四、層析（一）、層析的由來與發(fā)展

1901年，俄國植物學(xué)家茨維特將植物色素提取液加到裝有碳酸鈣微粒的玻璃柱子上部，繼而以石油醚淋洗柱子，結(jié)果使不同的色素在柱中得到分離而形成不同顏色的譜帶?；旌仙赝ㄟ^碳酸鈣微粒被分離成不同色帶的現(xiàn)象，像一束光線通過棱鏡時被分離成不同色帶的光譜現(xiàn)象一樣。1906年在一篇論文中將這種方法正式命名為色譜法，色譜法由此得名。1931Kuhn,Lederer用氧化鋁和碳酸鈣分離α-、β-和δ-胡蘿卜素。使色譜法開始為人們所重視。1938Izmailov,Shraiber最先使用薄層色譜法。1938Taylor,Uray用離子交換色譜法分離了鋰和鉀的同位素。1941Martin,Synge提出色譜塔板理論；發(fā)明液-液分配色譜；預(yù)言了氣體可作為流動相（即氣相色譜）。1944Consden等發(fā)明了紙色譜。1949Macllean在氧化鋁中加入淀粉黏合劑制作薄層板使薄層色譜進入實用階段。1952Martin,James從理論和實踐方面完善了氣-液分配色譜法。1956VanDeemter等提出色譜速率理論，并應(yīng)用于氣相色譜。1957

基于離子交換色譜的氨基酸分析專用儀器問世。1958Golay發(fā)明毛細(xì)管柱氣相色譜。層析分離法基本原理9在色譜操作中，加入洗脫劑而使各組分分層的操作稱為展開（Development），洗脫時從柱中流出的溶液稱為洗脫液（Eluate），而展開后各組分的分布情況稱為色譜（Chromatography）。2、層析方法的共同特點：層析分離體系都有流動相和固定相兩個相。層析過程中，流動相對固定相作連續(xù)的相對運動。被分離樣品在兩相中具有不同的作用力，各組分混合物在流動相的帶動下通過固定相，實現(xiàn)分離。1.固定相：層析基質(zhì)2.流動相：洗脫劑(柱層析）、展層劑（薄層層析）3.操作容量：在特定條件下，某種成分與基質(zhì)反應(yīng)達到平衡時，存在于基質(zhì)上的飽和容量。一般以每克基質(zhì)結(jié)合某種成分的mmol數(shù)或mg數(shù)表示。固定相流動相（二）常用術(shù)語4.床體積：膨脹后基質(zhì)在層析柱中所占有的體 積（Vt）。5.洗脫體積：某一成分從柱頂部到底部的洗脫液 中出現(xiàn)，濃度達到最大值時流動相的體積。6.膨脹度：單位重量的基質(zhì)充分溶脹后所占有的 體積（Vβ）。7.分配系數(shù)和遷移率K＝在固定相中的含量在流動相中的含量Rf＝在固定相中移動的距離在流動相中移動的距離外水體積Vo洗脫體積Ve固定相層析床床體積＝外水體積＋基質(zhì)體積＋內(nèi)水體積

Vt＝Vo＋Vg＋Vi在洗脫過程中，柱內(nèi)不斷地發(fā)生解吸、吸附，再解吸、再吸附的過程。經(jīng)過一段時間以后，該物質(zhì)會向下移動一定距離。此距離的長短與吸附劑對該物質(zhì)的吸附力以及溶劑對該物質(zhì)的解吸(溶解)能力有關(guān)。1、洗脫原理吸附柱層析成敗的關(guān)鍵是選擇合適的吸附劑、洗脫劑和操作方式。（1）羥基磷灰石

羥基磷灰石[Ca5(PO4)3OH2，簡稱HA]的吸附容量高，穩(wěn)定性好(在T＜85℃，pH5.5-10.0均可使用)，因此在制備及純化蛋白質(zhì)、酶、核酸、病毒和其它生命物質(zhì)方面得到了廣泛的應(yīng)用。有時有些樣品如RNA、雙鏈DNA、單鏈DNA和雜合型雙鏈DNA-RNA等，經(jīng)過一次HA柱層析，就能達到有效的分離。

HA的Ca2+基團和生物分子表面的負(fù)電荷基團的相互作用，在用HA分離生物分子過程中起著重要作用。而HA的PO43-基團與生物分子表面的正電荷基團的相互作用，則僅起著次要的作用。使用HA作為固定相基質(zhì)的注意事項：

(1)HA系干粉時，要先在蒸餾水中浸泡，使其膨脹度(水化后所占有的體積)達到2-3mL/克后，再按1∶6體積加入緩沖液懸浮，以除去細(xì)小顆粒；

(2)HA懸浮液須用旋渦振蕩器混合，若用磁棒或玻棒攪拌時，HA的晶體結(jié)構(gòu)會被破壞；

(3)忌用檸檬酸緩沖液和pH＜5.5的緩沖液。

(4)就操作容量來說，一般細(xì)顆粒HA比粗的大。而從分辨率比較，粗顆粒HA也沒有細(xì)的好。（2）硅膠是最常用的吸附劑，通常用SiO2.xH2O表示，是具有硅氧交聯(lián)結(jié)構(gòu)，表面有許多硅醇基的多孔性微粒。硅醇基可與極性化合物或不飽和化合物形成氫鍵而使硅膠具較強的吸附力。水能與硅膠表面羥基結(jié)合而使其失去活性，經(jīng)加熱可被除去的水稱自由水，若自由水含量達17%以上，則吸附力極低，此時，硅膠只能用于分配層析。若將硅膠在105-110℃加熱30min，吸附能力顯著增強，這一過程稱為活化。如果將硅膠加熱到500℃，硅醇基結(jié)構(gòu)會變成硅氧烷結(jié)構(gòu)，吸附能力顯著下降。硅膠具有微酸性，適用于分離酸性和中性物質(zhì)，如有機酸、氨基酸、甾體等。（3）氧化鋁

分酸性、堿性和中性三種，酸性氧化鋁(pH4-5)適合于分離酸性化合物，堿性氧化鋁(pH9-10)適合于分離堿性化合物，中性氧化鋁(pH7)適合于分生物堿、揮發(fā)油、萜類、甾體及在酸、堿中不穩(wěn)定的甙類、酯類等化合物。氧化鋁用前也需脫水活化，通常于400℃高溫下加熱6h，使氧化鋁的含水量在0%-3%之間，可得到Ⅰ級或Ⅱ級氧化鋁，但溫度過高也會破壞氧化鋁的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。4.大孔吸附樹脂和聚酰胺近年用于中藥活性成分的分離。

活性氧化鋁

氧化鋁空心球

氧化鋁粉高溫氧化鋁氧化鋁絲

（1）層析柱層析柱是下端有細(xì)口并帶有篩板的玻管。柱的直徑與長度之比，一般為1∶10-1∶40。采用極細(xì)吸附劑裝柱時，宜用比例大的層析柱。反之，則宜用比例小的層析柱。這樣有利于節(jié)省時間和提高分辨率。層析柱的床體積是由吸附劑的量和膨脹度決定的。（2）吸附劑的用量

吸附劑的用量是根據(jù)其自身的操作容量和分離物中各成分的性質(zhì)決定的。當(dāng)操作容量高時，吸附劑用量少。一般吸附劑的用量為被分離樣品的30-50倍。若樣品中各成分的性質(zhì)相似難以分開時，則吸附劑用量應(yīng)增大，有時大于樣品的100倍（3）裝柱

裝柱的方法分干裝法和濕裝法兩種。濕裝法系先加適量平衡液到柱內(nèi)，排走其中的空氣，然后把預(yù)先用平衡液浸泡好的吸附劑攪勻，隨即將此懸浮液連續(xù)傾入柱中，待其自然沉降至柱高的1/4-1/3時打開柱下端口，讓溶劑慢慢流出，使柱上端懸浮液徐徐下降至需要的高度。這種裝柱法對各種基質(zhì)都適用。層析柱中基質(zhì)應(yīng)合乎填裝均勻、松緊一致和沒有氣泡的標(biāo)準(zhǔn)。

（4）上樣和洗脫

上樣：用滴管輕輕地把樣品溶液加到固定相表面，要盡量避免沖動基質(zhì)。加入樣品液的體積一般應(yīng)小于床體積的1/2。洗脫：待樣品液的液面流到固定相表面時，用滴管加入洗脫劑，并在柱上端與裝有洗脫劑的貯液瓶連接開始冼脫。同時在柱下端與部分收集器接通，立即進行分級收集(按體積或時間分管收集)。理想的洗脫曲線如圖3-1所示。圖中的A峰和B峰均呈對稱形，二者沒有重疊，這表明樣品液中的組分已完全分開。層析峰的面積(FEG)、峰高(BE)和半峰高寬度(HI)等參數(shù)是定性、定量洗脫物的依據(jù)。

為了獲得滿意的分離結(jié)果，洗脫液的流速務(wù)必恰當(dāng)控制。如果太快，洗脫物在兩相中的平衡過程不完全；如果太慢，洗脫物會擴散。若峰與峰之間有重疊，宜降低洗脫劑的離子強度，若峰間距離