本文格式為Word版，下載可任意編輯——核磁共振代謝組學樣品處理數(shù)據(jù)分析Protocol1H-NMR代謝組學

樣本處理——雙相提取法細胞

1.收集細胞，1500rpm/min，5min，4℃離心，棄上清2.預冷PBS洗兩次，1500rpm/min，5min，4℃離心。

3.將細胞轉移至2mlEP管中，PBS潤洗離心管，對應轉移。

4.小離心機2000rpm/min，5min，4℃離心，棄上清（盡量倒清白，倒扣用紙吸干）。5.-80℃/液氮保存（1年）

6.向各管細胞沉淀中參與預冷甲醇：氯仿=2:1,900ul，渦旋混勻（最大轉速）10min。7.細胞超聲破碎儀，超聲3s/次，共3次，中間間隔3s（冰上操作）。8.參與300ul預冷氯仿。

9.參與540ul預冷miniQ水，渦旋混勻（最大轉速）10min，冰上靜置10min。

10.13000rpm，20min離心，體系分為三相，即上層水相+甲醇；下層為氯仿；中間為未裂

解細胞和細胞碎片以及蛋白質。

11.分別取上層水相和下層有機相于不同的EP管中，可-80℃/液氮保存。12.下層有機相氮吹和上層水相氮吹后凍干。

13.凍干后每管參與500ul重水，渦旋混勻5min。

14.水相12000g/min，5min，4℃離心；有機相200g/min，5min，4℃離心。15.取上清參與核磁管中，送樣檢測。組織

1.稱取20~200mg冰凍組織，并準備預冷甲醇、氯仿、miniQ水。

2.將冰凍組織置于玻璃管內(nèi)，按體積參與4ml/g甲醇和0.85ml/g水到組織樣品中，超聲破

碎樣品并渦旋混勻。

3.參與2ml/g氯仿，再次渦旋混勻2min，靜置2min。4.參與2ml/g氯仿和2ml/g水，再次渦旋混勻。

5.將樣品置于冰上或冰箱中靜置15min后，1000g，15min，4℃離心（如無明顯分層，則

再次離心）。

6.將上層水相與下層氯仿相分別轉移到玻璃管中，氮吹后-80℃/液氮保存。7.真空低溫凍干樣本后，馬上檢測。8.若不馬上進行檢測，則將水相提取物儲存于-80℃，將脂相提取物保存于氘代有機溶劑中

（主要為降低氧化反應），并儲存于-80℃（但最好不要超過3天）。9.水相代謝物：參與580ul重水，含0.1~0.5mMTSP，渦旋混勻，12000g，5min，并將550ul

樣品置于核磁管中檢測。

10.脂性代謝物：參與580ul氘代氯仿，含0.03V/VTMS，渦旋混勻，1000g，5min，并將

550ul樣品置于核磁管中檢測。

數(shù)據(jù)分析

NestReNovaA．Open-fid-1.AutomaticPhaseCorrection

2.TMS定標：含TSP內(nèi)標定0；不含TSP內(nèi)標定乳酸1.3363.BaselineCorrection：1

按順序開啟文件并保存（根據(jù)所需比較組別按順序排列樣本后依次開啟，并記錄明白）。

B．另存為文件

1.全選-疊加峰-Delate其他圖

2.積分區(qū)間9.5~0.5（可變，自定），間距0.002或0.004

去掉水峰4.7左右（4.6~5.1）

血液、尿液：去掉尿素峰（5.8左右，較寬單峰）引入的氯仿：去掉氯仿峰7.8~7.6引入的甲醇：去掉甲醇峰3.37~3.343.Processing-Binning（積分）4.Cut（切除峰）：三個-水峰、氯仿峰、甲醇峰5.歸一化：Processing-Normalize（10000）-保存為txt格式

6.用excel開啟，剔除〞以去掉〞三段積分值，另存為excel（2023版）

7.在excel中編輯數(shù)據(jù)，插入兩行，按順序，第一行為1,2,3,4，….(樣本個數(shù))；其次行為

1,1,1,1，…;2,2,2,…(1為組1樣本；2為組2樣本)。

SIMACA-P+

C．驗證異常點有無

1.新建-導入excel文件-transpose-橫1：Primary；豎1：Primary；豎2：Y-Variable2.雙擊-workset-Variables-去掉Var-1-分組；Scale-type-全選-ctr-set

3.Analysis-changeModelType（PLS）-PCAonX-block-上方工具欄（caculatethefirst

two-components）

左側工具欄“PCAplots“-“t[1]/t[2]ScatterPlot(單個圖)“上方工具欄““同時顯示4個圖“DistancetoModelX“圖中，縱坐標為依據(jù)，高于基線值2倍的點為異常點R2X,R2Y無要求，斜率接近，Q2Y>0.4(動物樣本)；Q2Y>0.2(人體樣本)

D.PLS-DA分析（包含Var-1，在Variables中恢復）1.選中M1PCA-X，Newasmodel，Edit2.分組（observation）

3.Scale（全選）-Par（type）-set-確定-Nottoall

4.PLSDiscrimination-上方工具欄““同時顯示4個圖5.Validate：ModelPlot-200

E．OPLS-DA(包含Var-1)

1.選中M2PCA-X，Newasmodel，Edit

2.Scale（全選）-UV（type）-set-確定-Nottoall

3.PLSDiscrimination-上方工具欄““同時顯示4個圖4.Plot/List-Lists-observationandloadingsAddseries（加2個變量），p；p（corr），確定復制表格-