灰霉AUR1基因的必需性分析黑曲霉pepB基因缺失菌株的構(gòu)建以黑曲霉基因組DNA為模板，用PCR方法分別擴(kuò)增pepB基因中的上游約1.4kb和下游約1.3kb兩段DNA序列，將此兩段序列按同一方向分別插入質(zhì)粒pMW1中潮霉素抗性基因(hph)表達(dá)單元的5’和3’端，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pMW1—pepB，用于通過同源重組靶向破壞基因組中的pepB基因。1、PCR引物設(shè)計和擴(kuò)增反應(yīng)

根據(jù)pepB全基因序列設(shè)計兩對引物P1/P2和T1/T2。在P1和P2中分別引入限制性酶切位點(diǎn)Hpa1和Sal1，T1和T2中分別引入限制性酶切位點(diǎn)BamH1和Hpa1。以黑曲霉染色體DNA為模板，使用上述兩對引物分別PCR擴(kuò)增pepB基因中的上游(以后簡稱為P端)序列與下游(以后簡稱為T端)序列。pepB基因阻斷質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖黑曲霉pepB基因缺失株的篩選及PCR檢測為了通過同源重組構(gòu)建pepB基因缺失株，以Hpa1酶切Pmw1-pepB阻斷質(zhì)粒，產(chǎn)生4.2kb的線性片段，該片段由pepB基因的P端和T端同源序列片段和插入其間的選擇標(biāo)記hph組成。進(jìn)而通過原生質(zhì)體-PEG轉(zhuǎn)化方法將該片段導(dǎo)入黑曲霉在Hgy平板上篩選hph轉(zhuǎn)化子。以轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板，用引物對Phph/PT-out和P3/T3進(jìn)行PCR檢測。如果4.2kb的線性片段與受體染色體DNA發(fā)生同源重組，pepB基因在P端同源序列和T端同源序列之間的203bp染色體DNA將被hph表達(dá)單元取代。則以Phph/PT-out為引物的PCR，將得到大小約為1.3kb的特異片段;而以P3/T為引物的PCR檢測，將得到大小約為1.8kb的片段(圖2)。如果4.2kb線性轉(zhuǎn)化片段隨機(jī)插入染色體基因組，則pepB基因沒有被破壞，以Phph/PT-out引物對各轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR檢測時就不會有1.3kb特異片段出現(xiàn)或無PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；而以P3/T3引物對各轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR檢測時，將得到516bp的特異性片段，與出發(fā)株相同。PCR引物設(shè)計和擴(kuò)增反應(yīng)

根據(jù)AUR1全基因序列設(shè)計兩對引物P1／P2和T1／T2：P1:CGACCACATATCTGGGTTP2:TACGGTACCAGTATTKpnIT1:CGAATCGATTTACTAClaIT2:GGACCATGGGATCGT

以灰霉染色體DNA為模板，使用上述兩對引物分別PCR擴(kuò)增AUR1基因中的上游(以后簡稱為P端)序列與下游(以后簡稱為T端)序列。其中KpnI和ClaI為質(zhì)粒pTFCM上的單一酶切位點(diǎn)，而在灰霉AUR1中也含有這兩個酶切位點(diǎn)。