細(xì)菌芽孢染色及酵母菌的觀察-山東大學(xué)山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告2011年11月2日姓名 ** 班級(jí) ********** 學(xué)號(hào) ***************** 同組者：***************************科目 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 題目 細(xì)菌芽孢染色 及酵母菌的觀察 組別 ***細(xì)菌芽孢染色及酵母菌的觀察【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)習(xí)芽孢染色法，了解芽孢的形態(tài)特征；觀察酵母形態(tài)及出芽方式，區(qū)分酵母菌的死活細(xì)胞；學(xué)習(xí)酵母子囊孢子的觀察方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】A、細(xì)菌芽孢染色的基本原理芽孢是芽孢桿菌屬和梭菌屬細(xì)菌生長(zhǎng)到一定階段形成的一種抗逆性很強(qiáng)的休眠體結(jié)構(gòu)，也被稱為內(nèi)生孢子，通常呈圓形或橢圓形。細(xì)菌能否形成芽孢及芽孢的形狀，著生位置、芽孢囊是否膨大等特征都是鑒定細(xì)菌的重要指標(biāo)。與正常細(xì)胞或菌體相比，芽孢壁厚、透性低而不易著色，但是芽孢一旦著色就很難被脫色。利用這一特點(diǎn)，首先用著色能力較強(qiáng)的染料，如孔雀綠，在加熱條件下進(jìn)行染色時(shí)，此染料不僅可以進(jìn)入菌體，而且也可以進(jìn)入芽孢，進(jìn)入菌體的染料可經(jīng)水洗脫色，而進(jìn)入芽孢的染料則難以透出。再用對(duì)比度大的復(fù)染劑（如番紅第2 頁共19 頁 微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告· **山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告2011年11月2日姓名 ** 班級(jí) ********** 學(xué)號(hào) ***************** 同組者：***************************科目 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 題目 細(xì)菌芽孢染色 及酵母菌的觀察 組別 ***液）染色后，菌體染上復(fù)染劑顏色，而芽孢仍為原來的顏色，這樣就可以將兩者區(qū)別開來。在不同細(xì)菌中，芽孢所處的位置不同，有的在中部，有的在偏端，有的在頂端。芽孢一般呈圓形、橢圓形、圓柱形。常見的細(xì)菌芽孢形態(tài)和著生位置如下圖所示：B、酵母菌形態(tài)及出芽方式觀察的基本原理酵母菌是一群?jiǎn)渭?xì)胞的真核微生物。這個(gè)詞語也是無分類學(xué)意義的普通名稱，通常用于以裂殖或芽殖來進(jìn)行無性繁殖的各種單細(xì)胞真菌。由于不同的酵母菌在進(jìn)化和分類地位上的異源性，因此很難對(duì)酵母菌下一個(gè)確切的定義，通常認(rèn)為，酵母菌具有以下5個(gè)特點(diǎn)：①個(gè)體一般以單細(xì)胞狀態(tài)存在；②多數(shù)營(yíng)出芽繁殖；③能發(fā)酵糖類產(chǎn)能；④細(xì)胞壁常含甘露聚糖；⑤常生活在含糖第3 頁共19 頁 微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告· **山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告2011年11月2日姓名 ** 班級(jí) ********** 學(xué)號(hào) ***************** 同組者：***************************科目 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 題目 細(xì)菌芽孢染色 及酵母菌的觀察 組別 ***類較高、酸度較大的水生環(huán)境中。單細(xì)胞的酵母菌個(gè)體是常見細(xì)菌的幾倍甚至幾十倍，可在40倍顯微鏡下經(jīng)過簡(jiǎn)單染色直接觀察。酵母菌大多數(shù)采取出芽方式進(jìn)行無性繁殖，也可以通過結(jié)合產(chǎn)生子囊孢子，進(jìn)行有性繁殖。由于細(xì)胞個(gè)體大，采取涂片的方法制片有可能損傷細(xì)胞，一般通過美藍(lán)染液水浸片法來觀察酵母菌活體形態(tài)及出芽生殖方式。出芽繁殖是酵母菌進(jìn)行無性繁殖的主要方式。成熟的酵母菌細(xì)胞，先長(zhǎng)出一個(gè)小芽，芽細(xì)胞長(zhǎng)到一定程度，脫離母細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)，爾后形成新個(gè)體。有多邊出芽、兩端出芽、和三邊出芽。第4 頁共19 頁 微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告· **山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告2011年11月2日姓名 ** 班級(jí) ********** 學(xué)號(hào) ***************** 同組者：***************************科目 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 題目 細(xì)菌芽孢染色 及酵母菌的觀察 組別 ***酵母菌不同類同時(shí)，采用美藍(lán)染液水浸片法還可以對(duì)酵母菌的死、活細(xì)胞進(jìn)行鑒別。美藍(lán)對(duì)細(xì)胞無毒，其氧化型呈藍(lán)色，還原型無色。由于新陳代謝，活細(xì)胞胞內(nèi)有較強(qiáng)還原能力，使美藍(lán)由藍(lán)色氧化型變成無色的還原型，染色后活細(xì)胞呈無色。死細(xì)胞或代謝能力微弱的衰老細(xì)胞還原能力弱，染色后細(xì)胞呈藍(lán)色或淡藍(lán)色。C、酵母菌子囊孢子觀察的基本原理子囊類酵母菌是以接合產(chǎn)生形成子囊和子囊孢子的方式進(jìn)行有性繁殖的。它們一般通過鄰近的兩個(gè)形態(tài)相同而性別不同的細(xì)胞各自伸出一根管狀的原生質(zhì)突起相互接觸、局部融合并形成一條通道，再通過質(zhì)、核配和減數(shù)分裂形成4或8個(gè)子核，然后它們各自與周圍的原生質(zhì)結(jié)合在一起，再在其表面形成一層孢子壁，這些一個(gè)個(gè)子囊孢子就成熟了，而原有的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞則成了子囊。能否形成子囊孢子及其形態(tài)是酵母菌分類鑒定的重要依據(jù)之一。酵母菌形成子囊孢子需一定條件，其中麥?zhǔn)吓嗟? 頁共19 頁 微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告· **山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告2011年11月2日姓名 ** 班級(jí) ********** 學(xué)號(hào) ***************** 同組者：***************************科目 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 題目 細(xì)菌芽孢染色 及酵母菌的觀察 組別 ***養(yǎng)基有利于釀酒酵母子囊孢子的形成。孢子壁厚不易著色，但是一旦著色就很難被脫色。因此先用強(qiáng)染色劑（孔雀綠）下染色，使染料進(jìn)入菌體和孢子，水洗時(shí)菌體中染色被洗脫而孢子中染料保留。在用對(duì)比度大的復(fù)染色劑染色后，菌體染上復(fù)染色劑的顏色而孢子保留原來顏色，這樣可將兩者區(qū)別開來?！緦?shí)驗(yàn)器材】1、菌種：枯草芽孢桿菌，梭狀芽孢桿菌,釀酒酵母7d麥?zhǔn)希óa(chǎn)孢培養(yǎng)基）液體培養(yǎng)物，釀酒酵母斜面培養(yǎng)物。2、溶液和試劑：0.01%美藍(lán)水溶液，5%孔雀綠水溶液，0.5%番紅水溶液，95%乙醇，蒸餾水等。香柏油、二甲苯3、儀器及其它用品：普通光學(xué)顯微鏡、擦鏡紙、綢布、酒精燈、載玻片、接種針、培養(yǎng)皿等【操作步驟】第6 頁共19 頁 微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告· **山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告2011年11月2日姓名 ** 班級(jí) ********** 學(xué)號(hào) ***************** 同組者：***************************科目 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 題目 細(xì)菌芽孢染色 及酵母菌的觀察 組別 ***細(xì)菌芽孢染色的基本原理實(shí)驗(yàn)流程圖：涂片加熱干燥固定孔雀綠覆蓋詳細(xì)步驟：涂片，加熱干燥及固定

番紅水洗復(fù)染水洗冷卻干燥微熱5min 鏡檢在潔凈蓋玻片接近中部?jī)商幏謩e滴一滴無菌水，分別接種枯草芽孢桿菌及梭狀芽孢桿菌。然后按照常規(guī)方法加熱干燥及固定；孔雀綠加熱染色用木夾夾住載玻片，向載玻片上滴加5%孔雀綠水溶液使之完全覆蓋涂菌部位，然后在酒精燈上微微加熱（孔雀綠著色能力強(qiáng)，加熱可使較難染色的芽孢染成綠色，且再難洗脫）至染液冒蒸汽開始計(jì)時(shí)并維持5min，注意加熱時(shí)應(yīng)以有蒸汽微微冒出為宜，過熱或第7 頁共19 頁 微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告· **山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告2011年11月2日姓名 ** 班級(jí) ********** 學(xué)號(hào) ***************** 同組者：***************************科目 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 題目 細(xì)菌芽孢染色 及酵母菌的觀察 組別 ***加熱不足均會(huì)影響觀察效果，且加熱時(shí)在載玻片上隨時(shí)補(bǔ)加染液，切勿讓涂片干涸；水洗水洗一定要等載玻片冷卻后進(jìn)行，否則可能導(dǎo)致載玻片的破裂。具體水洗按常規(guī)方法進(jìn)行；復(fù)染用0.5%番紅水溶液復(fù)染2min；水洗并干燥按常規(guī)方法水洗后自然干燥；鏡檢先在低倍鏡下尋找視野范圍，然后換用高倍鏡調(diào)焦，最后加香柏油在油鏡下仔細(xì)尋找兩種細(xì)菌以及其周圍或內(nèi)部染成綠色的芽孢。酵母菌形態(tài)及出芽方式觀察的基本原理實(shí)驗(yàn)流程圖：滴加加蓋鏡檢接種玻片放置美蘭2.詳細(xì)步驟：涂片第8 頁共19 頁 微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告· **山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告2011年11月2日姓名 ** 班級(jí) ********** 學(xué)號(hào) ***************** 同組者：***************************科目 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 題目 細(xì)菌芽孢染色 及酵母菌的觀察 組別 ***在潔凈蓋玻片中部滴一滴0.01%美藍(lán)水溶液，按常規(guī)方法接種酵母加蓋玻片加蓋玻片時(shí)首先使蓋玻片的一端接觸載玻片上的液滴的一端，然后再將另一端緩緩放下，目的是防止氣泡的產(chǎn)生，以免影響觀察；放置及鏡檢從接種開始計(jì)時(shí)，放置3min，然后在高倍鏡（×40）下觀察酵母菌的形態(tài)，根據(jù)染色狀態(tài)判斷酵母菌的死活（由于新陳代謝，活細(xì)胞胞內(nèi)有較強(qiáng)還原能力，使美藍(lán)由藍(lán)色氧化型變成無色的還原型，染色后活細(xì)胞呈無色。死細(xì)胞或代謝能力微弱的衰老細(xì)胞還原能力弱，染色后細(xì)胞呈藍(lán)色或淡藍(lán)色），尋找并觀察酵母菌不同類型的出芽方式（一端出芽或兩端出芽） 。將酵母菌美蘭浸片放置30min，再用高倍鏡（×40）觀察，根據(jù)染色狀態(tài)判斷酵母菌的死活，并與3min時(shí)的情況做一對(duì)比說明。酵母菌子囊孢子的觀察實(shí)驗(yàn)流程圖：第9 頁共19 頁 微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告· **山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告2011年11月2日姓名 ** 班級(jí) ********** 學(xué)號(hào) ***************** 同組者：***************************科目 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 題目 細(xì)菌芽孢染色 及酵母菌的觀察 組別 ***涂片番紅復(fù)水洗干燥固 乙醇脫 水洗干定 色 燥孔雀綠水洗鏡檢熱染詳細(xì)步驟：涂片，加熱干燥及固定在潔凈蓋玻片中央滴一滴無菌水，接種液體培養(yǎng)物（產(chǎn)孢培養(yǎng)基）中的釀酒酵母，然后按照常規(guī)方法加熱干燥及固定；孔雀綠熱染，水洗c)d)

按照上面芽孢染色法中孔雀綠熱染的操作將涂菌部位用孔雀綠熱染2.5min，然后水洗；乙醇脫色，水洗用95%乙醇對(duì)涂菌部位覆蓋脫色30s，然后水洗；番紅復(fù)染，水洗及干燥用0.5%番紅水溶液對(duì)涂菌部位復(fù)染 30s～1min，然第10 頁共19 頁 微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告· **山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告2011年11月2日姓名 ** 班級(jí) ********** 學(xué)號(hào) ***************** 同組者：***************************科目 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 題目 細(xì)菌芽孢染色 及酵母菌的觀察 組別 ***后水洗，自然干燥；鏡檢將裝片置于顯微鏡下，先用低倍鏡尋找到觀察部位，再用油鏡觀察。（可在酵母菌細(xì)胞旁觀察到1~4個(gè)同時(shí)存在的子囊孢子）【實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析】繪圖繪圖說明枯草芽孢桿菌和梭狀芽孢桿菌的形態(tài)特征（包括芽孢形狀、著生位置及芽孢囊形狀等）。繪圖說明染色3～30min的釀酒酵母形態(tài)特征及出芽生殖情況。第11 頁共19 頁 微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告· **山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告2011年11月2日姓名 ** 班級(jí) ********** 學(xué)號(hào) ***************** 同組者：***************************科目 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 題目 細(xì)菌芽孢染色 及酵母菌的觀察 組別 ***實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄芽孢染色結(jié)果記錄表：項(xiàng)目芽孢形狀芽孢著生位置菌種枯草芽孢桿菌橢圓形位于菌體中央或稍偏位于菌體梭狀芽孢桿菌圓形或卵圓形中央，極端或次極端

芽孢囊形狀圓形不膨大膨大呂氏堿性美蘭染液作用時(shí)間與釀酒酵母死、活細(xì)胞數(shù)量變化記錄表：作用時(shí)間每視野活細(xì)胞數(shù)每視野死細(xì)胞數(shù)活細(xì)胞比率

3min30min/個(gè)20170/個(gè)1315493.9%31.2%結(jié)論：由統(tǒng)計(jì)結(jié)果可明顯得到美藍(lán)雖為溫和染色劑，但長(zhǎng)時(shí)間后菌體依然會(huì)被染色劑破壞或缺水第12 頁共19 頁 微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告· **山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告2011年11月2日姓名 ** 班級(jí) ********** 學(xué)號(hào) ***************** 同組者：***************************科目 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 題目 細(xì)菌芽孢染色 及酵母菌的觀察 組別 ***導(dǎo)致大量死亡。酵母菌出芽狀況的說明由下圖（見實(shí)驗(yàn)圖示）可清晰的看到酵母菌不同類型的出芽生殖方式，包括一端出芽，兩端出芽多邊出芽等，觀察效果較為理想。子囊孢子染色由于染色操作以及菌體的原因，未能看到大量四個(gè)聚集在一起的孢子，僅能觀察到一些單個(gè)孢子或兩個(gè)聚合在一起的孢子以及少數(shù)三個(gè)聚合在一起的孢子，通過觀察可明顯得到菌體和孢子囊呈紅色，孢子呈綠色，由紅色孢子囊包裹。總之酵母菌子囊孢子的觀察不是很理想。實(shí)驗(yàn)圖示芽孢(綠)菌體(紅)第13 頁共19 頁 微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告· **山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告2011年11月2日姓名 ** 班級(jí) ********** 學(xué)號(hào) ***************** 同組者：***************************科目 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 題目 細(xì)菌芽孢染色 及酵母菌的觀察 組別 ***圖1梭狀芽孢桿菌芽孢圖示 (10×100) 圖2枯草芽孢桿菌芽孢圖示 (10×100)活死第14 頁共19 頁 微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告· **山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告2011年11月2日姓名 ** 班級(jí) ********** 學(xué)號(hào) ***************** 同組者：***************************科目 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 題目 細(xì)菌芽孢染色 及酵母菌的觀察 組別 ***圖3酵母菌美蘭浸片法圖示（ 3min10×40) 圖4酵母菌美蘭浸片法圖示 （30min10 ×40)第15 頁共19 頁 微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告· **山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告2011年11月2日姓名 ** 班級(jí) ********** 學(xué)號(hào) ***************** 同組者：***************************科目 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 題目 細(xì)菌芽孢染色 及酵母菌的觀察 組別 ***一端多邊兩端圖5酵母菌出芽生殖圖示（10×40）體 子囊孢子（三第16 頁共19 頁 微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告· **山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告2011年11月2日姓名 ** 班級(jí) ********** 學(xué)號(hào) ***************** 同組者：***************************科目 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 題目 細(xì)菌芽孢染色 及酵母菌的觀察 組別 ***圖7酵母菌子囊孢子（三個(gè)）圖示（10×100）圖6酵母菌子囊孢子（單個(gè)及兩個(gè)）圖示（10×100）【思考題】根據(jù)你的觀察結(jié)果，美藍(lán)染液濃度及作用時(shí)間與酵母菌死、活細(xì)胞比例變化是否有關(guān)系？試分析原因。答：有關(guān)系，美藍(lán)濃度越大，作用時(shí)間越長(zhǎng)則視野中死菌比例越大。原因：一是雖然美藍(lán)對(duì)細(xì)胞無毒，但濃度大時(shí)細(xì)胞外滲透壓增大導(dǎo)致細(xì)胞失水，二者細(xì)胞還原能力有限，濃度高或時(shí)間較長(zhǎng)都會(huì)對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)構(gòu)成破壞。第17 頁共19 頁 微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告· **山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告2011年11月2日姓名 ** 班級(jí) ********** 學(xué)號(hào) ***************** 同組者：***************************科目 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 題目 細(xì)菌芽孢染色 及酵母菌的觀察 組別 ***