沿路石壁上或亂石堆環(huán)境中，經(jīng)廣西大學(xué)植物分類學(xué)黎樺副教授鑒定為石韋p.lingua，將地上部洗凈，天然風(fēng)干后磨成粉末，過40目篩備用。1.2供試菌種供試細(xì)菌：大腸桿菌escherichiacoli，普通變形桿菌proteusvulgaris，金黃色葡萄球菌staphylococcusaureus，枯草芽孢桿菌bacillussubtilis，藤黃八疊球菌sarcinalutea。供試真菌：黃曲霉aspergillusflavas，青霉penicilliumsp.，黑曲霉aspergillusniger。以上菌種均由廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物保衛(wèi)系微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。1.3培養(yǎng)基細(xì)菌用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，真菌用馬鈴薯培養(yǎng)基［5］培養(yǎng)。2方法2.1菌懸液或孢子懸液制備采取平板菌落計(jì)數(shù)法［5］。將受試菌在斜面培養(yǎng)基活化2～3代后，用接種環(huán)從斜面上刮菌苔兩環(huán)，分別采集到內(nèi)盛有100ml無(wú)菌水的250ml的三角瓶中，將受試菌配成終濃度0.1×107個(gè)/ml的菌懸液，備用。2.2樣液制備石韋地上部醇提取物不同極性部位的制備：稱取粉碎好的石韋樣品4kg，用體積分?jǐn)?shù)90%乙醇將樣品浸泡3次〔料液比1∶15〕，每次7d，提取液在40°c下減壓蒸餾，回收溶劑，得乙醇浸膏。將乙醇浸膏懸浮于蒸餾水，先后用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇和蒸餾水萃取，分別得石油醚、醋酸乙酯、正丁醇和水4部分萃取物，同前濃縮，即得各極性部位。2.3石韋抗菌作用的檢測(cè)方法采取紙片擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)［6］。在超凈工作臺(tái)上將滅菌后的牛肉蛋白胨培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每皿15ml，放置冷卻。用無(wú)菌移液管取0.1ml細(xì)菌液加于平皿中均勻涂布于平板〔內(nèi)徑90mm〕外表后。取經(jīng)滅菌的標(biāo)準(zhǔn)濾紙〔直徑6mm〕，分別蘸取石韋醇提物的不同極性部位并貼于平板外表，每個(gè)培養(yǎng)皿放3片濾紙，以蒸餾水、石油醚為對(duì)照液。細(xì)菌于37℃培養(yǎng)24h、真菌于28℃培養(yǎng)48h后，檢測(cè)抑菌環(huán)的有無(wú)并測(cè)量抑菌環(huán)直徑，每種提取液對(duì)8種供試菌反復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。出現(xiàn)抑菌環(huán)的菌株才作mic檢測(cè)。2.4最小抑菌質(zhì)量濃度的檢測(cè)采取紙片擴(kuò)散法方法同“2.3〞，將各溶液稀釋成100，50，25，12.5，6.25，3.125mg/ml的質(zhì)量濃度梯度，以未見抑菌環(huán)的最高質(zhì)量濃度為mic。3結(jié)果3.1不同極性部位的抑菌活性的比較對(duì)石韋地上部醇提物不同極性部位的抑菌活性進(jìn)行比較,這4種溶劑極性大小為：石油醚＜醋酸乙酯＜正丁醇＜水。從表1能夠看出，石韋醇提物的不同極性部位對(duì)5種細(xì)菌的影響作用不同，并存在一定的差別，而且同一極性部分對(duì)不同種細(xì)菌的抑制效果也不同。對(duì)5種細(xì)菌抑菌效果以極性較強(qiáng)的提取物較為突出，正丁醇相和水相對(duì)藤黃八疊球菌抑菌較強(qiáng)〔見表1〕，這可能是由于正丁醇相和水相含有活性較高的抑菌成分，化學(xué)成分較為多樣且含量高?？梢?石韋地上部醇提物不同極性部位抑菌活性因萃取溶劑不同、菌種不同而有所差別,這是由于不同極性提取物所含化學(xué)成分的類別和含量不同所致。這4部分對(duì)金黃色葡萄球菌均無(wú)明顯抑菌作用，對(duì)大腸桿菌抑制造用較弱，而石油醚相對(duì)這5種供試菌均無(wú)明顯抑菌作用。醋酸乙酯相對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌沒有抑菌作用，正丁醇相對(duì)金黃色葡萄球菌也沒明顯抑菌作用。對(duì)照實(shí)驗(yàn)均無(wú)明顯抑菌環(huán)，地上部醇提物不同極性部位對(duì)霉菌均無(wú)明顯抑菌作用。表1石韋地上部醇提物不同極性部位對(duì)8種菌的抑制造用〔略〕3.2最小抑菌濃度比較由表2可知，石韋醇提取物不同極性部位對(duì)受試菌的抑菌效果顯示量效關(guān)系。在低濃度時(shí)，無(wú)抑菌活性，抑制環(huán)基本上隨藥液質(zhì)量濃度的增長(zhǎng)而提升，抑菌活性漸顯出來，由此可看出石韋提取物不同極性部位的最小抑菌濃度。只要正丁醇相對(duì)大腸桿菌有抑菌效果，對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度為50mg/ml。醋酸乙酯相、正丁醇相和蒸餾水相對(duì)普通變形桿菌的最小抑菌濃度分別為50，25mg/ml和12.5mg/ml，這三相對(duì)枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度分別為50，25mg/ml和12.5mg/ml，對(duì)八疊球菌最小抑菌濃度分別為25，25.00，12.5mg/ml〔見表3〕，可見，水相的最小抑菌質(zhì)量濃度最小，其次是正丁醇。石韋地上部醇提物抗菌具有廣譜性，對(duì)5種細(xì)菌均有不同水平的抑殺活性。表2醋酸乙酯相、正丁醇相、蒸餾水相的抑菌環(huán)直徑大小〔略〕表3醋酸乙酯相、正丁醇相、蒸餾水相4種細(xì)菌的micmg·ml-1〔略〕4討論本研究結(jié)果表示清楚，石韋醇提物4個(gè)極性部位的中強(qiáng)極性部位均含有抑菌活性物質(zhì)，對(duì)5種細(xì)菌有一定的抑制造用。由于不同極性部位中化學(xué)成分有明顯差別，不同細(xì)菌生長(zhǎng)所需要的要素和代謝方式不同，所以其活性也有所差別。整體而言，正丁醇相和水相對(duì)普通變形桿菌、枯草芽孢桿菌、藤黃八疊球菌的抑制效果較好。這些細(xì)菌對(duì)人體致病力較強(qiáng)，如普通變形桿菌是泌尿系感染最常見的病原菌之一，這種感染具有持久性和難治性［7］。藥用蕨類植物的重要活性成分包含生物堿、酚類和黃酮類［8］。石韋屬植物含綠原酸、芒果苷、異芒果苷、β-谷甾醇、綿馬三萜、槲皮素、異槲皮苷和三葉豆苷等［9］。從以上分析可知，石韋活性物質(zhì)重要集中在中強(qiáng)極性部位，重要的抑菌活性成分存在于正丁醇極性部位和水部分，這可能與生物堿及其鹽類、有機(jī)酸、萜類、黃酮及其苷類、甾體等抑菌活性物質(zhì)有關(guān)［10］。綠原酸在高濃度時(shí)對(duì)大腸桿菌有明顯的抑菌效用［11］。腹腔打針芒果苷,可明顯降低糖尿病大鼠由于氧化性損傷引起的糖基化血紅蛋白和血清肌酸磷酸激酶〔cpk〕的量［12］。應(yīng)對(duì)抑菌效果好的醋酸乙酯相、正丁醇相和水相進(jìn)行分離純化，以便得到抑菌活性較高的化學(xué)成分，并對(duì)其抑菌作用方式、作用機(jī)理作進(jìn)一步研究。石韋醇提物不同極性部位對(duì)黃曲霉、黑曲霉、青霉等霉菌無(wú)明顯抑殺效應(yīng)。石油醚相對(duì)這幾種菌均沒有明顯抑菌效果，這與莊惠如等［6］研究發(fā)現(xiàn)蕨類醇提物的抗真菌活性不如抗細(xì)菌，殷帥文等［13］研究幾種蕨類植物石油醚相抑菌效果相一致。各種供試藥液對(duì)不同細(xì)菌的生長(zhǎng)有不同抑制造用，以至沒有抑制造用，說明石韋植物里面存在著不同溶解性的抑菌物質(zhì)。以往多采取單種溶劑提取粗提物進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)［14,15］，這種方法常由于有效成分含量太低或粗提物成分太雜而引起漏篩現(xiàn)象。本研究中，先采取乙醇提取，再濃縮，并用水、石油醚、醋酸乙酯、正丁醇和水依次對(duì)提取物進(jìn)行萃取，不僅使植物有效成分得到充足提取，避免漏篩，同時(shí)也為以后的活性成分分離鑒定奠定了基礎(chǔ)。作為藥用資源石韋具有較強(qiáng)的開發(fā)價(jià)值，但其抑菌活性詳細(xì)成分尚不明確，因而，其抑菌活性值得研究。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究不同溶劑提取物的詳細(xì)化學(xué)成分打下基礎(chǔ)，也為今后抑菌成分的進(jìn)一步提取分離指明方向?！疽韵聻閰⒖嘉墨I(xiàn)】1］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典，ⅰ部［s］.北京:化工出版社,2000:68.［2］鄭虎占,董澤宏,余靖.中藥現(xiàn)代研究與應(yīng)用，第2卷［m］.北京:學(xué)苑出版社,1998：1807.［3］包文芳.中國(guó)石韋屬化學(xué)成分與分類學(xué)的研究［j］.沈陽(yáng)藥學(xué)院學(xué)報(bào),1983，3:62.［4］鄭民實(shí),陸仲毅.芒果苷與異芒果苷的抗單純皰疹病毒作用［j］.中國(guó)藥理學(xué)報(bào),1989,10(1):87.［5］范秀容,李廣武,沈萍.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)［m］.北京:高等教育出版社,199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