第一頁，共58頁。第二頁，共58頁。1.1總則：環(huán)境、要求1.2計(jì)數(shù)方法：平皿法、薄膜過濾法、最可能數(shù)法（MPN法）1.3計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和供試品計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)：菌種及菌液制備、培養(yǎng)基適用性檢查、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。1.4供試品檢查：檢驗(yàn)量、供試品檢查1.5結(jié)果判斷1.6稀釋液、沖洗液及培養(yǎng)基1.非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：

----微生物計(jì)數(shù)法第三頁，共58頁。微生物計(jì)數(shù)法系用于能在有氧條件下生長(zhǎng)的嗜溫細(xì)菌和真菌的計(jì)數(shù)。當(dāng)本法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料等是否符合規(guī)定的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)按規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，包括樣品的取樣量和結(jié)果的判斷等。除另有規(guī)定外，本法不適用于活菌制劑的檢查。本檢查法可采用替代的微生物檢查法，包括自動(dòng)檢測(cè)方法，但必須證明替代方法等效于藥典規(guī)定的檢查方法。1.1總則：第四頁，共58頁。1.1總則：環(huán)境：微生物計(jì)數(shù)試驗(yàn)環(huán)境應(yīng)符合微生物限度檢查的要求。(在不低于GMP現(xiàn)行版要求的D級(jí)潔凈環(huán)境、局部潔凈度不低于B級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行)【10版：在環(huán)境潔凈度10000級(jí)下的局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)】。檢驗(yàn)全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)域、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期進(jìn)行監(jiān)測(cè)。第五頁，共58頁。1.1總則：如供試品有抗菌活性，應(yīng)盡可能去除或中和。供試品檢查時(shí),若使用了中和劑或滅活劑，應(yīng)確認(rèn)其有效性及對(duì)微生物無毒性。供試液制備時(shí)如果使用了表面活性劑，應(yīng)確認(rèn)其對(duì)微生物無毒性以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性。第六頁，共58頁。平皿法薄膜過濾法最可能數(shù)法（Most-Probable-NumberMethod，簡(jiǎn)稱MPN法）。MPN法用于微生物計(jì)數(shù)時(shí)精確度較差，但對(duì)于某些微生物污染量很小的供試品，MPN法可能是更適合的方法。供試品檢查時(shí),應(yīng)根據(jù)供試品理化特性和微生物限度標(biāo)準(zhǔn)等因素選擇計(jì)數(shù)方法，所選的方法必須具備檢測(cè)充足樣品量的能力，以保證所獲得的試驗(yàn)結(jié)果能夠判斷供試品是否符合規(guī)定。所選方法的適用性須經(jīng)確認(rèn)。1.2計(jì)數(shù)方法：第七頁，共58頁。供試品微生物計(jì)數(shù)中所使用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行適用性檢查。供試品的微生物計(jì)數(shù)方法應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)【10版：方法驗(yàn)證】，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的微生物計(jì)數(shù)。若檢驗(yàn)程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，計(jì)數(shù)方法應(yīng)重新進(jìn)行適用性試驗(yàn)。

1.3計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和供試品計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)第八頁，共58頁。1.3.1菌液制備及使用1.3.2計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查1.3.3計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)1.3計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和供試品計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)第九頁，共58頁。1.3.1菌液制備及使用菌種

試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。1.3計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和供試品計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)第十頁，共58頁。菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用；若保存在2～8℃，可在24小時(shí)內(nèi)使用。穩(wěn)定的黑曲霉孢子懸液可保存在2～8℃，在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用。1.3.1菌液制備及使用

第十一頁，共58頁。1.3.2計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查【10版】每一試驗(yàn)菌株平行制備2管或2個(gè)平皿；接種量50~100cfu；同時(shí)，用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。結(jié)果判定：若被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)不小于對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的70%，且菌落形態(tài)大小與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致，判該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。第十二頁，共58頁。1.3.2計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查【15版】每一試驗(yàn)菌株平行制備2管或2個(gè)平皿；接種量不大于100cfu；同時(shí)，用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。結(jié)果判定：被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)在0.5-2范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致；被檢液體培養(yǎng)基管與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好。第十三頁，共58頁。1.3.3計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)供試液制備接種和稀釋抗菌活性的去除與滅活供試品中微生物的回收平皿法薄膜過濾法最可能數(shù)法（MPN法）結(jié)果判斷第十四頁，共58頁。1.4.1檢驗(yàn)量檢驗(yàn)量即一次試驗(yàn)所用的供試品量（g、ml或cm2）。除另有規(guī)定外,一般供試品的檢驗(yàn)量為10g或10ml；膜劑為100cm2；貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減。檢驗(yàn)時(shí),應(yīng)從2個(gè)以上最小包裝單位中抽取供試品,大蜜丸還不得少于4丸,膜劑還不得少于4片。一般應(yīng)隨機(jī)抽取供試品，取規(guī)定容器數(shù)，混合，取規(guī)定量供試品進(jìn)行檢驗(yàn)。1.4供試品檢查第十五頁，共58頁。按計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試品中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測(cè)定。胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于測(cè)定需氧菌總數(shù)；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù)。陰性對(duì)照試驗(yàn)

以稀釋劑代替供試液進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無菌生長(zhǎng)。如果陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。1.4.2供試品檢查第十六頁，共58頁。供試液制備根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性,采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需加溫時(shí),應(yīng)均勻加熱,且溫度不應(yīng)超過45℃。供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基,不得超過1小時(shí)。常用的供試液制備方法如下。如果下列供試液制備方法經(jīng)確認(rèn)均不適用，應(yīng)建立其他適宜的方法。1.4.2供試品檢查第十七頁，共58頁。供試液制備⑴水溶性供試品

取供試品，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或pH7.2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基溶解或稀釋制成1:10供試液。若需要，調(diào)節(jié)供試液pH值至6～8。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。1.4.2供試品檢查第十八頁，共58頁。1.4.2供試品檢查供試液制備⑵水不溶性非油脂類供試品取供試品，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或pH7.2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基制備成1:10供試液。分散力較差的供試品，可在稀釋液中加入表面活性劑如0.1%的聚山梨酯80，使供試品分散均勻。若需要，調(diào)節(jié)供試液pH值至6～8。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。第十九頁，共58頁。1.4.2供試品檢查供試液制備⑶油脂類供試品

取供試品，加入無菌十四烷酸異丙酯使溶解，或與最少量并能使供試品乳化的無菌聚山梨酯80或其他無抑菌性的無菌表面活性劑充分混勻。表面活性劑的溫度一般不超過40℃（特殊情況下，最多不超過45℃），小心混合，若需要可在水浴中進(jìn)行，然后加入預(yù)熱的稀釋液使成1∶10供試液，保溫，混合，并在最短時(shí)間內(nèi)形成乳狀液。必要時(shí)，用稀釋液或含上述表面活性劑的稀釋液進(jìn)一步10倍系列稀釋。第二十頁，共58頁。1.4.2供試品檢查供試液制備⑷需用特殊方法制備供試液的供試品膜劑供試品腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品氣霧劑、噴霧劑供試品貼膏劑供試品第二十一頁，共58頁。

平皿法平皿法包括傾注法和涂布法。除另有規(guī)定外，取規(guī)定量供試品，按方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備和菌數(shù)測(cè)定，每稀釋級(jí)每種培養(yǎng)基至少制備2個(gè)平皿。培養(yǎng)和計(jì)數(shù)除另有規(guī)定外，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板在30～35℃培養(yǎng)3~5天，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板在20～25℃培養(yǎng)5~7天，觀察菌落生長(zhǎng)情況,點(diǎn)計(jì)平板上生長(zhǎng)的所有菌落數(shù)，必要時(shí)可適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至7天進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并報(bào)告。菌落蔓延生長(zhǎng)成片的平皿不宜計(jì)數(shù)。點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)后，計(jì)算各稀釋級(jí)供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù)。若同稀釋級(jí)兩個(gè)平皿的菌落數(shù)平均值不小于15，則兩個(gè)平皿的菌落數(shù)不能相差1倍或以上。1.4.2供試品檢查第二十二頁，共58頁。菌數(shù)報(bào)告規(guī)則

需氧菌總數(shù)測(cè)定宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu的稀釋級(jí)、霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定宜選取平均菌落數(shù)小于100cfu的稀釋級(jí)，作為菌數(shù)報(bào)告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。取最高的平均菌落數(shù)，計(jì)算1g、1ml或10cm2

供試品中所含的微生物數(shù)。如各稀釋級(jí)的平皿均無菌落生長(zhǎng)，或僅最低稀釋級(jí)的平板有菌落生長(zhǎng)，但平均菌落數(shù)小于1時(shí)，以﹤1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。第二十三頁，共58頁。

薄膜過濾法除另有規(guī)定外，按計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備。取相當(dāng)于1g、1ml或10cm2供試品的供試液，若供試品所含的菌數(shù)較多時(shí)，可取適宜稀釋級(jí)的供試液，照方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法加至適量稀釋液中，立即過濾，沖洗，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)和計(jì)數(shù)培養(yǎng)條件和計(jì)數(shù)方法同平皿計(jì)數(shù)法，每張濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過100cfu。第二十四頁，共58頁。菌數(shù)報(bào)告規(guī)則

以相當(dāng)于1g、1ml或10cm2

供試品的菌落數(shù)報(bào)告菌數(shù)；若濾膜上無菌落生長(zhǎng)，以﹤1報(bào)告菌數(shù)（每張濾膜過濾1g、1ml或10cm2

供試品）,或﹤1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。第二十五頁，共58頁。

MPN法取規(guī)定量供試品，按方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備和供試品接種，所有試驗(yàn)管在30～35℃培養(yǎng)3～5天，如果需要確認(rèn)是否有微生物生長(zhǎng)，按方法適應(yīng)性試驗(yàn)確定的方法進(jìn)行。記錄每一稀釋級(jí)微生物生長(zhǎng)的管數(shù)，從表3查對(duì)每1g或1ml供試品中需氧菌總數(shù)的最可能數(shù)。第二十六頁，共58頁。1.5結(jié)果判斷需氧菌總數(shù)是指胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的總菌落數(shù)（包括真菌菌落數(shù)）；霉菌和酵母菌總數(shù)是指沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的總菌落數(shù)（包括細(xì)菌菌落數(shù)）。若因沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌使霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)結(jié)果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、慶大霉素）的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或其他選擇性培養(yǎng)基（如玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基）進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定。使用選擇性培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查。若采用MPN法，測(cè)定結(jié)果為需氧菌總數(shù)。第二十七頁，共58頁。各品種項(xiàng)下規(guī)定的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)解釋如下：101cfu：可接受的最大菌數(shù)為20；102cfu：可接受的最大菌數(shù)為200；103cfu：可接受的最大菌數(shù)為2000：依此類推。若供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的檢查結(jié)果均符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品符合規(guī)定；若其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定。1.5結(jié)果判斷第二十八頁，共58頁。2.1總則：環(huán)境、要求2.2培養(yǎng)基適用性檢查和控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)：菌種及菌液制備、培養(yǎng)基適用性檢查、控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)、2.3供試品檢查：陰性對(duì)照試驗(yàn)、陽性對(duì)照試驗(yàn)、耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌、沙門菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌、白色念珠菌2.4稀釋液2.非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：

----控制菌檢查法第二十九頁，共58頁。2.1總則控制菌檢查法系用于在規(guī)定的試驗(yàn)條件下，檢查供試品中是否存在特定的微生物。當(dāng)本法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料是否符合相應(yīng)的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)按下列規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，包括樣品取樣量和結(jié)果判斷等。本檢查法可采用替代的微生物檢查法，包括自動(dòng)檢測(cè)方法，但必須證明替代方法等效于藥典規(guī)定的檢查方法。供試液制備及實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求同“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法”（通則1105）。第三十頁，共58頁。如果供試品具有抗菌活性，應(yīng)盡可能去除或中和。供試品檢查時(shí),若使用了中和劑或滅活劑，應(yīng)確認(rèn)有效性及對(duì)微生物無毒性。供試液制備時(shí)如果使用了表面活性劑，應(yīng)確認(rèn)其對(duì)微生物無毒性以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性。第三十一頁，共58頁。2.2培養(yǎng)基適用性檢查和控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)2.2.1菌液制備2.2.2培養(yǎng)基的適用性檢查2.2.2

控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查2.2.3控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)第三十二頁，共58頁。菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用；若保存在2～8℃，可在24小時(shí)內(nèi)使用。生孢梭菌孢子懸液可替代新鮮的菌懸液，穩(wěn)定的孢子懸液可保存在2～8℃，在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用。2.2.1菌液制備

第三十三頁，共58頁。2.2.2

控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查，檢查項(xiàng)目包括促生長(zhǎng)能力抑制能力指示能力各培養(yǎng)基的檢測(cè)項(xiàng)目及所用菌株見表1。第三十四頁，共58頁。2.2.2

控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查表1控制菌檢查用培養(yǎng)基的促生長(zhǎng)能力、抑制能力及指示特性第三十五頁，共58頁。液體培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力檢查

分別接種不大于100cfu的試驗(yàn)菌于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不長(zhǎng)于規(guī)定的最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好。固體培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力檢查

用涂布法分別接種不大于100cfu【10版：50~100cfu】的試驗(yàn)菌于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不長(zhǎng)于規(guī)定的最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，被檢培養(yǎng)基與對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落大小、形態(tài)特征應(yīng)一致。第三十六頁，共58頁。培養(yǎng)基抑制能力檢查

接種不少于100cfu的試驗(yàn)菌于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不短于規(guī)定的最長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，試驗(yàn)菌應(yīng)不得生長(zhǎng)。培養(yǎng)基指示特性檢查

用涂布法分別接種不大于100cfu的試驗(yàn)菌于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不長(zhǎng)于規(guī)定的最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，被檢培養(yǎng)基上試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的菌落大小、形態(tài)特征、指示劑反應(yīng)情況等應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基一致。第三十七頁，共58頁。2.2.3控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)試驗(yàn)菌

根據(jù)各品種項(xiàng)下微生物限度標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定檢查的控制菌選擇相應(yīng)試驗(yàn)菌株，確認(rèn)耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法時(shí),采用大腸埃希菌和銅綠假單胞菌為試驗(yàn)菌。結(jié)果判斷

上述試驗(yàn)若檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制備法和控制菌檢查方法進(jìn)行供試品檢查；若未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。如果經(jīng)過試驗(yàn)確證供試品對(duì)試驗(yàn)菌的抗菌作用無法消除，可認(rèn)為受抑制的微生物不可能存在于該供試品中，選擇抑菌成份消除相對(duì)徹底的方法進(jìn)行供試品的檢查。第三十八頁，共58頁。2.3供試品檢查供試品的控制菌檢查應(yīng)按經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行。供試品檢出控制菌或其他致病菌時(shí),按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn),不再復(fù)試。陽性對(duì)照試驗(yàn)

陽性對(duì)照試驗(yàn)方法同供試品的控制菌檢查,對(duì)照菌的加量應(yīng)不大于100cfu。陽性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。陰性對(duì)照試驗(yàn)

以稀釋劑代替供試液照相應(yīng)控制菌檢查法檢查，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無菌生長(zhǎng)。如果陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。第三十九頁，共58頁?？刂凭鷻z查過程：使用無選擇性增菌培養(yǎng)基（胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基）培養(yǎng)，使受損的細(xì)菌得到修復(fù)，提高檢出率。增菌培養(yǎng)----選擇性增菌----選擇性瓊脂2.3供試品檢查第四十頁，共58頁。耐膽鹽革蘭陰性菌【10版：大腸菌群】2.3.2大腸埃希菌2.3.3沙門菌2.3.4銅綠假單胞菌2.3.5金黃色葡萄球菌2.3.6梭菌2.3.7白色念珠菌2.3供試品檢查第四十一頁，共58頁。耐膽鹽革蘭陰性菌【15版新增】供試液制備和預(yù)培養(yǎng)

取供試品，用胰酪大豆胨液體作為稀釋劑照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法”（通則1105）制成1：10供試液，混勻，在20～25℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)使供試品中的細(xì)菌充分恢復(fù)但不增殖（約2小時(shí)）。定性試驗(yàn)除另有規(guī)定外，取相當(dāng)于1g或1mL供試品的上述預(yù)培養(yǎng)物接種至腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)24～48小時(shí)后，劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。如果平板上無菌落生長(zhǎng)，判供試品未檢出耐膽鹽革蘭陰性菌。第四十二頁，共58頁。耐膽鹽革蘭陰性菌【15版新增】定量試驗(yàn)選擇和分離培養(yǎng)取相當(dāng)于0.1g、0.01g和0.001g（或0.1mL、0.01mL和0.001mL）供試品的預(yù)培養(yǎng)物或其稀釋液分別接種至腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)24～48小時(shí)。上述每一培養(yǎng)物分別劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。結(jié)果判斷

若紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長(zhǎng)，則對(duì)應(yīng)培養(yǎng)管為陽性，否則為陰性。根據(jù)各培養(yǎng)管檢查結(jié)果，從表2查對(duì)1g或1ml供試品中含有耐膽鹽革蘭陰性菌的最大可能數(shù)。第四十三頁，共58頁。取供試液10ml（相當(dāng)于供試品lg、lml、10cm2)，直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時(shí)，必要時(shí)可延長(zhǎng)至48小時(shí)。取上述培養(yǎng)物0.2ml，接種至含5mlMUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5小時(shí)、24小時(shí)在366nm紫外光下觀察，同時(shí)用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對(duì)照。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG陽性；不呈現(xiàn)熒光，為MUG陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加人數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對(duì)照應(yīng)為MUG陰性和靛基質(zhì)陰性。2.3.1大腸菌群【10版】第四十四頁，共58頁。如MUG陽性、靛基質(zhì)陽性，判供試品檢出大腸埃希菌；如MUG陰性、靛基質(zhì)陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌；如MUG陽性、靛基質(zhì)陰性，或MUG陰性、靛基質(zhì)陽性，則應(yīng)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18～24小時(shí)。若平板上無菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)的菌落與表3所列的菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌。若平板上生長(zhǎng)的菌落與表3所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)進(jìn)行分離、純化、染色鏡檢和適宜的鑒定試驗(yàn)，確認(rèn)是否為大腸埃希菌。2.3.1大腸菌群【10版】第四十五頁，共58頁。2.3.2大腸埃希菌供試液制備和增菌培養(yǎng)

取供試品，照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法”（通則1105）制成1：10供試液。取相當(dāng)于1g或1mL供試品的供試液，接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定的）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。選擇和分離培養(yǎng)

取上述預(yù)培養(yǎng)物1mL接種至100mL麥康凱液體培養(yǎng)基中，42～44℃培養(yǎng)24～48小時(shí)。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～72小時(shí)。結(jié)果判斷

若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行分離、純化及適宜的鑒定試驗(yàn),確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長(zhǎng)，或雖有菌落生長(zhǎng)但鑒定結(jié)果為陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。第四十六頁，共58頁。2.3.3沙門菌含藥材原粉化學(xué)藥和中藥制劑及臟器提取物的口服制劑【10版：含動(dòng)物組織及動(dòng)物類原藥材粉的口服制劑】每10g或10ml不得檢出沙門菌供試液制備和增菌培養(yǎng)取10g或10mL供試品直接或處理后接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定的）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。選擇和分離培養(yǎng)

取上述預(yù)培養(yǎng)物0.1mL接種至10mLRV沙門增菌液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。取少量RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～48小時(shí)。沙門菌在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)良好，菌落為淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色。用接種針挑選疑似菌落于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進(jìn)行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)18～24小時(shí)，或采用其它適宜方法進(jìn)一步鑒定。第四十七頁，共58頁。2.3.3沙門菌結(jié)果判斷

若木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上有疑似菌落生長(zhǎng)，且三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面為紅色、底層為黃色，或斜面黃色、底層黃色或黑色，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn),確證是否為沙門菌。如果平板上沒有菌落生長(zhǎng)，或雖有菌落生長(zhǎng)但鑒定結(jié)果為陰性，或三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面未見紅色、底層未見黃色；或斜面黃色、底層未見黃色黑色，判供試品未檢出沙門菌。第四十八頁，共58頁。2.3.4銅綠假單胞菌供試液制備和增菌培養(yǎng)

取供試品，照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法”（通則1105）制成1：10供試液。取相當(dāng)于1g或1mL供試品的供試液，接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定的）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻。30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。選擇和分離培養(yǎng)取上述預(yù)培養(yǎng)物劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～72小時(shí)。取上述平板上生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，或采用其它適宜方法進(jìn)一步鑒定。氧化酶試驗(yàn)將潔凈濾紙片置于平皿內(nèi),用無菌玻棒取上述平板上生長(zhǎng)的菌落涂于濾紙片上，滴加新配制的1％二鹽酸二甲基對(duì)苯二胺試液，在30秒內(nèi)若培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗(yàn)陽性,否則為陰性。第四十九頁，共58頁。2.3.4銅綠假單胞菌結(jié)果判斷

若溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長(zhǎng)，且氧化酶試驗(yàn)陽性，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn),確證是否為銅綠假單胞菌。如果平板上沒有菌落生長(zhǎng)，或雖有菌落生長(zhǎng)但鑒定結(jié)果為陰性，或氧化酶試驗(yàn)陰性，判供試品未檢出銅綠假單胞菌。第五十頁，共58頁。2.3.5金黃色葡萄球菌供試液制備和增菌培養(yǎng)

取供試品，照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法”（通則1105）制成1：10供試液。取相當(dāng)于1g或1mL供試品的供試液，接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定的）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻。30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。選擇和分離培養(yǎng)

取上述預(yù)培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～72小時(shí)。第五十一頁，共58頁。結(jié)果判斷

若甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上有黃色菌落或外周有黃色環(huán)的白色菌落生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行分離、純化及適宜的鑒定試驗(yàn),確證是否為金黃色葡萄球菌；若平板上沒有與上述形態(tài)特征相符或疑似的菌落生長(zhǎng)，或雖有相符或疑似的菌落生長(zhǎng)但鑒定結(jié)果為陰性，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。2.3.5金黃色葡萄球菌第五十二頁，共58頁。2.3.6梭菌供試液制備和熱處理

取供試品，照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法”（通則1105）制成1：10供試液。取相當(dāng)于1g或1mL供試品的供試液2份，其中