關于組織學基本技術第一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三內容提綱組織的概念及研究內容組織學技術簡介組織標本的制備組織化學與免疫組織化學術組織學的學習方法第二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三1.組織學（Histology）概念研究機體的微細結構及其相關功能的科學。2.研究內容是在細胞水平、亞細胞水平和分子水平上對機體進行研究。一、組織學概念及研究內容第三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三二、組織學技術簡介顯微鏡技術組織化學術圖像分析術細胞培養(yǎng)術和組織工程第四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三顯微鏡技術16世紀末，荷蘭的眼鏡商詹森（ZacchariasJanssen）和他的兒子把幾塊鏡片放進了一個圓筒中，結果發(fā)現(xiàn)通過圓筒看到附近的物體出奇的大，這就是現(xiàn)在的顯微鏡和望遠鏡的前身。詹森制造的第一臺復合式顯微鏡。其基本原理是使用兩個凸透鏡，一個凸透鏡把另外一個所成的像進一步放大。第五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三顯微鏡的發(fā)展史世界上的第一架顯微鏡是荷蘭眼睛匠詹森父子在1590年前后制成的，效果不理想。前后經過伽利略和胡克改良，效果較好。1878年，制成現(xiàn)代的光學顯微鏡。20世紀30年代，制造了第一架電子顯微鏡。1981年，掃描隧道顯微鏡應運而生。第六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三根據光源不同，顯微鏡分為光學顯微鏡和電子顯微鏡兩大類。前者以可見光為光源，后者則以電子束為光源?！⒐鈱W顯微鏡（一）普通光學顯微鏡（二）熒光顯微鏡（三）激光共聚焦掃描顯微境（四）暗視野顯微鏡（五）相差顯微鏡（六）偏光顯微鏡（七）微分干涉差顯微鏡（八）倒置顯微鏡顯微鏡技術第七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三尼康E-600光學顯微鏡普通光學顯微鏡由二部分構成：①光學部分：包括聚光鏡、物鏡和目鏡；②機械部分：包括鏡臂、載物臺等。尼康E-600光學顯微鏡第八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三尼康E800熒光顯微鏡熒光顯微鏡由光源、濾片系統(tǒng)和顯微鏡三部分構成。光源為高壓汞燈，用以產生波長短、能量高的紫外光。原理：紫外光激發(fā)標本中的熒光物質，使之產生各種不同顏色的熒光，通過觀察熒光的分布與強弱來測定被檢物質。研究內容：觀察組織、細胞中有自發(fā)熒光或經熒光染料染色或標記的結構。第九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三萊卡倒置顯微鏡倒置顯微鏡：組成和普通顯微鏡一樣，不同處物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺之上，后者在載物臺之下。研究內容：觀察細胞培養(yǎng)中活細胞的形態(tài)結構和生長變化情況。倒置相差顯微鏡：具有相差物鏡，使活細胞的不同結構出現(xiàn)顯著的明暗反差，并具有立體感。第十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三二、電子顯微鏡透射電鏡掃描電鏡第十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三透射電鏡觀察細胞的內部結構

觀察細胞表面的立體結構掃描電鏡第十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三透射電鏡標本制備步驟取材（約1mm3）雙重固定（雙醛固定液和四氧化鋨）樹脂包埋超薄切片重金屬染色電鏡觀察脫水第十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三掃描電鏡標本制備步驟取材（直徑約0.3cm）雙重固定（雙醛固定液和四氧化鋨）脫水干燥噴鍍電鏡掃描觀察第十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三顯微組織標本的制備有多種方法，例如：切片法（石蠟切片和冰凍切片）、涂片法、鋪片法、磨片法等。組織學中最常用的方法是石蠟切片法。三、顯微組織標本的制備第十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三三、顯微組織標本的制備組織制片的意義和目的組織標本制作的方法組織切片標本制作的基本程序蘇木精-伊紅染色的程序第十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三組織制片的意義和目的組織制片技術是隨著生命科學的發(fā)展而不斷進步的。利用組織切片染色(staining)的方法所制出的標本顯示了各種組織細胞的不同結構和形態(tài)，它們之間的相互連接及它們之中的某些化學成分的種類和含量的變化，為細胞分子學的研究提供了最直觀的依據。因此，組織制片是研究醫(yī)學和生物學的一個最基本和最重要的手段。第十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三組織標本制作的方法

組織切片法非組織切片法第十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三組織切片法：利用化學試劑將組織經過一系列的固定(fixation)、脫水、透明后，再利用石蠟或火棉膠和明膠等支持物滲透進組織內部，使組織保持一定的硬度，并包埋(embedding)成塊，然后依靠切片機(microtome)將包埋好的組織塊切成以微米計的薄片，再根據需要進行各種染色得到的供顯微鏡下觀察的標本的方法。包括：石蠟切片、火棉膠切片、明膠切片，冰凍切片。第十九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三組織不經過切片手續(xù)制成的觀察標本的方法為非組織切片法。包括：涂片、壓片、鋪片、磨片、消化分離、活體標本、整裝標本、血管注射標本。涂片：將所采的血液或骨髓樣品涂抹于載玻片上經瑞氏或姬姆薩染色后的標本。壓片：先將組織處理成小塊物質，然后經化學藥品軟化和染色，再用蓋玻片壓封于載玻片上的標本。例如運動終板等。非組織切片法第二十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三鋪片：將需要觀察的薄片組織用手工的方法直接鋪于載玻片上，然后經過固定、染色等程序制成的標本。例如蛙的腸系膜鋪片，大白鼠的皮下組織鋪片等。磨片：骨，牙齒等組織，不經脫鈣和切片，直接在磨石上用手工磨成大約50微米左右的薄片，然后再進行染色封固在載玻片上的標本。消化分離：將組織分離成小塊，然后利用相應的化學藥品水溶液將其細胞間質消化溶去，再用機械分離的方法，如利用水的震蕩沖擊力等，使小塊組織分離成單個而又完整的細胞，經染色后涂于載玻片上封固的標本。例如平滑肌分離標本，脊髓的運動神經細胞等。第二十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三活體標本：將所采的觀察標本加生理鹽水后直接滴于載玻片上在顯微鏡下觀察。整裝標本：一種是將胚胎或小動物經前期固定后整體封藏于盛滿固定劑的透明容器中。另一種是將發(fā)育至某一階段的雞胚整體取出，經固定、染色、脫水、透明后封固于載玻片上的標本。血管注射標本：一種是將有色物質注射進血管，用酸或鹼將血管周圍的組織腐蝕后做成的整體封藏的血管標本。另一種是將有色物質注射進血管后，經一系列制片技術處理后封固于載玻片上供顯微鏡下觀察的標本。第二十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三切片：用于具有一定硬度的組織，例如肝、腎等第二十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三涂片:用于液態(tài)組織，如血液，精液和唾液。第二十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三鋪片:用于很薄的組織，如腸系膜。第二十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三磨片:用于很堅硬的組織，如骨和牙。第二十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三石蠟切片制作步驟

取材固定包埋切片染色封片第二十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三石蠟切片的制備（一）取材注意事項：材料愈新鮮愈好，動作要迅速、準確，防止組織發(fā)生變形、自溶；取材所用的刀和剪要銳利，避免損傷組織；取材部位要恰當、準確，易于說明問題；所取組織塊大小要恰當，便于固定液的滲透。組織的大小以1X1X0.3cm為宜，厚度一般不超過0.5cm。第二十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三（二）固定目的：使組織內的蛋白質迅速凝固或沉淀，防止細胞自溶或組織腐敗，盡量保持組織的原有結構和化學組成。第二十九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三

單純固定液4%中性甲醛：用PH7.2-7.4的PBS配制，配制后密封、4℃保存，保存時間不超過一個月。適用HE染色和免疫組化。4%多聚甲醛：用PH7.2-7.4的PBS配制。乙醇混合固定液復合固定液

AF（乙醇-甲醛）固定液

Bouin固定液

Carnoy固定液

Zenker固定液固定液的種類第三十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三固定方法

浸透固定：將組織切成小塊，直接投入固定液中固定。灌注固定：一般采用心臟灌注固定。固定更加迅速、均勻。尤其適用神經組織。第三十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三固定注意事項及時固定：最好動物死后半小時內固定，一般不超過2小時。固定液選擇：根據組織的特點、染色方法選擇合適的固定液。固定液的量：一般為組織體積的6-10倍。固定時間：在保存組織形態(tài)結構的同時，盡可能較好保存組織細胞的抗原。固定溫度：低溫可以保持好的結構。第三十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三高效、方便、快捷的全自動形態(tài)檢測平臺！第三十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三（三）染色HE染色（hematoxylin-eosinstaining）

：組織學最常用的染色方法。特殊染色：硝酸銀染色、醛復紅染色、甲苯胺藍染色等。第三十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三鍍銀染色神經元H.E染色第三十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三蘇木精堿性染料將嗜堿性物質染成藍色酸性染料將嗜酸性物質染成紅色細胞核中的染色質細胞質中的核糖體

多數(shù)細胞的細胞質（線粒體、溶酶體、滑面內質網）HE染色嗜堿性嗜酸性伊紅第三十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三細胞爬片制作將處理好的蓋玻片放入接種了細胞的培養(yǎng)瓶或六孔板內。待細胞生長達到60％以上后取出玻片。用4%的多聚甲醛固定2h以上?？杉痈视头獯嬷糜诹阆?0℃保存。第三十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三細胞涂片制作離心將細胞收集出來，用預冷的PBS洗2－3遍，最后用PBS將細胞重懸。吸取30－50ul（可根據細胞量調整）滴至處理過的載玻片上，然后涂抹均勻。待稍微風干以后加4％多聚甲醛溶液覆蓋細胞，固定2－4小時。在細胞上加一層甘油放-20℃保存。第三十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三組織化學技術概念：應用化學反應或免疫學反應等原理檢測組織和細胞的化學成分并進行定位、定量的技術。包括一般組織化學、免疫組織化學、原位雜交組織化學等。四、組織化學與免疫組織化學術第三十九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三

原理：組織細胞中的物質（核酸、糖類、脂類、蛋白質等）與相應試劑反應，最后形成有色終產物，通過有色終產物在細胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質在細胞中的分布和含量。特點：能在組織學標本上，定位、定性和定量地顯示分布于組織或細胞內某些物質。第四十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三①糖類——過碘酸-Schiff反應（PAS反應）②DNA——福爾根反應（Feulgenreaction）③DNA和RNA——甲基綠-派若寧反應④脂類——脂溶性染料（蘇丹紅、油紅O等）⑤酶類——生化反應（一）一般組織化學術（Histochemistry）第四十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三PAS反應：確定組織或細胞中有無多糖存在的一種方法。反應產物呈紫紅色。第四十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三Feulgen反應：顯示DNA，呈紅色。甲基綠-派若寧反應：同時顯示DNA核RNA，DNA呈藍綠色，RNA呈紅色。洋蔥鱗莖內表皮細胞第四十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三蘇丹紅染色：脂類物質呈紅色。冰凍切片對脂類物質保持較好。第四十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三酶類：在適當溫度和PH條件下，酶催化特異性底物形成初級反應產物，再用捕捉劑捕獲該產物，形成鏡下可見的有色沉淀物。該技術檢測的不是酶本身，而是酶的活性。第四十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三（二）免疫組織化學術（immunohistochemistry）1.概念及原理：根據抗原和抗體特異性結合原理，檢測組織、細胞中多肽和蛋白質等大分子物質的一種技術。用標記的抗體與組織中的抗原結合，然后通過化學反應，將抗原抗體結合部位顯示出來，借助顯微鏡觀察，確定檢測物質的分布、含量。第四十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三2.標記物種類

熒光染料：例如異硫氰酸熒光素（FITC），四甲基異硫氰酸羅達明（TMRITC），用熒光顯微鏡觀察

酶類：例如辣根過氧化物酶，用光鏡或電鏡觀察。

膠體金：多用于電鏡觀察。第四十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三免疫組織化學原理模式圖

抗原抗體抗原抗體復合物

熒光素辣根過氧化物酶膠體金第四十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三3.免疫組化技術的種類根據染色步驟分：

直接法：直接標記第一抗體。該法簡單，特異性強，但敏感性較差。

間接法：不標記第一抗體，標記第二抗體。該法敏感性較高。

特殊的間接法：第一抗體和第二抗體均不標記，而是用酶標記與第二抗體結合的物質。該法敏感性高。包括PAP法、ABC法、SABC法等。第四十九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三根據標記不同分：免疫熒光技術：免疫膠體金技術：免疫酶標技術：目前最常用的方法。包括PAP法、ABC法、SABC法等。與免疫熒光技術比較，其優(yōu)點定位準確、對比度好，染色標本可長期保存，適合光鏡、電鏡研究。第五十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三熒光標記免疫組織化學

直接法間接法第五十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三免疫組織化學（熒光素標記）毛細血管內皮細胞呈vWF陽性——血管性假血友病因子第五十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三NucleusandActinEndoplasmicReticulumNucleusandMicrotubulesActinandMicrotubulesCellularStructuresTheGolgiApparatusStagesofMitosis第五十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三酶聯(lián)免疫組織化學ABC法：一抗＋生物素化二抗＋abc復合物

S-P法：一抗＋生物素化二抗＋HRP標記的鏈霉卵白素第五十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三免疫組織化學（辣根過氧化物酶標記）大腸肌動蛋白——actin陽性第五十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三4.免疫組化技術的注意事項：

組織固定愈新鮮愈好。固定液多用4%多聚甲醛，固定時間不宜過長。組織脫水必需徹底。切片必需完整，平展，無氣泡、皺褶。切片貼附必需牢固：載玻片需做特殊處理。切片脫蠟徹底。第五十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三4.免疫組化技術的注意事項：

徹底抑制內源性過氧化物酶活性，降低背景染色常用抑制劑是3%的過氧化氫。合理使用封閉劑，目的減少非特異性染色。封閉血清一般是和二抗同一來源，也可以用羊血清、小牛血清等，但不能與一抗來源一致?？乖迯停旱谖迨唔摚擦彭?，編輯于2023年，星期三4.免疫組化技術的注意事項：

選擇合適抗體。抗體使用注意事項。

PBS的沖洗：

PBS的要求：PH7.2-7.6；濃度：0.02M。單獨沖洗溫柔沖洗沖洗徹底第五十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三4.免疫組化技術的注意事項：DAB顯色注意事項：DAB是一種致癌物，嚴禁倒入水池，同時注意自我保護。新鮮配制：顯色前10-15分鐘配制。室溫顯色，需要在鏡下控制顯色時間，一般在5-30分鐘。第五十九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三洗滌劑清洗泡酸臨用前防脫處理（明膠、多聚賴氨酸、APES）流水沖洗烤箱烤干流水沖洗蒸餾水沖洗烤箱烤干37℃干燥備用免疫組織載玻片特殊處理步驟第六十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三組織制作過程中，由于化學試劑的作用封閉了部分抗原，又由于熱的作用致使部分抗原的肽鏈發(fā)生扭曲，導致免疫組化染色過程中不能將其徹底顯示，為了解決上述的問題，利用化學試劑和熱的作用將這些抗原重新暴露或修正的過程稱為抗原修復。常用的抗原修復方法有微波修復法、高壓加熱法、水煮加熱法、酶消化法等，常用的修復液是PH6.0的mol/L的檸檬樹緩沖液。抗原修復第六十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三一抗選擇：選擇單克隆抗體還是多克隆抗體。單克隆抗體特異性強，靈敏度較低；多克隆抗體特異性稍弱，靈敏度高，易出現(xiàn)非特異性染色。通過實驗動物選擇種屬來源。能否做免疫組化。檢測標本類型：石蠟切片、冰凍切片生產廠家：國內、國外。二抗選擇：根據一抗種屬選擇二抗種屬來源。抗體選擇第六十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三抗體保存：濃縮液于-80℃可保存三年左右。購買后，應在無菌條件下，將抗體分裝成小包裝，蠟膜密封。禁忌反復凍融。選擇最佳抗體稀釋度：抗體稀釋液用山羊血清、BSA或脫脂奶粉等?？贵w的加入：切片濕潤，滴入抗體量以一滴50ul為好。選擇合適的孵育時間：4℃孵育過夜，室溫2小時，37℃30-60分鐘?？贵w使用注意事項第六十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三必須設染色對照：每批染色都要以特異性的陽性對照和陰性對照為基礎，才能對染色結果做出正確的判斷。抗原表達必須在特定部位：