微生物實驗二第1頁/共53頁內(nèi)容提要

一.內(nèi)毒素（LPS）的檢測

二.腸道致病菌的分離培養(yǎng)

三.細菌在自然界的分布及理化因素對細菌生長的影響第2頁/共53頁（一）內(nèi)毒素的檢測

目的1掌握內(nèi)毒素實驗的原理和操作方法。2熟悉內(nèi)毒素實驗的意義。第3頁/共53頁檢測內(nèi)毒素的方法有家兔發(fā)熱法和鱟（hòu）實驗法，家兔發(fā)熱法比較煩瑣，且靈敏度不高，故現(xiàn)在多用鱟實驗法，鱟實驗法靈敏度高，可檢測小于10ng/ml的內(nèi)毒素。第4頁/共53頁第5頁/共53頁第6頁/共53頁內(nèi)毒素生物學(xué)活性：致熱作用、白細胞反應(yīng)、感染性休克和DIC等。原理：鱟是一種海洋節(jié)肢動物，其血液中含有一種有核變形細胞，這種細胞的胞漿中含有凝固酶原和凝固蛋白原。

內(nèi)毒素（LPS）

激活

凝固蛋白原凝固蛋白

（溶解狀態(tài)）

（凝膠狀態(tài)）凝固酶原凝固酶第7頁/共53頁材料：

鱟試劑

內(nèi)毒素試劑

鱟試劑專用溶解水

無菌無熱源質(zhì)吸管第8頁/共53頁方法：

（每4個人一組，兩支鱟試劑，一支實驗一支對照）

1.取兩支鱟試劑打開，分別加入0.1ml鱟試劑溶解水，使之溶解2.其中一支加入0.1ml內(nèi)毒素，標記上實驗組，另一支加入0.1ml溶解水，作為對照3.垂直放入37℃溫箱，20--30分鐘觀察結(jié)果結(jié)果：

實驗組出現(xiàn)凝固，對照組不出現(xiàn)凝固第9頁/共53頁內(nèi)毒素檢測的應(yīng)用：

（1）檢測輸液用品或生物制品中是否含有內(nèi)毒素（2）臨床上檢測患者是否有革蘭氏陰性菌感染引起的內(nèi)毒素血癥（內(nèi)毒素休克）等第10頁/共53頁二.腸道致病菌的分離培養(yǎng)2學(xué)時第11頁/共53頁

一.常見培養(yǎng)基的特性及用途二.致病性腸道桿菌的生物學(xué)性狀三.分離培養(yǎng)方法

腸道細菌的分離培養(yǎng)第12頁/共53頁一、培養(yǎng)基

概念:是人工配制的專供微生物生長繁殖的混合營養(yǎng)物

制品。

成分：充足的營養(yǎng)物質(zhì)（水分、碳源、氮源、無機鹽）；合適的PH，適宜的溫度；適宜的氣體

環(huán)境。

用途：用于微生物的繁殖及分離接種，傳代或保存，鑒別微生的類屬，研究微生物的生理及生化特性，制造菌苗、疫苗或其他微生物制劑等。第13頁/共53頁二、分類主要用于增菌用于檢測動力及保存菌種用于分離鑒定細菌第14頁/共53頁雙糖鐵培養(yǎng)基S-S培養(yǎng)基普通瓊脂培養(yǎng)基血液瓊脂培養(yǎng)基

庖肉培養(yǎng)基第15頁/共53頁培養(yǎng)基的制備程序調(diào)配過濾矯正pH（7.0-7.6） 分裝過濾滅菌（121.3℃，20-30分鐘）鑒定是否有菌放入冰箱冷藏備用因高壓之后pH值會下降0.1左右，所以矯正pH時應(yīng)比所需的pH高鑒定是否有菌可將培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)24小時，然后觀察第16頁/共53頁肉湯培養(yǎng)基制作方法1.將已去筋膜及脂肪并經(jīng)絞碎的鮮牛肉50克，加蒸餾水100ml，放入冰箱中過夜。2.加熱煮沸半小時至一小時后，用數(shù)層紗布或濾紙過濾，濾液用蒸餾水補足其量為100ml。3.于濾液中加入氯化鈉0.5克，蛋白胨1克，磷酸氫二鉀0.1克，加熱使之完全溶化。第17頁/共53頁4.測定酸堿度并調(diào)至pH7.6，必要時用濾紙過濾。5.按需要分裝于試管或燒瓶內(nèi)，加棉塞，置高壓蒸汽滅菌器內(nèi)，經(jīng)121.3℃、20-30分鐘滅菌。6.滅菌后置37℃溫箱孵育24小時，無雜菌生長，即可應(yīng)用或放冰箱備用。第18頁/共53頁液體培養(yǎng)基加入1-2%的瓊脂為固體培養(yǎng)基，加入0.5%瓊脂為半固體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基加入血液即為血平板（營養(yǎng)培養(yǎng)基）。第19頁/共53頁血液瓊脂培養(yǎng)基（血平板）在普通瓊脂培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入血液制備而成,是最常用的營養(yǎng)培養(yǎng)基,可供營養(yǎng)要求較高的細菌生長.常用于分離培養(yǎng)和溶血現(xiàn)象觀察.第20頁/共53頁含有膽酸鹽抑制G+,枸櫞酸鈉和煌綠能抑制大腸桿菌,致病的沙門菌和志賀菌能大量生長.含有中性紅指示劑和乳糖,中性紅遇酸變粉紅.常用于培養(yǎng)腸道致病菌.SS培養(yǎng)基（Salmonella-ShigellaMediun）

第21頁/共53頁SS培養(yǎng)基第22頁/共53頁腸道桿菌的生物學(xué)性狀埃希菌屬：大腸埃希菌沙門菌屬：傷寒沙門菌

甲型、乙型副傷寒沙門菌志賀菌屬：痢疾志賀菌腸桿菌科重要菌屬及代表菌種第23頁/共53頁1大腸桿菌:

生物學(xué)性狀:G-

鏡下為桿狀，多數(shù)菌株有周鞭毛，菌毛，無芽孢，兼性厭氧

營養(yǎng)要求不高,可在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長，發(fā)酵葡萄糖等,產(chǎn)酸產(chǎn)氣

最適宜溫度為37度,最適宜pH為7.4腸道桿菌的生物學(xué)性狀第24頁/共53頁菌落特點：

圓形，凸起，灰白色，表面光滑，濕潤，直徑2-3mm第25頁/共53頁腸產(chǎn)毒型大腸桿菌（輕度腹瀉，腸毒素，

定植因子）腸侵襲型大腸桿菌（與志賀菌相關(guān)，與菌痢相似

里急后重，不產(chǎn)生腸毒素）腸致病型大腸桿菌（最早發(fā)現(xiàn)的引起腹瀉的

大腸桿菌，嬰幼兒）腸出血型大腸桿菌（出血性結(jié)腸炎和溶血性

尿毒綜合征的病原體，

輕度水瀉伴劇烈腹痛血便，

常見食品污染）腸集聚型大腸桿菌（嬰兒和旅行者持續(xù)水樣腹瀉

偶有血便，不侵襲細胞，

在細胞表面自動聚集，形成

磚樣排列）分類：（胃腸炎）第26頁/共53頁（2）傷寒桿菌生物學(xué)特性:G-鏡下為桿狀,有菌毛，除個別外都有周鞭毛，一般無莢膜，均無芽孢。兼性厭氧，營養(yǎng)要求不高,不發(fā)酵乳糖或者蔗糖，對葡萄糖，麥芽糖，甘露糖發(fā)酵，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，其他沙門菌產(chǎn)酸產(chǎn)氣，可在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長最適宜溫度為37度,最適宜pH為7.4第27頁/共53頁菌落特點:

圓形,凸起,無色，細小，半透明,表面光滑,濕潤,直徑2-3mm.第28頁/共53頁1、相似的形態(tài)染色—從形態(tài)上無法區(qū)別

中等大小的G-桿菌

多有鞭毛、菌毛腸道桿菌的生物學(xué)性狀第29頁/共53頁2、活潑的生化反應(yīng)腸道桿菌的生物學(xué)性狀乳糖發(fā)酵試驗初步鑒別腸道致病菌和腸道非致病菌腸道致病菌腸道非致病菌多數(shù)不發(fā)酵乳糖多數(shù)發(fā)酵乳糖第30頁/共53頁腸道桿菌的生物學(xué)性狀-/+-+傷寒桿菌--+痢疾桿菌-

⊕

⊕大腸桿菌硫化氫乳糖葡萄糖菌名第31頁/共53頁

將糞便標本以分區(qū)劃線法接種到SS培養(yǎng)基。(每個實驗室8個平板）(接種好后，做好標記，用膠布按班綁好)放入37℃溫箱中培養(yǎng)24小時。取出放4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。分離培養(yǎng)方法第32頁/共53頁三、消毒滅菌（2學(xué)時）1.細菌在自然界的分布及理化因素

對細菌的影響2.高壓蒸汽滅菌法第33頁/共53頁空氣中細菌的檢查（每個班1個平皿）

原理：根據(jù)空氣中攜帶有微生物氣溶膠（以固體或液體微小顆粒分散于空氣中的分散體系稱為氣溶膠，其中的氣體是分散介質(zhì)）粒子在地心引力的作用下，以垂直的自然方式沉降到瓊脂培養(yǎng)基上。

方法：在室內(nèi)選擇一處放一個平皿。揭開皿蓋，皿蓋扣置于皿底下，暴露放置15min，即蓋上皿蓋，放入37℃

培養(yǎng)24小時，觀察結(jié)果。1.1細菌在自然界的分布第34頁/共53頁1.2.1紫外線對細菌的影響（每個實驗室1個培養(yǎng)皿）原理：紫外線主要作用于DNA，使一條DNA鏈上的兩個相鄰胸腺嘧啶以共價鍵結(jié)合成二聚體，從而干擾DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致細菌變異或死亡。對病毒也有破壞作用。

紫外線殺菌作用強，而穿透能力弱。普通玻璃、紙張、水蒸氣、塵埃等均能阻擋。紫外線中波長為240-300nm者具有殺菌能力，其中265-266nm的殺菌作用最強。常用于消毒物體表面，手術(shù)室無菌實驗室，傳染病房的空氣消毒及不耐熱物品消毒。1.2理化因素對細菌的影響第35頁/共53頁紫外線對細菌的影響

取一個平皿，用密涂法將細菌涂布于培養(yǎng)皿中，然后按圖所示揭開平皿蓋，置于紫外線下照射30分鐘，然后蓋好蓋子，置37℃培養(yǎng)24h后取出觀察結(jié)果。第36頁/共53頁

1促進菌體蛋白質(zhì)變性或凝固。2干擾細菌酶系統(tǒng)和代謝。3損傷細菌的細胞膜，影響細菌的化學(xué)組成，物理

結(jié)構(gòu)和生理活動，從而發(fā)揮防腐、消毒至滅菌作用。

1.2.2化學(xué)消毒劑對細菌的影響第37頁/共53頁

有些化學(xué)藥品濃度高時能殺滅病原微生物，

稱為化學(xué)消毒劑；濃度低時能抑制細菌生長，稱為防腐劑；

（只能外用，對細菌的敏感性不同）化學(xué)消毒劑對細菌的影響第38頁/共53頁化學(xué)消毒劑分類1高效消毒劑：殺滅細菌芽孢在內(nèi)的所有微生物，適用于不

耐熱力滅菌但要進入人體內(nèi)部的物品，如內(nèi)

窺鏡等。

次氯酸鈉、過氧化氫、甲醛、環(huán)氧乙烷等2中效消毒劑：不能殺滅芽孢，但能殺滅繁殖體（包括結(jié)核

桿菌），真菌和大多病毒，如喉鏡，麻醉器材

碘酊、乙醇等3低效消毒劑：能殺滅大多細菌繁殖體，但不能殺滅芽孢，

結(jié)核桿菌及某些抵抗力強的真菌和病毒。

新潔爾滅、洗必泰、高錳酸鉀等第39頁/共53頁影響消毒滅菌的因素1微生物的種類2微生物的污染程度3環(huán)境中的有機物4消毒劑的性質(zhì)、濃度與作用時間5溫度、濕度、酸堿度6化學(xué)拮抗物第40頁/共53頁化學(xué)消毒劑對細菌的影響方法：取一普通平皿培養(yǎng)基，一部分寫上“前”，另一部分寫上“后”，然后將手指在寫有“前”的部分沾一下，再將手指用酒精進行消毒，在寫有“后”的部分沾一下。放入37℃溫箱培養(yǎng)24小時后觀察。

（每個實驗室2個平皿）第41頁/共53頁方法：用“打咳法”進行檢查。取一個血瓊脂平皿培養(yǎng)基（咽喉部多為葡萄球菌），打開平皿蓋，對著平皿咳嗽幾次（口腔前約10厘米），然后放入37℃溫箱培養(yǎng)24小時后觀察菌落數(shù)量及特征。

咽喉部細菌的檢查第42頁/共53頁2高壓蒸氣滅菌法

原理：蒸汽被限制在密閉容器內(nèi)，隨著熱力的作用壓力不斷升高，蒸汽的溫度也相應(yīng)升高，在103.4kPa蒸汽壓力下時，溫度可達121.3℃。維持15~20分鐘后可殺死細菌包括芽孢在內(nèi)的所有微生物。第43頁/共53頁高壓蒸氣滅菌器1)構(gòu)造

高壓蒸氣滅菌器是一個雙層的金屬圓筒，兩層之間盛水，外層堅厚，其上或前方有金屬厚蓋。蓋旁附有螺旋，借以緊閉蓋門，使蒸氣不能外溢。

高壓蒸氣滅菌器上裝有排氣閥、安全閥，以調(diào)節(jié)器內(nèi)壓力，裝有的溫度計及壓力表以示內(nèi)部溫度和壓力。

器內(nèi)裝有帶孔的金屬擱板，用以放置欲滅菌對象。第44頁/共53頁高壓蒸汽滅菌法壓力：1.05kg/㎡

或103.425KPa溫度:

121.3℃時間：15-20min完全殺滅細菌的繁殖體和芽孢用途：適用于耐高溫、高壓，不怕潮濕的物品，

如敷料、手術(shù)器械、藥品、細菌培養(yǎng)基等第45頁/共53頁全自動高壓蒸汽滅菌鍋第46頁/共53頁SystecD-2002D雙