實(shí)驗(yàn)一牛乳中酪蛋白的制備與鑒定第1頁(yè)/共13頁(yè)2實(shí)驗(yàn)一牛乳中酪蛋白的制備與鑒定請(qǐng)將教室水浴鍋打開，溫度調(diào)至40℃。并將乙酸-乙酸鈉緩沖液（1-2瓶/室）放入水浴鍋內(nèi)，預(yù)熱至40℃。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后務(wù)必?cái)嚅_電源。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，務(wù)必將使用過(guò)的玻璃器皿洗凈、晾干、放回原處?！緶剀疤崾尽康?頁(yè)/共13頁(yè)3（1）學(xué)習(xí)從牛乳中制備酪蛋白的方法。（2）了解從牛奶中制取酪蛋白的原理。（3）驗(yàn)證蛋白質(zhì)的雙縮脲反應(yīng)性質(zhì)。（4）學(xué)習(xí)和掌握蛋白質(zhì)雙縮脲反應(yīng)的原理和方法。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡?頁(yè)/共13頁(yè)二、實(shí)驗(yàn)原理牛乳中主要的蛋白質(zhì)是酪蛋白，含量約為35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白質(zhì)的混合物，等電點(diǎn)為4.7-4.8。利用等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低的原理，將牛乳的pH調(diào)至4.7-4.8時(shí)，酪蛋白就沉淀出來(lái)。用乙醇洗滌沉淀物，乙醚除去脂類雜質(zhì)后便可得到純的酪蛋白。1.牛乳中酪蛋白制備第4頁(yè)/共13頁(yè)二、實(shí)驗(yàn)原理兩分子尿素加熱到180℃左右時(shí)，生成雙縮脲并放出一分子氮，雙縮脲在堿性環(huán)境中能與Cu2+結(jié)合生成紫紅色化合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。

2.酪蛋白的雙縮脲反應(yīng)第5頁(yè)/共13頁(yè)二、實(shí)驗(yàn)原理N端C端蛋白質(zhì)分子中有肽鍵，其結(jié)構(gòu)與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似，因此，蛋白質(zhì)在堿性環(huán)境中也能與Cu2+結(jié)合也發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，生成紫紅色化合物。由于，紫紅色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。顏色深淺可在540nm比色測(cè)定，故可用此法來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。第6頁(yè)/共13頁(yè)7三、儀器和試劑1、儀器：恒溫水浴鍋、低速離心機(jī)、托盤天平、電子天平、酒精燈等。1支25mL試管、攪拌棒、15mL離心管、濾紙。7支15mL試管。移液管、吸耳球、移液槍（200uL）、槍頭（200uL）。2、材料與試劑：牛奶乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH4.6）、1%氫氧化鈉、10%乙酸、蒸餾水、無(wú)水乙醇。蒸餾水、10%氯化鈉、0.5%碳酸鈉、0.1mol/L氫氧化鈉、0.2%鹽酸、飽和氫氧化鈣、雙縮脲試劑。尿素、雙縮脲試劑。（教師演示用）第7頁(yè)/共13頁(yè)8四、實(shí)驗(yàn)步驟1、酪蛋白的制備：（1）量取10mL牛奶置于25mL刻度試管中，水浴中加熱至40℃（約5min）。（2）在攪拌下慢慢加入10mL預(yù)熱至40℃的乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH4.6）。用精密試紙調(diào)pH值至4.7-4.8（可選擇1%氫氧化鈉或10%乙酸溶液進(jìn)行調(diào)整，注意：緩慢滴加）。40℃保溫10min，使沉淀完全。（3）將上述懸浮液冷卻至室溫。2000r/min離心5min，棄去上清液。第8頁(yè)/共13頁(yè)9四、實(shí)驗(yàn)步驟1、酪蛋白的制備：（3）往沉淀物中加入5mL蒸餾水，混勻后2000r/min離心5min，棄去上清液。（4）將洗凈的沉淀物加入3mL無(wú)水乙醇，混勻后2000r/min離心5min，棄去上清液，得到酪蛋白粗制品。（5）將沉淀物全部攤開在已稱過(guò)重的濾紙上，置于25℃烘箱中烘干。

（6）準(zhǔn)確稱重，計(jì)算牛乳中酪蛋白含量（g/10mL）,并與理論含量為3.5g/100mL牛乳相比較，求出實(shí)際得率。第9頁(yè)/共13頁(yè)10四、實(shí)驗(yàn)步驟2、酪蛋白溶解度的鑒定：

取6支15mL試管，分別加入蒸餾水、10%氯化鈉、0.5%碳酸鈉、0.1mol/L氫氧化鈉、0.2%鹽酸及飽和氫氧化鈣各1mL。于每管中加入少量相同質(zhì)量的酪蛋白粉末（25℃烘箱中烘干的酪蛋白粉末），不斷搖蕩，觀察并記錄各管中酪蛋白的溶解度。第10頁(yè)/共13頁(yè)11四、實(shí)驗(yàn)步驟3、酪蛋白的顏色反應(yīng)（雙縮脲反應(yīng)）：此步驟由教師演示：取少量尿素結(jié)晶，放入干燥的試管，微火加熱使尿素熔化，熔化的尿素開始硬化時(shí)停止加熱，尿素放出氮，形成雙縮脲。冷卻后，加入1mL雙縮脲溶液，振蕩，觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。[制備雙縮脲+雙縮脲溶液（1%CuSO4+酒石酸加納+1%KOH）=紫紅色]向1支15mL試管中加入少量酪蛋白溶液，加入1mL雙縮脲溶液，隨加隨搖，觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。

[制備酪蛋白+雙縮脲溶液（1%CuSO4+酒石酸加納+1%KOH）=？]第11頁(yè)/共13頁(yè)121、酪蛋白含量（g/mL）=酪蛋白g/10mL2、酪蛋白得率=測(cè)定含量/理論含量×100%五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果、計(jì)算與分析

結(jié)果二：酪蛋白的溶解度鑒定：1.酪蛋白溶于哪些溶液？蒸餾水、10%氯化鈉、0.5%碳酸鈉、0.1mol/L氫氧化鈉、0.2%鹽酸及飽和氫氧化鈣（表格形式，狀態(tài)：不溶解，部分溶解，全部溶解）結(jié)果一：酪蛋白的制備：牛乳