植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)的理論起源

19世紀30年代，德國植物學家施萊登和德國動物學家施旺創(chuàng)立了細胞學說，根據(jù)這一學說，如果給細胞提供和生物體內(nèi)一樣的條件，每個細胞都應(yīng)該能夠獨立生活。

1902年，德國植物學家哈伯蘭特在細胞全能性的理論是植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)。

1958年，一個振奮人心的消息從美國傳向世界各地，美國植物學家斯蒂瓦特等人，用胡蘿卜韌皮部的細胞進行培養(yǎng)，終于得到了完整植株，并且這一植株能夠開花結(jié)果，證實了哈伯蘭特在五十多年前關(guān)于細胞全能的預(yù)言。根據(jù)植物細胞具有全能性這個理論，近幾十年來發(fā)展起來的一項無性繁殖的新技術(shù)——植物的組織培養(yǎng)技術(shù)植物組織培養(yǎng)定義

是指在無菌條件下，將離體的植物器官(如根尖、莖尖、葉、花、未成熟的果實、種子等)、組織(如形成層、花藥組織、胚乳、皮層等)、細胞(如體細胞、生殖細胞等)、胚胎(如成熟和未成熟的胚)、原生質(zhì)體(如脫壁后仍具有生活力的原生質(zhì)體)，培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織，或潛伏芽等，或長成完整的植株，統(tǒng)稱為植物組織培養(yǎng)。由于是在試管內(nèi)培養(yǎng)，而且培養(yǎng)的是脫離植物母體的培養(yǎng)物，因此也稱離體培養(yǎng)和試管培養(yǎng)。

植物組織培養(yǎng)的方式

大致可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)兩類。

固體培養(yǎng)即將植物材料培養(yǎng)在加入一定量凝固劑的固體培養(yǎng)基上，最常用的凝固劑是瓊脂，其用量為6-10g/L，以不液化為原則（半固體）。用量太高，培養(yǎng)基過硬，培養(yǎng)材料感好，生長不好；用量太少，則培養(yǎng)基太軟，材料在培養(yǎng)基中不穩(wěn)定，甚至下沉，從而影響組織的呼吸。培養(yǎng)基的硬度還可能受到所用瓊脂的質(zhì)量、培養(yǎng)基pH及無機鹽濃度的影響。固體培養(yǎng)基的優(yōu)點是簡便，只要具備培養(yǎng)室（箱）、接種室（箱）以及一般是實驗室的玻璃皿就可以開展工作。其缺點是被培養(yǎng)的材料只有一部分表面能與培養(yǎng)基接觸，因此與組織接觸處的營養(yǎng)物質(zhì)很快被吸收掉，而其他區(qū)域補充又來得較慢，形成了培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)濃度差異，影響組織的生長速率。

液體培養(yǎng)即植物材料被培養(yǎng)在不加凝固劑的液體培養(yǎng)基中。液體培養(yǎng)基常用搖床或轉(zhuǎn)床來振動培養(yǎng)容器，振動速度一般為50-100次／分。液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)物是被培養(yǎng)基所包圍，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)分布均勻，不會出現(xiàn)濃度差異現(xiàn)象，同時培養(yǎng)物的供氧情況也得到改善，有利于它的代謝、生長。因此，在液體培養(yǎng)中，培養(yǎng)物的生長速度要比固體培養(yǎng)快得多。

培養(yǎng)箱液體培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分1、無機營養(yǎng)物無機營養(yǎng)物主要由大量元素和微量元素兩部分組成，大量元素包括氮、磷、硫、鈣、鈉、鎂和鈉，微量元素包括碘、錳、鋅、鉬、銅、鈷和鐵。2、碳源培養(yǎng)的植物組織或細胞，它們的光合作用較弱。因此，需要在培養(yǎng)基中附加一些碳水化合物以供需要。培養(yǎng)基中的碳水化合物通常是蔗糖。3、維生素在培養(yǎng)基中加入維生素，常有利于外植體的發(fā)育。培養(yǎng)基中的維生素屬于B族維生素，其中效果最佳的有維生素B1、維生素B6、生物素、泛酸鈣和肌醇等。4、有機附加物包括人工合成或天然的有機附加物。最常用的有酪朊水解物、酵母提取物、椰子汁及各種氨基酸等。5、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)常用的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)大致包括以下三類：

(1)植物生長素類。如吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）。

(2)細胞分裂素。如玉米素（Zt）、6-芐基嘌呤（6-BA或BAP）和激動素（Kt）。

(3)赤霉素。組織培養(yǎng)中使用的赤霉素只有一種，即赤霉酸（GA3）。植物組織培養(yǎng)基的配制方法

1.制備母液為了避免每次配制培養(yǎng)基都要對幾十種化學藥品進行稱量，應(yīng)該將培養(yǎng)基中的各種成分，按原量10倍、100倍或1000倍稱量，配成濃縮液，這種濃縮液叫做母液。這樣，每次配制培養(yǎng)基時，取其總量的1/10、1/100、1/1000，加以稀釋，即成培養(yǎng)液?，F(xiàn)將培養(yǎng)液中各類物質(zhì)制備母液的方法說明如下。

(1)大量元素。大量元素包括硝酸銨等用量較大的幾種化合物。制備時，按表中排列的順序，以其10倍的用量，分別稱出并進行溶解，以后按順序混在一起，最后加蒸餾水，使其總量達到1升，此即大量元素母液。

(2)微量元素。因用量少，為稱量方便和精確起見，應(yīng)配成100倍或1000倍的母液。配制時，每種化合物的量加大100倍或1000倍，逐次溶解并混在一起，制成微量元素母液。

(3)鐵鹽。鐵鹽要單獨配制。由硫酸亞鐵(FeSO4?7H2O)5.57克和乙二胺四乙酸二鈉(Na2—EDTA)7.45克溶于1升水中配成。每配1升培養(yǎng)基，加鐵鹽5毫升。

(4)有機物質(zhì)。主要指氨基酸和維生素類物質(zhì)。它們都是分別稱量，分別配成所需的濃度(0.1～1.0毫克/毫升)，用時按培養(yǎng)基配方中要求的量分別加入。(5)植物激素。最常用的有生長素和細胞分裂素。這類物質(zhì)使用濃度很低，一般為0.01～10毫克/升?？砂从昧康?00倍或1000倍配制母液，配制時要單個稱量，分別貯藏。配制植物生長素時，應(yīng)先按要求濃度稱好藥品，置于小燒杯或容量瓶中，用1～2毫升0.1N(克當量濃度)氫氧化鈉溶解，再加蒸餾水稀釋至所需濃度。配制細胞分裂素時，應(yīng)先用少量0.5或1N的鹽酸溶解，然后加蒸餾水至所需量。以上各種混合液(母液)或單獨配制藥品，均應(yīng)放入冰箱中保存，以免變質(zhì)、長霉。至于蔗糖、瓊脂等，可按配方中要求，隨稱隨用。植物組織培養(yǎng)的步驟以胡蘿卜為例：步驟圖示如下：3、植物種質(zhì)資源的保存、挽救瀕于滅絕的植物

長期以來人們想了很多方法來保存植物，如儲存果實，儲存種子，儲存塊根、塊莖、種球、鱗莖；用常溫、低溫、變溫、低氧、充惰性氣體等，這些方法在一定程度上收到了好的或比較好的效果，但仍存在許多問題。主要問題是付出的代價高，占的空間大，保存時間短，而且易受環(huán)境條件的限制。植物組織培養(yǎng)結(jié)合超低溫保存技術(shù)，可以給植物種質(zhì)保存帶來一次大的飛躍。因為保存一個細胞就相當與保存一粒種子，但所占的空間僅為原來的幾萬分之一，而且在-193度的液氮中可以長時間保存，不像種子那樣需要年年更新或經(jīng)常更新。

實踐證明，通過組織培養(yǎng)的方法可以使一部分瀕危的植物種類得到延續(xù)和保存；如果在結(jié)合超低溫保存技術(shù)，就可以使這些植物得到較為永久性的保存。4、通過花藥和花粉培養(yǎng)獲得單倍體植株、縮短育種年限

通過花藥和花粉組織培養(yǎng)可以獲得單倍體植物，大大縮短了育種時間。使新品種的培育過程大大簡化。

瀕危絕種植物——百山祖冷杉快速繁殖5、胚胎培養(yǎng)的應(yīng)用

在遠源雜交中，有雜交不孕現(xiàn)象，給遠緣雜交造成極大困難。十九世紀二十年代末，aibach用胚培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)亞麻種間雜種胚，第一個獲得了雜種植物，這一成功為在遠緣時克服雜交不親和的障礙提供了一項有用的技術(shù)。

這項技術(shù)發(fā)展至今，已經(jīng)相當成熟，可以說多數(shù)植物的成熟或未成熟胚通過培養(yǎng)都可獲得成功。幼胚培養(yǎng)已經(jīng)可使5個細胞大小的極幼齡的胚狀結(jié)構(gòu)培養(yǎng)成植株。但胚珠培養(yǎng)的研究不多，單個胚珠培養(yǎng)尚存在許多問題，需作深化研究。

遠緣雜交中，由于生理上和遺傳上的障礙而不能雜交成功，可采用試管受精加以克服，即將母本胚珠離體培養(yǎng)，使異種花粉在胚珠上萌發(fā)受精，產(chǎn)生的雜種胚在試管中發(fā)育成完整植株。

用胚乳培養(yǎng)可獲得三倍體植株，為誘導(dǎo)形成三倍體植物開辟了一條新途徑。三倍體加倍后得到六倍體，可育成多倍體品種。

6、細胞融合

通過原生質(zhì)體融合，可部分克服有性雜交不親和性，而獲得體細胞雜種，從而創(chuàng)造新種貨育成優(yōu)良品種。

7、培養(yǎng)細胞突變體的應(yīng)用

培養(yǎng)細胞處在不斷分生狀態(tài)，它就容易受培養(yǎng)條件和外加壓力（如射線、化學物質(zhì)）的影響而產(chǎn)生誘變，從中可以篩選出有用的突變體，從而育成新品種。目前用這種方法已經(jīng)篩選到抗病、抗鹽、高蛋白、高產(chǎn)等突變體，有些已經(jīng)用于生產(chǎn)。

8、用于基礎(chǔ)生命科學的研究

要揭開生命活動的秘密，需要多科學、多技術(shù)的相互配合，其中植物組織培養(yǎng)技術(shù)是不可缺少的，它為遺傳學、分子生物學、細胞生物學、生物工程等提供了一種有效、快速的方法。因為要揭示生命的奧秘，首先要研究單個基因的作用，研究它在細胞內(nèi)是如何組裝的，如何與其它基因發(fā)生聯(lián)系，如何表達和調(diào)控等。分離單個基因，對它DNA進行測序，再對其中的某些堿基實行突變，然后還需要將基因送到受體細胞當中，看表達情況，以確定其功能。接受基因的受體細胞要產(chǎn)生再生植株，就需要通過組織培養(yǎng)的方法才能實現(xiàn)。

9、利用組織培養(yǎng)的材料作為植物生物反應(yīng)器

中國的中草藥是一份人類寶貴的財富，但很多種中草藥資源匱乏，產(chǎn)量不足，甚至瀕于滅絕。如果能利用組織和細胞培養(yǎng)的方法在實驗室內(nèi)生產(chǎn)，不再依附于自然環(huán)境，不僅可以解決現(xiàn)有困難，而且可以通過篩選高產(chǎn)有效成分的細胞系，來提高其藥用價值。比如用培養(yǎng)的人參懸浮細胞，來生產(chǎn)人參皂苷，已在日本等國家形成規(guī)模。利用培養(yǎng)的植物細胞和組織細胞作為生物反應(yīng)器，結(jié)合基因工程技術(shù)，也可以生產(chǎn)某些蛋白質(zhì)、氨基酸、抗生素、疫苗等，如用生食蔬菜生產(chǎn)乙肝疫苗正在實驗中。

植物組織培養(yǎng)的成功的關(guān)鍵植物組織培養(yǎng)的成功與否取決于外植體的制備、無菌操作和人工培養(yǎng)環(huán)境。外植體的制備是能否建成離體繁殖系要過的第一關(guān)。所謂的外植體是指將外界生長的植物的細胞和組織經(jīng)過一系列的無菌處理形成的有活性的無菌組織和細胞。習慣上我們經(jīng)常使用化學藥劑處理，例如氯化汞、次氯酸鹽或者抗生素等。將從母株上取下的組織進行一定的剝離和分割，經(jīng)過流水沖洗數(shù)分鐘，再浸入適宜濃度的化學藥劑中一段時間，最后經(jīng)無菌水沖洗并適當分割即成外植體。制備外植體的原則是無菌和有活性，無菌是外植體植被的要求，有雜菌帶入培養(yǎng)基會造成微生物污染，而阻滯甚至殺死外植體。有活性是外植體制備的前提，無活性的外植體的培養(yǎng)在植物組織培養(yǎng)中是無意義的。無菌操作是貫穿于整個組織培養(yǎng)過程的一門關(guān)鍵技術(shù)，甚至可以說組織培養(yǎng)的前提就是無菌。事實上外植體的制備過程就是無菌處理過程，而其后的一系列操作都是在無菌環(huán)境下進行的，實驗室中經(jīng)常使用的無菌操作設(shè)備是超凈工作臺。超凈工作臺通常借助紫外光結(jié)合逆壓滲透的超濾風技術(shù)來滿足無菌要求。無菌操作者的操作手法和習慣也是無菌操作成功與否的關(guān)鍵，通常進行無菌操作的實驗人員也要經(jīng)過嚴密的無菌操作訓(xùn)練并建立嚴格的“無菌概念”。能否把植物組織培養(yǎng)做到滿意的人工調(diào)控，關(guān)鍵在于人工培養(yǎng)環(huán)境。人工培養(yǎng)環(huán)境是整個組織培養(yǎng)的難點和重點，也是近百年來植物生理學家一直探討和研究的重要話題。人工培養(yǎng)環(huán)境包括能量的來源——光照，新陳代謝的保證——溫度，氣-水平衡——濕度，生物原料的來源——培養(yǎng)基。這與植物的自然環(huán)境是類似的，即光照、溫濕度和土壤。光照、溫度的選定通常依據(jù)所培養(yǎng)植物的生態(tài)習性，習慣上采用暗培養(yǎng)與光照培養(yǎng)(8h/d,3000lx)的結(jié)合，溫度在25-28度。濕度在組織培養(yǎng)中不需特意的調(diào)整，因為培養(yǎng)容器中的濕度幾乎達到100%。因此，人工培養(yǎng)環(huán)境的重難點則在培養(yǎng)基上。

植物組織培養(yǎng)的特點

1、培養(yǎng)條件可以人為控制組織培養(yǎng)采用的植物材料完全是在人為提供的培養(yǎng)基和小氣候環(huán)境條件下進行生長，擺脫了大自然中四季、晝夜的變化以及災(zāi)害性氣候的不利影響，且條件均一，對植物生長極為有利，便于穩(wěn)定地進行周年培養(yǎng)生產(chǎn)。

2、生長周期短，繁殖率高植物組織培養(yǎng)是由于人為控制培養(yǎng)條件，根據(jù)不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培養(yǎng)條件，因此生長較快。另外，植株也比較小，往往20-30天為一個周期。所以，雖然植物組織培養(yǎng)需要一定設(shè)備及能源消耗，但由于植物材料能按幾何級數(shù)繁殖生產(chǎn)，故總體來說成本低廉，且能及時提供規(guī)格一致的優(yōu)質(zhì)種苗或脫病毒種苗。

3、管理方便，利于工廠化生產(chǎn)和自動化控制植物組織培養(yǎng)是在一定的場所和環(huán)境下，人為提供一定的溫度、光照、濕度、營養(yǎng)、激素等條件，極利于高度集約化和高密度工廠化生產(chǎn)，也利于自動化控制生產(chǎn)。它是未來農(nóng)業(yè)工廠化育苗的發(fā)展方向。它與盆栽、田間栽培等相比省去了中耕除草、澆水施肥、防治病蟲等一系列繁雜勞動，可以大大節(jié)省人力、物力及田間種植所需要的土地。自哈布蘭特提出細胞全能性理論以來，在無數(shù)科學家的努力下，經(jīng)過80多年的歷程，才使離體培養(yǎng)這項技術(shù)趨于完善，趨于成熟。近40年來，