第十二章

制備型高效液相色譜在生物制藥中的應(yīng)用?

基因工程藥物:白細(xì)胞介素、胰島素。?

天然產(chǎn)物:蛋白質(zhì),多肽,多糖。第一節(jié)

高效液相色譜法簡(jiǎn)介液相色譜的發(fā)展史?

1903年，色譜法問(wèn)世俄國(guó)植物學(xué)家茨維特

1903年3月21日，大會(huì)報(bào)告“一種新型吸附現(xiàn)象及其在生化分析上的應(yīng)用”1906年在德國(guó)植物學(xué)雜志發(fā)表文章，首次命名上述分離后色帶為色譜圖，稱此方法為色譜法?

1931年，庫(kù)恩（Kuhn）分離胡蘿卜素，1938年，Kuhn和Lederer從維生素B中分離出B

，獲得了61938年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。?

1941年，馬?。∕artin）和辛格（Synge）提出液液分配色譜法，1952年度的諾貝爾獎(jiǎng)。?

60年代末，70年代初，高效液相色譜儀的成功研制1.2基本儀器裝置?

輸液系統(tǒng)?

進(jìn)樣系統(tǒng)?

分離系統(tǒng)?

檢測(cè)系統(tǒng)?

數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)2.1

高效液相色譜儀組成高壓輸液泵1輸液系統(tǒng)在線脫氣裝置(1)高壓輸液泵作用：將流動(dòng)相以穩(wěn)定的流速或壓力輸送到色譜系統(tǒng)。輸液泵的穩(wěn)定性直接關(guān)系到分析結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。(1)高壓輸液泵(2)在線脫氣裝置作用：脫去流動(dòng)相中的溶解氣體。流動(dòng)相先經(jīng)過(guò)脫氣裝置再輸送到色譜柱。在線脫氣、超聲脫氣、真空脫氣等脫氣不好時(shí)有氣泡，導(dǎo)致流動(dòng)相流速不穩(wěn)定，造成基線飄移，噪音增加。O

,N

,PressureDampers22CO

…2（3）梯度洗脫裝置Isocratic

elution

恒定組成的單一溶劑體系以一定速度改變多種溶劑的配比淋洗，目的是分離多組容量因子相差較大的組分Gradient

elutionHigh-PressureMixing2進(jìn)樣系統(tǒng)六通閥3色譜柱

Normalcolumn5-m、4.6-m<1mNarrowborecolumn

1-3mMicrocolumn色譜柱是實(shí)現(xiàn)分離的核心部件。要求柱效高、柱容量大和性能穩(wěn)定。柱性能與柱結(jié)構(gòu)、填料特性、填充質(zhì)量和使用條件有關(guān)。色譜柱填料基質(zhì)：載體或擔(dān)體。數(shù)m~數(shù)十m，球形。硅膠或有機(jī)高分子聚合物sphericalandirregularsilicaparticlesMacroporoussphericalsilicaparticle.[K.K.Unger,Poroussilica,Elsevier,1979]Porous

particle3-10mm30-50mPellicular

particle色譜柱填料功能層：物理吸附或化學(xué)鍵合三、高效液相色譜法的特點(diǎn)?

采用高效色譜柱、高壓輸液設(shè)備和高靈敏度檢測(cè)器,從而實(shí)現(xiàn)了高效、高速、高靈敏度和定量準(zhǔn)確。?

和經(jīng)典液相相比有以下優(yōu)點(diǎn)：快速、靈敏度高、分辨率高、自動(dòng)化程度高

等。四、制備型高效液相色譜與分析型高效液相色譜法的區(qū)別?

流速不同?

檢測(cè)池不同?

上樣量不同?

色譜柱不同五、色譜的基本理論及有關(guān)參數(shù)兩大理論：?

塔板理(theplatemodel):闡明了色譜、蒸餾和萃取之間的相似性，將色譜柱設(shè)想成由許多液液萃取單元或理論塔板組成；相似于精餾過(guò)程，色譜分離也是一個(gè)分配平衡過(guò)程.N=16(t

/w

)2RbN=5.54(t

/w

)2R1/2?

速率理:研究各種動(dòng)力學(xué)因素對(duì)峰展寬的影響。H=A+Cu有關(guān)參數(shù)?

分離度：在色譜過(guò)程中表示兩組分相互分離的程度,一般情況下,分離度大于1.5時(shí)稱分離完全.只有峰窄而距大的分離是令人意的。在色分析中要求：兩組分的保留值差別要足夠大。兩色譜峰要足夠窄。待測(cè)組分的分離度要足夠大，分離過(guò)程要盡可能短.?

容量因子：溶質(zhì)在固定相中的總摩爾數(shù)與流動(dòng)相中總摩爾數(shù)之比。?

選擇因子：兩組分容量因子的比值?

容量因子、選擇因子、理論塔板數(shù)對(duì)分離度的影響六、制備型高效液相色譜的重要參數(shù)Capacity:純化過(guò)程中，目標(biāo)物質(zhì)的上樣量?？梢允求w積也可以是質(zhì)量。Speed:在除去蛋白酶的過(guò)程中此項(xiàng)非常關(guān)鍵。Recovery:產(chǎn)品貴重時(shí)此項(xiàng)很重要。流動(dòng)相的條件、環(huán)境會(huì)影響它。減少步鄹和保持一種對(duì)生物樣品合適的環(huán)境條件。Resolution:在純化的最后階段，此項(xiàng)很關(guān)鍵，尤其是雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)和目的物結(jié)構(gòu)相似時(shí)。七、分離機(jī)理和色譜類型分離蛋白質(zhì)類物質(zhì)時(shí)的分離依據(jù)：疏水性分子大小等電點(diǎn)結(jié)構(gòu)特異性色譜介質(zhì)按分離機(jī)理分為正相色譜反相色譜：常加入TFA離子交換色譜：陰離子交換色譜（DEAE二乙基氨基乙基，Q季胺鹽）陽(yáng)離子交換色譜（CM羧甲基S磺酸基）凝膠過(guò)濾色譜疏水色譜：苯基，辛基等。金屬螯合色譜：鎳、銅等親合色譜第二節(jié)

分離方案的設(shè)計(jì)?

Whatistheintendeduseoftheproduct??

What

kind

of

starting

material

is

available

and

howshoulditbehandled??

What

are

the

purity

issues

in

relation

to

the

sourcematerialandintendeduseofthefinalproduct??

Whathastoberemoved??

Whatmustberemovedcompletely??

Whatwillbethefinalscaleofpuridication??

What

are

the

economical

constraints

and

whatresourcesandequipmentareavailable?一、分離方法之間的組合四步純化法：Preparation:Capture:(Isolate,concentrateandstabilize)Intermediate

purification

:(Remove

bulkimpurities)Polishing:(Achievefinalhighlevelpurity)?

色譜之間的組合方案?

AC、GF、IEX、HIC二、分離條件的優(yōu)化合適的溶劑強(qiáng)度:容量因子k’足夠的柱效N:良好的分離選擇性α:當(dāng)柱過(guò)載時(shí)：1

N和k’都隨樣品負(fù)荷的增加而迅速地減小2

流速對(duì)于塔板數(shù)N的影響大大地降低3通過(guò)增加柱長(zhǎng)來(lái)有效地提高柱效，不宜通過(guò)降低柱壓（或流速）來(lái)達(dá)此目的制備分離的兩種途徑：第一種，基本上同于分析型，進(jìn)樣量不過(guò)載，利用大內(nèi)徑的柱，通過(guò)調(diào)整分離方程中的有關(guān)參數(shù)來(lái)達(dá)到分離的最佳化。在該法中往往利用小顆粒的填料（約10μm）來(lái)制取少量?jī)r(jià)值高而難分離的物質(zhì)。第二種，使用大粒度填料（～50μm）的大內(nèi)徑柱，在過(guò)載情況下制備相對(duì)大量的純物質(zhì)。當(dāng)α值相當(dāng)大時(shí)（例如＞1.2），提高洗脫液的流速并不至于嚴(yán)重降低分離度，從而大大縮短分離時(shí)間。三、制備型高效液相色譜常見(jiàn)問(wèn)題及解決辦法?

待分離成分呈單一主峰?

不易分開(kāi)的兩組分?

目的組分含量少?

待分離成分呈單一主峰?

不易分開(kāi)的兩組分?

目的組分含量少第三節(jié)

實(shí)驗(yàn)條件的選擇?

色譜柱的選擇與填裝?

柱填料?

流動(dòng)相選擇?

檢測(cè)器的選擇?

儀器設(shè)備一、柱的選擇和裝填柱：?

不銹鋼柱：200kg，生物適應(yīng)性差?

玻璃柱：10～15kg?

聚合物柱：裝填：?

當(dāng)粒度小于20μm，用較大的勻漿罐濕法填裝。粒度大于30μm時(shí)；利用輕敲柱外壁的干填法二、柱填料?

硅膠：?

葡聚糖和瓊脂糖：?

高分子聚合物：?

顆粒大小?

在α很小的分離制備中，要求較高的N值，宜用小粒度的填裝柱。?

當(dāng)α很大時(shí)，用大顆粒填裝柱，對(duì)過(guò)載進(jìn)樣是有好處。三、洗脫劑?

可利用相同填料的分析柱，選擇最適合于分離目的和要求的流動(dòng)相的組成（如溶劑的配比，離子強(qiáng)度，pH等），將其直接或略加修改后用于制備分離?

一般不采用梯度洗脫?

選擇合適的溶劑溶解樣品?

采用色譜純的試劑四、儀器設(shè)備?

對(duì)泵的精密度和準(zhǔn)確度要求不高（

0.01

～100mL/min）?

對(duì)檢測(cè)器的高靈敏要求不高?

流路系盡可能用惰性聚合材料?

柱外效試驗(yàn)結(jié)果影響較小第四節(jié)

操作變量的確定一、樣品的進(jìn)樣量?

宜注射低濃度大體積的樣品，不宜注射高濃度小體積的樣品。?

樣品進(jìn)樣的體積與柱的內(nèi)徑、柱長(zhǎng)、流動(dòng)相和固定相的類型、樣品的溶解性以及分離目的有關(guān)。困難的分離（α＜1.2），

容易的分離（α＞1.2）柱內(nèi)徑，mmmg，mg280.2～25～2510～50100～50025100～5001000～5000二、制備產(chǎn)率?

·產(chǎn)率隨分離度的提高而增加。?

·不過(guò)載的柱子，k’值較小時(shí)，產(chǎn)率較高。?

·用全孔填料時(shí)產(chǎn)率高于用薄殼型的。?

·對(duì)于α值小的分離，宜利用小粒度（5～10μm）填料的柱子；在α較大時(shí)，使用較大顆粒、大內(nèi)徑的柱，將獲得較高的產(chǎn)率，且價(jià)格便宜。?

·柱的樣品容量和產(chǎn)率隨柱橫截面積的增加而增大。?

產(chǎn)率隨柱長(zhǎng)、流動(dòng)相的流速的增加而增加。三、回收率計(jì)算和純度鑒定?

除去組分中的溶劑：熱的氮?dú)饬鞔?，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥。?

純度：HPLC，TCL。?

回收率：重量，活性。蛇毒中溶栓組分的分離制備型高效液相色譜的應(yīng)用?

肽的分離?

蛋白質(zhì)的分離?

多糖的分離?

核酸的分離肽的分離：常用方法為反相色譜和離子交換色譜肽的保留時(shí)間可用氨基酸的保留常數(shù)之和預(yù)測(cè)。反相色譜分為：緩沖液反相色譜，離子對(duì)反相色譜。肽的檢測(cè)：UV200～230nm，熒光檢測(cè)。蛋白質(zhì)的分離1．填料：孔徑300～5002．流動(dòng)相（1）pH

低pH使蛋白質(zhì)羧基解離受到抑制，極性降低，與反相鍵合相的作用強(qiáng)。對(duì)大多蛋白質(zhì)而言，使用pH2.5～3.5的流動(dòng)相可以得到最好的分離。（2）離子強(qiáng)度和離子增加離子強(qiáng)度增加了蛋白與合相的疏水作用，較高的離子強(qiáng)度（＞0.2）可使蛋白質(zhì)有較好的分辨率和回收率。沖液中的能通形