第八章固定化酶反應(yīng)原理與技術(shù)固定化酶和細(xì)胞原理酶催化劑的優(yōu)點(diǎn)：專一性強(qiáng)，反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)速度較快。弱點(diǎn)：溶液酶在反應(yīng)后，分離困難，重復(fù)利用困難；溶液酶穩(wěn)定性差，易失活。1969出現(xiàn)了固定化酶技術(shù)。固定化酶就是把原來(lái)游離的水溶性酶，設(shè)法限制或固定于某一局部的空間或者固定于載體上。概述固定化酶和細(xì)胞原理

圖8-1生物催化劑作用方式示意固定化酶的發(fā)展史固定化酶和細(xì)胞原理什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術(shù)固定化酶和細(xì)胞原理二．固定化酶的優(yōu)缺點(diǎn)多次使用可以裝塔連續(xù)反應(yīng)優(yōu)點(diǎn)：純化簡(jiǎn)單提高產(chǎn)物質(zhì)量應(yīng)用范圍廣缺點(diǎn)：首次投入成本高大分子底物較困難固定化酶和細(xì)胞原理

固定化酶的性質(zhì)及其影響因素一．影響固定化酶性質(zhì)的因素二．固定化后酶性質(zhì)的變化三．評(píng)價(jià)固定化酶的指標(biāo)固定化酶和細(xì)胞原理一．影響固定化酶性質(zhì)的因素1．酶本身的變化，主要是由于活性中心的氨基酸殘基、高級(jí)結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)等發(fā)生了變化。固定化酶和細(xì)胞原理2．載體的影響（1）分配效應(yīng)（2）空間障礙效應(yīng)（3）擴(kuò)散限制效應(yīng)3.固定化方法的影響固定化酶和細(xì)胞原理二．固定化后酶性質(zhì)的變化1．固定化對(duì)酶活性的影響：酶活性下降，反應(yīng)速度下降固定化酶和細(xì)胞原理2．固定化對(duì)酶穩(wěn)定性的影響（1）操作穩(wěn)定性提高（2）貯存穩(wěn)定性比游離酶大多數(shù)提高。

(3)對(duì)熱穩(wěn)定性，大多數(shù)升高，有些反而降低。

(4)對(duì)分解酶的穩(wěn)定性提高。（5）對(duì)變性劑的耐受力升高固定化酶和細(xì)胞原理2．固定化后酶穩(wěn)定性提高的原因：a.固定化后酶分子與載體多點(diǎn)連接。b.酶活力的釋放是緩慢的。c.抑制自降解，提高了酶穩(wěn)定性。固定化酶和細(xì)胞原理3．pH的變化PH對(duì)酶活性的影響：（1）改變酶的空間構(gòu)象（2）影響酶的催化基團(tuán)的解離（3）影響酶的結(jié)合基團(tuán)的解離（4）改變底物的解離狀態(tài)，酶與底物不能結(jié)合或結(jié)合后不能生成產(chǎn)物。固定化酶和細(xì)胞原理1）載體帶負(fù)電荷，pH向堿性方向移動(dòng)。

微環(huán)境是指在固定化酶附近的局部環(huán)境，而把主體溶液稱為宏觀環(huán)境。固定化酶和細(xì)胞原理載體帶正電荷，pH向酸性方向移動(dòng)。（2）產(chǎn)物性質(zhì)對(duì)pH的影響催化反應(yīng)的產(chǎn)物為酸性時(shí)，固定化酶的pH值比游離酶的pH值高；反之則低固定化酶和細(xì)胞原理4．最適溫度變化一般與游離酶差不多，但有些會(huì)有較明顯的變化。5．底物特異性變化作用于低分子底物的酶特異性沒(méi)有明顯變化既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶特異性往往會(huì)變化。固定化酶和細(xì)胞原理6．米氏常數(shù)Km的變化，Km值隨載體性質(zhì)變化由于分配效應(yīng)：ρ=[Si]微環(huán)境/[S]宏觀環(huán)境

Km'=Km/ρ(表觀米氏常數(shù))（1）載體與底物帶相同電荷，Si]<[S],ρ<1,Km’>Km固定化酶降低了酶的親和力。（2）載體與底物電荷相反，靜電作用，[Si]>[S]，則ρ>1,Km'<Km固定化酶和細(xì)胞原理三．評(píng)價(jià)固定化酶的指標(biāo)：1．酶活定義（IU)：在特定條件下，每一分鐘催化一個(gè)微摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定義為1個(gè)酶活單位。

——計(jì)量單位2.酶比活定義（游離）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的酶活力單位

——品質(zhì)的體現(xiàn)固定化酶和細(xì)胞原理三．評(píng)價(jià)固定化酶的指標(biāo)：1.固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力單位?；颍?jiǎn)挝幻娣e（cm2）的酶活力單位表示（酶膜、酶管、酶板）。2.操作半衰期：衡量穩(wěn)定性的指標(biāo)。連續(xù)測(cè)活條件下固定化酶活力下降為最初活力一半所需要的時(shí)間（t1/2）固定化酶和細(xì)胞原理3.4.或稱偶聯(lián)效率，活力保留百分?jǐn)?shù)。5.相對(duì)酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力與游離酶活力的比值稱為相對(duì)酶活力

固定化酶和細(xì)胞原理四固定化酶的活力測(cè)定方法介紹1.振蕩測(cè)定法：稱取一定量的固定化酶加入一定量的底物溶液，一邊振蕩或攪拌，一邊進(jìn)行催化反應(yīng)取出一定量的反應(yīng)液進(jìn)行酶活力測(cè)定。2.酶柱測(cè)定法：將一定量的固定化酶裝進(jìn)具有恒溫裝置的反應(yīng)柱中讓底物溶液以一定的流速流過(guò)酶柱收集流出的反應(yīng)液測(cè)定其中產(chǎn)物的生成量或底物的消耗量

固定化酶和細(xì)胞原理3.連續(xù)測(cè)定法利用連續(xù)分光光度法等測(cè)定方法可以對(duì)固定化酶反應(yīng)液進(jìn)行連續(xù)測(cè)定，從而測(cè)定固定化酶的酶活力。

固定化酶和細(xì)胞原理固定化酶的性質(zhì)及其影響因素提要影響固定化酶性質(zhì)的因素固定化酶的性質(zhì)評(píng)價(jià)固定化酶的指標(biāo)酶本身的變化載體的影響固定化對(duì)酶活性的影響固定化對(duì)酶穩(wěn)定性的影響最適pH的變化最適溫度變化底物特異性與游離酶不同米氏常數(shù)Km的變化評(píng)價(jià)指標(biāo)活力測(cè)定方法固定化酶和細(xì)胞原理固定化酶的制備一．一般方法及特點(diǎn)二．酶的固定化方法固定化酶和細(xì)胞原理一．一般方法及特點(diǎn)關(guān)鍵在于選擇適當(dāng)?shù)墓潭ɑ椒ê捅匾妮d體以及穩(wěn)定性研究、改進(jìn)。1．四大類方法：吸附法（包括電吸附法）結(jié)合法（無(wú)機(jī)多孔材料）交聯(lián)法（雙功能試劑）包埋法（微膠囊法）固定化酶和細(xì)胞原理各類固定化方法的特點(diǎn)比較:比較項(xiàng)目吸附法結(jié)合法交聯(lián)法包埋法物理吸附.共價(jià)鍵結(jié)合離子鍵結(jié)合制備難易易難易較難較難固定化程度弱強(qiáng)中等強(qiáng)強(qiáng)活力回收率較高低高中等高載體再生可能不可能可能不可能不可能費(fèi)用低高低中等低底物專一性不變可變不變可變不變適用性酶源多較廣廣泛較廣小分子底物、藥用酶固定化酶和細(xì)胞原理2．選擇方法依據(jù)：（1）酶的性質(zhì)（2）載體的性質(zhì)（3）制備方法的選擇固定化酶和細(xì)胞原理3．固定化后酶的考察項(xiàng)目：（1）測(cè)定固定化酶的活力，以確定固定化過(guò)程的活力回收率。（2）考察固定化酶穩(wěn)定性（3）考察固定化酶最適反應(yīng)條件固定化酶和細(xì)胞原理二．酶的固定化方法（一）吸附法（二）結(jié)合法（三）交聯(lián)法（四）包埋法（entrappingmethod）固定化酶和細(xì)胞原理酶和細(xì)胞固定化示意圖固定化酶和細(xì)胞原理（一）吸附法1．物理吸附：利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上。

固定化酶和細(xì)胞原理（一）吸附法常用載體：無(wú)機(jī)載體：氧化鋁、活性碳、皂土、硅藻土、金屬氧化物、硅膠。一般吸附量<1mg蛋白/克吸附劑有機(jī)載體：淀粉、白蛋白等。一般吸附量幾十毫克蛋白/克吸附劑研究熱點(diǎn)：大孔型合成樹(shù)脂、陶瓷固定化酶和細(xì)胞原理（二）結(jié)合法1離子鍵結(jié)合法2共價(jià)鍵結(jié)合法☆固定化酶和細(xì)胞原理1離子鍵結(jié)合法概念常用載體:DEAE-纖維素（功能團(tuán)：二乙氨乙基）

，DEAE-葡聚糖凝膠使用注意：pH、離子強(qiáng)度、溫度固定化酶和細(xì)胞原理2共價(jià)鍵結(jié)合法（1）概念（2）可以形成共價(jià)鍵的基團(tuán)：游離氨基，游離羧基，巰基，咪唑基，酚基，羥基，甲硫基，吲哚基，二硫鍵（3）常用載體：天然高分子、人工合成的高聚物、無(wú)機(jī)載體固定化酶和細(xì)胞原理（4）載體活化的方法A．重氮法B．疊氮法C．烷基化反應(yīng)法D．硅烷化法E．溴化氰法固定化酶和細(xì)胞原理A．重氮法反應(yīng)示意式如下固定化酶和細(xì)胞原理目前在我們國(guó)內(nèi)用的較多的載體是對(duì)氨基苯磺酰乙基（ABSE）纖維素、瓊脂糖，葡聚糖凝膠和瓊脂等該方法需要載體具有芳香族氨基固定化酶和細(xì)胞原理反應(yīng)式及原理固定化酶和細(xì)胞原理A．重氮法例5′-磷酸二酯酶的固定化。此酶用來(lái)降解核酸，可分離得到四個(gè)5′-單核苷酸（本成果榮獲國(guó)家發(fā)明三等獎(jiǎng)，中國(guó)科學(xué)院上海生化研究所袁中一等，我國(guó)第一個(gè)用于工業(yè)生產(chǎn)的固定化酶）固定化酶和細(xì)胞原理B疊氮法例用羧甲基纖維素疊氮衍生物制備固定化胰蛋白酶，步驟如下：⑴酯化：CM-纖維素先洗滌干燥，然后懸于無(wú)水甲醇中，在冰浴中通入HCl氣體，進(jìn)行酯化反應(yīng)；然后洗滌，空氣干燥。⑵肼解。把酯化后的CM-纖維素懸于甲醇中，再加入80%水合肼回流反應(yīng)1小時(shí)，過(guò)濾，洗滌干燥。固定化酶和細(xì)胞原理⑶疊氮化。肼解后的CM-纖維素（1g）加入150ml2%HCl在冰浴中混合，攪拌滴加9ml3%NaNO2反應(yīng)20min，過(guò)濾用冷蒸餾水洗滌，同時(shí)加酶(4)偶聯(lián)：經(jīng)疊氮化后的載體加入0.05NpH8.0磷酸緩沖液（內(nèi)含250-500mg酶），5℃攪拌2-3小時(shí)，過(guò)濾，用0.001NHCl，水洗滌，即為固定化胰蛋白酶（凍干保存）固定化酶和細(xì)胞原理對(duì)含有羧機(jī)基的載體，與肼基作用生成含有酰肼基團(tuán)的載體，再與亞硝酸活化，生成疊氮化合物。最后于酶偶聯(lián)固定化酶和細(xì)胞原理C．烷基化反應(yīng)法固定化酶和細(xì)胞原理D．硅烷化法多孔玻璃特點(diǎn)：①機(jī)械強(qiáng)度好，表面積大。②耐有機(jī)溶劑和微生物破壞。載體可以再生，壽命長(zhǎng)等。固定化酶和細(xì)胞原理一般常用的載體：多孔玻璃，多孔陶瓷。固定化酶和細(xì)胞原理固定化酶和細(xì)胞原理固定化酶和細(xì)胞原理固定化酶和細(xì)胞原理E．溴化氰法本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖類物質(zhì)。如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等.固定化酶和細(xì)胞原理固定化酶和細(xì)胞原理（三）交聯(lián)法借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法稱為交聯(lián)法。也可用于含酶菌體或菌體碎片的固定化。固定化酶和細(xì)胞原理（三）交聯(lián)法的形式交聯(lián)法有2種形式： 酶直接交聯(lián)法 酶輔助蛋白交聯(lián)雙重固定法

（1）吸附交聯(lián)法（2）交聯(lián)包埋法固定化酶和細(xì)胞原理酶直接交聯(lián)法在酶液中加入適量多功能試劑，使其形成不溶性衍生物。固定化依賴酶與試劑的濃度、溶液pH和離子強(qiáng)度、溫度和反應(yīng)時(shí)間之間的平衡。固定化酶和細(xì)胞原理酶輔助蛋白交聯(lián)為避免分子內(nèi)交聯(lián)和在交聯(lián)過(guò)程中因化學(xué)修飾而引起酶失活，可使用第二個(gè)"載體"蛋白質(zhì).固定化酶和細(xì)胞原理（1）吸附交聯(lián)法先將酶吸附在硅膠、皂土、氧化鋁、球狀酚醛樹(shù)脂或其他大孔型離子交換樹(shù)脂上，再用戊二醛等雙功能試劑交聯(lián)。用此法所得固定化酶也可稱為殼狀固定化酶。固定化酶和細(xì)胞原理（2）交聯(lián)包埋法把酶液和雙功能試劑（戊二醛）凝結(jié)成顆粒很細(xì)的集合體，然后用高分子或多糖一類物質(zhì)進(jìn)行包埋成顆粒。這樣避免顆粒太細(xì)的缺點(diǎn)，同時(shí)制得的固定化酶穩(wěn)定性好。固定化酶和細(xì)胞原理（四）包埋法（entrappingmethod）定義：將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法稱為包埋法。固定化酶和細(xì)胞原理包埋法分為網(wǎng)格型和微囊型1．網(wǎng)格型2．微囊型固定化酶和細(xì)胞原理1．網(wǎng)格型(1)概念將酶或含酶菌體包埋在凝膠細(xì)微網(wǎng)格中，制成一定形狀的固定化酶，稱為網(wǎng)格型包埋法。也稱為凝膠包埋法固定化酶和細(xì)胞原理2．微囊型包埋法是將酶包埋在各種高分子聚合物制成的小球內(nèi)，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直徑一般只有幾微米至幾百微米，所以也稱為微囊化法。

固定化酶和細(xì)胞原理微囊化法制備固定化酶有兩種方法①界面沉淀法②界面聚合法固定化酶和細(xì)胞原理①界面沉淀法這是一種簡(jiǎn)單的物理法，它是利用某些高聚物在水相和有機(jī)相的界面上溶解度較低而形成的皮膜將酶包埋。此法條件溫和，酶失活少，但要完全除去膜上殘留的有機(jī)溶劑很麻煩。固定化酶和細(xì)胞原理②界面聚合法是用化學(xué)手段制備微囊的方法。利用油水界石上發(fā)生聚合反應(yīng)形成聚合體而將酶包裹起來(lái)。固定化酶和細(xì)胞原理固定化酶和細(xì)胞原理固定化酶方法研究熱點(diǎn)1熱處理法：2結(jié)晶法：3分散法：固定化酶和細(xì)胞原理固定化細(xì)胞的特點(diǎn)

所謂固定化細(xì)胞技術(shù)，就是將具有一定生理功能的生物細(xì)胞，例如微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞等，用一定的方法將其固定，作為固體生物催化劑而加以利用的一門(mén)技術(shù)。固定化細(xì)胞與固定化酶技術(shù)一起組成了現(xiàn)代的固定化生物催化劑技術(shù)。

固定化酶和細(xì)胞原理固定化細(xì)胞的優(yōu)越性①無(wú)需進(jìn)行酶的分離和純化，減少酶的活力損失，同時(shí)大大降低了成本；②可進(jìn)行多酶反應(yīng)，且不需添加輔助因子，固定化細(xì)胞不僅可以作為單一的酶發(fā)揮作用，而且可以利用菌體中所含的復(fù)合酶系完成一系列的催化反應(yīng)，對(duì)于這種多酶系統(tǒng)，輔助因子再生容易；③對(duì)于活細(xì)胞來(lái)說(shuō)，保持了酶的原始狀態(tài)，酶的穩(wěn)定性更高，對(duì)污染的抵抗力更強(qiáng)；④細(xì)胞生長(zhǎng)停滯時(shí)間短，細(xì)胞多，反應(yīng)快等等。正是由于固定化細(xì)胞的這些無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，盡管其出現(xiàn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)晚于固定化酶，但其應(yīng)用范圍比固定化酶更為廣泛。

固定化酶和細(xì)胞原理應(yīng)用范圍固定化細(xì)胞的應(yīng)用范圍極廣，目前已遍及工業(yè)、醫(yī)學(xué)、制藥、化學(xué)分析、環(huán)境保護(hù)、能源開(kāi)發(fā)等多種領(lǐng)域。在工業(yè)方面，如利用產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶的固定化細(xì)胞生產(chǎn)果葡糖漿；將糖化酶與含α淀粉酶的細(xì)菌、霉菌或酵母細(xì)胞一起共固定，可以直接將淀粉轉(zhuǎn)化成葡萄糖；利用漲澡酸鈣或卡拉膠包埋酵母菌，通過(guò)批式或連續(xù)發(fā)酵方式生產(chǎn)啤酒；利用固定化酵母細(xì)胞生產(chǎn)酒精或葡萄酒；此外，還可利用固定化細(xì)胞大量生產(chǎn)氨基酸、有機(jī)酸、抗生素、生化藥物和甾體激素等發(fā)酵產(chǎn)品。在醫(yī)學(xué)方面，如將固定化的胰島細(xì)胞制成微囊，能治療糖尿??；用固定化細(xì)胞制成的生物傳感器可用于醫(yī)療診斷。在化學(xué)分析方面，可制成各種固定化細(xì)胞傳感器，除上述醫(yī)療診斷外，還可測(cè)定醋酸、乙醇、谷氨酸、氨等。此外，固定化細(xì)胞在環(huán)境保護(hù)、產(chǎn)能和生化研究等領(lǐng)域都有著重要的應(yīng)用。固定化酶和細(xì)胞原理固定化酶和細(xì)胞原理吸附法它主要通過(guò)載體與細(xì)胞間的靜電引力，即細(xì)胞表面與載體之間范德華作用力，離子鍵和氫鍵作用力，才使細(xì)胞固定在載體上的。固定化酶和細(xì)胞原理影響吸附法的主要因素（1）Z-電位：Z-電位能近似地代表表面電荷密度的大?。?）細(xì)胞的性質(zhì)和細(xì)胞壁的組成：細(xì)胞壁的電荷性質(zhì)（3）載體的性質(zhì)：特別是玻璃、陶瓷等無(wú)機(jī)材料固定化酶和細(xì)胞原理包埋固定法包理法是在細(xì)胞自身并不與凝膠基體發(fā)生化學(xué)鍵合的情況下將其包埋在半透性聚合物顆粒（或膜）內(nèi)的一種固定化方法。包埋法的最大優(yōu)點(diǎn)是能較好的保持細(xì)胞內(nèi)多酶系統(tǒng)的活力，可象游離細(xì)胞那樣進(jìn)行產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)。固定化酶和細(xì)胞原理包埋法分類常用載體：瓊脂、海藻酸鈣、角叉菜膠、明膠、聚丙烯酰胺常用凝膠包埋法固定化酶和細(xì)胞原理通過(guò)改變載體溶液參數(shù)包埋細(xì)胞改變載體溶液、操作溫度、鹽濃度、pH值和溶劑等參數(shù)時(shí)，亦可使其轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀態(tài)，將細(xì)胞包埋其中。固定化酶和細(xì)胞原理研究熱點(diǎn)——光交聯(lián)樹(shù)脂包埋法例：相對(duì)分子量為1000-3000的光交聯(lián)聚氨酯預(yù)聚物等，加入1%左右的光敏劑，加水配成一定濃度，加熱至50℃，然后與一定濃度的細(xì)胞懸浮液混合均勻，攤成一定厚度的薄層，用紫外照射3min，就可制得固定化酶和細(xì)胞原理

固定化原生質(zhì)體和輔酶一原生質(zhì)體固定化的方法制備原生質(zhì)體——將原生質(zhì)體重新懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的緩沖液中配成原生質(zhì)體懸浮液——包埋法固定化原生質(zhì)體。關(guān)鍵：原生質(zhì)體如何制備？固定化酶和細(xì)胞原理二原生質(zhì)體的制備將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞收集——懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的高滲緩沖液中——去細(xì)胞壁——分離純化——得到原生質(zhì)體-活性鑒定固定化酶和細(xì)胞原理三酶解注意要點(diǎn)1酶解前要預(yù)處理：主要是為了使酶滲透到細(xì)胞器中去。采取的策略：先加入物質(zhì)抑制或阻止某種細(xì)胞壁的成分合成，可以使酶插入。一般加入：巰基乙醇，Triton-100,甘氨酸、青霉素。固定化酶和細(xì)胞原理2酶系選擇：溶菌酶蝸牛酶β葡聚糖酶纖維素、半纖維素、和果膠酶3酶濃度選擇（0.5%-1%）固定化酶和細(xì)胞原理4酶解溫度和pH5酶解終點(diǎn)確定固定化酶和細(xì)胞原理四穩(wěn)定劑（高滲溶液）要求1加入的化合物對(duì)細(xì)胞和原生質(zhì)體無(wú)毒性2不會(huì)影響水解酶的活性3對(duì)代謝產(chǎn)物無(wú)不良影響固定化酶和細(xì)胞原理四穩(wěn)定劑加入操作注意點(diǎn)1 一定pH（酶和菌體活性最高）2 一定的濃度（過(guò)高濃度原生質(zhì)體易脫水皺縮）3 種類：無(wú)機(jī)鹽-對(duì)細(xì)菌有機(jī)物糖和糖醇-酵母4 易于滲入質(zhì)膜、易于被原生質(zhì)體和菌體分解的物質(zhì) 不宜作為穩(wěn)定劑固定化酶和細(xì)胞原理五原生質(zhì)體細(xì)胞活性的檢測(cè)1熒光素雙醋酸鹽（FDA)染色法2酚藏花紅染色法3伊文思蘭染色法固定化酶和細(xì)胞原理四輔酶固定化1原因有機(jī)輔因子中具有某些特殊的化學(xué)基團(tuán)，參與酶的催化反應(yīng)(遞氫、遞電子或遞某些化學(xué)基團(tuán)的作用）有機(jī)輔因子在使用過(guò)程中要流失，并且不能自行再生有機(jī)輔因子價(jià)格昂貴——工業(yè)上應(yīng)用全酶的關(guān)鍵是有機(jī)輔因子的保留和再生固定化酶和細(xì)胞原理輔酶固定化的方法：2固定化方法與酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亞胺法以及重氮偶聯(lián)法等共價(jià)偶聯(lián)，或?qū)⑵溥M(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾后固定在超濾器中。3輔酶固定化必須解決輔酶在多個(gè)酶之間傳遞的障礙。策略：先在輔酶的一定部位進(jìn)行修飾--引入功能團(tuán)和間隔臂（形成輔酶衍生物）--再與水溶性高分子結(jié)合固定化酶和細(xì)胞原理輔酶的固定化固定化酶和細(xì)胞原理固定化酶和細(xì)胞原理輔酶再生的形式：輔酶和酶共固定 與酶分子偶聯(lián)成輔酶-酶復(fù)合物固定化酶和細(xì)胞原理

固定化原生質(zhì)體和輔酶的固定化原生質(zhì)體輔酶固定化方法固定化要點(diǎn)原因方法形式固定化酶和細(xì)胞原理

酶反應(yīng)器和固定化酶（細(xì)胞）的應(yīng)用

酶反應(yīng)器介紹酶反應(yīng)器的選擇和應(yīng)用固定化酶和細(xì)胞的應(yīng)用固定化酶和細(xì)胞原理生物催化反應(yīng)器工程通過(guò)反應(yīng)器型式、操作方式的改變能否使生物催化反應(yīng)效率最大化？將反應(yīng)與傳質(zhì)緊密相關(guān)

固定化酶和細(xì)胞原理一．酶反應(yīng)器。

分批攪拌反應(yīng)器。攪拌罐型連續(xù)流攪拌桶反應(yīng)器。固定床型（填充床反應(yīng)器）流化床反應(yīng)器連續(xù)攪拌桶-超濾反應(yīng)器循環(huán)反應(yīng)器膜式反應(yīng)器鼓泡塔型

固定化酶和細(xì)胞原理

分批攪拌反應(yīng)器反應(yīng)器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，不需要特殊裝置，適與小規(guī)模試驗(yàn)固定化酶和細(xì)胞原理

連續(xù)流攪拌桶反應(yīng)器連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器固定化酶和細(xì)胞原理

填充床反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)填充床固定化酶和細(xì)胞原理流化床反應(yīng)器與連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器類似，是讓適量的顆粒狀酶懸浮于反應(yīng)床中，不用攪拌器，而是底物向上流過(guò)固定酶床，因此流速要適當(dāng)控制。固定化酶和細(xì)胞原理

循環(huán)反應(yīng)器高效內(nèi)循環(huán)生物反應(yīng)器（HCR）固定化酶和細(xì)胞原理

連續(xù)攪拌桶-超濾反應(yīng)器固定化酶和細(xì)胞原理膜式反應(yīng)器定義：由膜狀或板狀固定化酶或固定化微生物組裝的反應(yīng)器均稱為膜式反應(yīng)器。類型：直接接觸式酶膜反應(yīng)器、擴(kuò)散型膜反應(yīng)器和多相酶膜反應(yīng)器。固定化酶和細(xì)胞原理采用聚砜中空纖維膜反應(yīng)器固定淀粉酶可控制淀粉水解，制備糊精。固定化酶和細(xì)胞原理鼓泡塔型反應(yīng)器適用對(duì)象：反應(yīng)中涉及氣體的吸收或產(chǎn)生時(shí)適用。氣體進(jìn)入方式：與底物一起從底部進(jìn)入，經(jīng)過(guò)氣體分散板分散。和循環(huán)液從底部以切線方向進(jìn)入。固定化酶和細(xì)胞原理反應(yīng)器選擇酶的形式：溶液酶顆粒狀或片狀固定化酶膜狀和纖維狀固定化酶底物的物理性質(zhì)：溶解性、顆粒物質(zhì)和膠體物質(zhì)反應(yīng)操作要求酶的穩(wěn)定性應(yīng)用和可塑性和成本固定化酶和細(xì)胞原理酶反應(yīng)器的應(yīng)用控制酶反應(yīng)器液態(tài)流動(dòng)方式反應(yīng)器中流動(dòng)方式的改變會(huì)使酶與底物的接觸不良，造成反應(yīng)器生產(chǎn)能力降低。流動(dòng)方式改變?cè)斐煞椿斐潭鹊淖兓瑫?huì)發(fā)生程度不同的反應(yīng)或副反應(yīng)。物料粒子進(jìn)入反應(yīng)器后所經(jīng)歷的時(shí)間稱為粒子的年齡。粒子離開(kāi)反應(yīng)器時(shí)的年齡稱為停留時(shí)間。反應(yīng)器內(nèi)不同年齡的粒子間的混合稱為反混。固定化酶和細(xì)胞原理酶反應(yīng)器對(duì)底物恒定轉(zhuǎn)化目的：反應(yīng)器能平穩(wěn)的進(jìn)行工作，有利于實(shí)現(xiàn)自控操作方法：控制底物流速國(guó)外熱點(diǎn)：將固定化酶反應(yīng)器串聯(lián)或并聯(lián)操作。固定化酶和細(xì)胞原理保持酶反應(yīng)器的穩(wěn)定性：防止酶變性、中毒、自溶或載體磨損。防止酶反應(yīng)器中微生物污染向底物中加入殺菌、抑菌物質(zhì)，或有機(jī)溶劑底物物料預(yù)先除菌在45度以上環(huán)境中或酸、堿緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)酶反應(yīng)器每次用后消毒固定化酶和細(xì)胞原理二．固定化酶（細(xì)胞）的應(yīng)用1．固定化酶（細(xì)胞）在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用2．固定化酶在醫(yī)藥治療上的應(yīng)用3．固定化酶在分析化學(xué)中應(yīng)用4．固定化酶和親和色譜5．固定化酶與環(huán)境保護(hù)6．新能源開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用7．固定化酶在基礎(chǔ)理論研究中應(yīng)用固定化酶和細(xì)胞原理1．固定化酶（細(xì)胞）在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用葡萄糖異構(gòu)酶——世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的一種固定化酶。用吸附法、結(jié)合法、凝膠包埋法等進(jìn)行固定化。

葡萄糖異構(gòu)酶葡萄糖果糖果葡糖漿固定化酶和細(xì)胞原理聚丙烯酰胺凝膠包埋含有延胡索酸酶的產(chǎn)氨短桿菌菌體，制得固定化延胡索酸酶。工業(yè)化生產(chǎn)L-蘋(píng)果酸利用固定化乳糖酶可以連續(xù)生產(chǎn)低乳糖奶固定化酵母細(xì)胞等微生物可用于生產(chǎn)各種酒類固定化酶和細(xì)胞原理固定化原生質(zhì)體的應(yīng)用研究中：固定后化枯草桿菌原生質(zhì)體生產(chǎn)堿性磷酸酶，使原來(lái)存在于細(xì)胞中的堿性磷酸酶，全部分泌到發(fā)酵液中，提高產(chǎn)率36%，可連續(xù)使用37天。固定化酶和細(xì)胞原理2．固定化酶在醫(yī)藥治療上的應(yīng)用例1固定化青霉素?；?，只要改變pH值等條件，就既可以催化青霉素或頭孢菌素水解生成6-氨基青霉烷酸酸或7-氨基頭孢霉烷酸也可以催化6-APA或7-ACA與其他的羧酸衍生物進(jìn)行反應(yīng)合成新的具有不同惻鏈基團(tuán)的青霉素或頭孢霉素固定化酶和細(xì)胞原理青霉素?；复呋铣深^孢類抗生素

7-ACAasnucleus固定化酶和細(xì)胞原理青霉素?；复呋铣深^孢類抗生素7-ACCAor7-ADCAasnucleus固定化酶和細(xì)胞原理酶促合成頭孢類抗生素

++Esterase

HydrolaseSynthetase固定化酶和細(xì)胞原理工藝路線

（1）大腸桿菌的培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基為普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為蛋白胨、氯化鈉、苯乙酸、自來(lái)水。用氫氧化鈉調(diào)酸度為7.0，在55。16kP下滅菌30分后備用。在250毫升搖瓶中加入發(fā)酵液培養(yǎng)液30毫升，將斜面接種后培養(yǎng)18-30小時(shí)的大腸桿菌D816（產(chǎn)青霉素?；福?，用15毫升無(wú)菌水制成菌細(xì)胞懸液，取1毫升懸浮液接種至裝有30毫升發(fā)酵液培養(yǎng)基的搖瓶中，在搖床上28℃，170轉(zhuǎn)每分振蕩培養(yǎng)15小時(shí)，如此依次擴(kuò)大培養(yǎng)，直至1000-2000升規(guī)模通氣攪拌培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后用高速管式離心機(jī)收集菌體，備用。

固定化酶和細(xì)胞原理2）大腸桿菌固定化取濕菌體100公斤，置于40度反應(yīng)罐中，在攪拌下加入50升10%戊二醛5升，在轉(zhuǎn)移至搪瓷盤(pán)中，使之成為3-5厘米厚的液層，室溫放置2小時(shí)，再轉(zhuǎn)移至4度冷庫(kù)過(guò)夜，待形成固體凝膠后，通過(guò)粉碎和過(guò)篩，使其成為直徑為2毫米左右的顆粒狀固定化大腸桿菌細(xì)胞，用蒸餾水以酸度7.5和0.3摩爾每升磷酸緩沖液先后充分洗滌，抽干，備用。

（3）固定化大腸桿菌反應(yīng)堆制備將上述充分洗滌后的固定化大腸桿菌細(xì)胞裝填于帶保溫夾套的填充式反應(yīng)器中，即成為固定化大腸桿菌反應(yīng)堆，反應(yīng)器規(guī)格為直徑70*160厘米。

固定化酶和細(xì)胞原理4）轉(zhuǎn)化反應(yīng)取20公斤青霉素G鉀鹽，加入到1000升配料罐中，用0.03摩爾每升、pH7.5的磷酸緩沖液溶解并使青霉素G鉀鹽濃度為3%，用2摩爾每升氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.5-7.8，然后將反應(yīng)器及pH調(diào)節(jié)罐中反應(yīng)液溫度升刀0度，維持反應(yīng)體系的酸度在7.5-7.8范圍內(nèi)，以70每分70升流速使青霉素G鉀鹽溶液通過(guò)固定化大腸桿菌反應(yīng)堆進(jìn)行循環(huán)轉(zhuǎn)化，直至轉(zhuǎn)化液酸度不變?yōu)橹?。循環(huán)時(shí)間一般為3-4小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，放出轉(zhuǎn)化也8，再進(jìn)入下一批反應(yīng)。固定化酶和細(xì)胞原理（5）6-氨基青霉烷酸的提取上述轉(zhuǎn)化液經(jīng)過(guò)濾澄清后，濾液用薄膜濃縮器減壓濃縮至100升左右，冷卻至室溫后，于250升攪拌罐中加50升醋酸丁脂充分?jǐn)嚢杼崛?0-15分，取下層水相，加1%克每毫升活性炭于70度攪拌脫色30分，濾除活性炭，濾液用6摩爾每升鹽酸調(diào)酸度至4左右，5度放置結(jié)晶過(guò)夜，次日濾取結(jié)晶，用少量冷水洗滌，抽干，115度烘2-3小時(shí)得成品6-氨基青霉烷酸，收率為70-80%。

固定化酶和細(xì)胞原理例2：制造人工腎利用固定化脲酶透析液和活性炭一起制成的體外循環(huán)裝置，大大提高了療效。固定化脲酶由酶與離子交換樹(shù)脂一起制成微小膠囊尿酶可分解尿素為NH3和CO2，NH3被樹(shù)脂吸附，CO2可由肺部排出，活性炭用以吸附尿素以外的代謝廢物。

固定化酶和細(xì)胞原理例3固定化酶法生產(chǎn)5’—復(fù)合單核苷酸

5’—復(fù)合單核苷酸可用于治療白血球下降、血小板減少以及肝功能失調(diào)等疾病。核糖核酸經(jīng)磷酸二脂酶作用，可分解為腺苷、胞苷、尿苷、鳥(niǎo)苷等一磷酸化合物，該磷酸二脂酶存在于桔青霉細(xì)胞、谷氨酸發(fā)酵菌細(xì)胞、麥芽根等生物材料中，本法以麥芽根為材料制備磷酸酶。

固定化酶和細(xì)胞原理工藝路線：

1、磷酸二脂酶的制備取干麥芽根，加9-10倍體積的水，用2摩爾每升的鹽酸調(diào)酸度至5.2，于30度條件下浸泡15-20小時(shí)，然后加壓去渣，浸出液過(guò)濾，濾液冷卻至5度，加入2.5倍體積的5度95%冷工業(yè)酒精，5度靜置2-3小時(shí)后，吸去上層清夜，回收乙醇，下層離心收集沉淀，用少量丙酮以乙醚先后洗滌2-3次，真空干燥，粉碎得到磷酸二脂酶，備用。

2、固定化磷酸二脂酶的制備取上述磷酸二脂酶200克，用1.5%硫酸銨溶液溶解，過(guò)濾得到酶液。另取濕ABXE-纖維素40公斤，加入0-5度蒸餾水至80升，攪拌下先后加入1摩爾每升鹽酸和5%亞硝酸鈉溶液各10升，攪拌均勻，于0-5度下反應(yīng)，150分，抽濾，濾餅迅速用預(yù)冷的0.05摩爾每升鹽酸和蒸餾水各洗3次，抽干后，將濾餅投入上述磷酸二脂酶溶液中，攪拌均勻后用1摩爾每升碳酸鈉溶液調(diào)pH8.0，攪拌反應(yīng)30分，用冷水洗3-4次，抽干，得到固定化磷酸二脂酶，備用。

固定化酶和細(xì)胞原理3、轉(zhuǎn)化反應(yīng)取2公斤核酸，緩慢假如預(yù)熱至60-70度的360升、pH5.00.001摩爾每升氯化鋅溶液中，用摩爾每升氫氧化鈉溶液調(diào)至pH5.0-5.5，濾除沉淀，將清液升溫至70度，加入上述濕的固定化磷酸二脂酶40公斤，，于67度維持pH5.0-5.5，攪拌反應(yīng)1-2小時(shí)，根據(jù)增色效應(yīng)，用紫外吸收法判斷轉(zhuǎn)化平衡點(diǎn)，轉(zhuǎn)化完成后，濾出轉(zhuǎn)化液，用于分離5’—單核苷酸，固定化酶再繼續(xù)用于下一批轉(zhuǎn)化反應(yīng)固定化酶和細(xì)胞原理4、5’—復(fù)合單核苷酸的分離純化將上述轉(zhuǎn)化液用6摩爾每升的鹽酸調(diào)酸度至3，濾除沉淀，，濾液用6摩爾每升氫氧化鈉調(diào)酸度至7，進(jìn)入已處理好的氯-型陰離子交換樹(shù)脂柱，流速為2-2.5升每分，吸附后，用250-300升去離子水洗滌柱床，然后用3%氯化鈉溶液以1-1.2升每分流速洗脫，當(dāng)流出液pH達(dá)到7時(shí)開(kāi)始部分收集，直至洗脫液中不含核苷酸為止，合并含核苷酸鈉的洗脫液進(jìn)行精制。固定化酶和細(xì)胞原理5、精制及灌封上述核苷酸鈉溶液用薄膜濃縮器濃縮后，測(cè)定核苷酸含量，再用無(wú)熱源水稀釋至20毫克每毫升，加入0.5-1.0%藥用活性炭，煮沸10分，脫色和除熱源，濾除活性炭，濾液經(jīng)除6號(hào)菌漏斗或0.45微米孔徑的微孔濾膜過(guò)濾除菌后灌封，即為5’—復(fù)合單核苷酸。固定化酶和細(xì)胞原理3．固定化酶在分析化學(xué)中應(yīng)用酶柱和酶管，可與分光光度計(jì)、熒光計(jì)或電量計(jì)結(jié)合，形成酶電極，進(jìn)行某些物質(zhì)的自動(dòng)分析。固定化酶和細(xì)胞原理固定化酶的應(yīng)用及其發(fā)展前景1．固定化酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用固定化酶在食品工業(yè)中主要被應(yīng)用于制糖、酒類釀造、果汁加工、乳制品生產(chǎn)、茶葉煙葉加工等方面。固定化葡萄糖異構(gòu)酶是世界上固定化酶應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中規(guī)模最大的一種,它可以用來(lái)催化玉米糖漿和淀粉生產(chǎn)高甜度的高果糖糖漿。固定化酶和細(xì)胞原理自1972年這項(xiàng)技術(shù)產(chǎn)生以來(lái),科學(xué)家已經(jīng)固定了幾種芽孢桿菌和鏈霉菌中提取的葡萄糖異構(gòu)化酶,并大量應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。從目前的資料分析,不論是在我國(guó)還是在國(guó)際上,今后幾十年中它還將是應(yīng)用最廣、市場(chǎng)份額最大的固定化酶。用淀粉生產(chǎn)高果糖漿包含3步:一是用淀粉酶液化淀粉;二是用糖化酶將其轉(zhuǎn)化為葡萄糖,即糖化;三是用葡萄糖異構(gòu)酶將葡萄糖異構(gòu)為果糖。由此可得到含高果糖漿與蔗糖同等甜度時(shí),其價(jià)格低10%~20%,具有經(jīng)濟(jì)推動(dòng)力。該固定化酶常用的制備技術(shù)是熱處理法,將含葡萄糖異構(gòu)酶的放線菌、芽孢桿菌或鏈霉菌等細(xì)胞用60~65℃熱處理15min,該酶就固定在菌體上制成固定化酶。固定化酶和細(xì)胞原理

在啤酒釀造，果汁加工中，固定化酶都有極好的提高澄清度的作用。如采用吸附—交聯(lián)法,使胰蛋白酶先吸附于磁性膠體粒子表面,后用戊二醛雙功能試劑交聯(lián),形成“酶網(wǎng)”裹著載體形成固定化酶,該磁性酶對(duì)啤酒澄清防止冷渾濁有明顯效果。而我們?cè)诟咧猩飳?shí)驗(yàn)課上也學(xué)習(xí)過(guò)用固定化果膠酶來(lái)提高果汁的出汁率和澄清度。固定化酶和細(xì)胞原理

乳糖酶亦稱為β-半乳糖苷酶,是工業(yè)中應(yīng)用相當(dāng)廣泛的一種酶,較多地應(yīng)用于乳制品加工中。實(shí)驗(yàn)表明固定化后的乳糖酶生產(chǎn)活性從原來(lái)的21%提高至40%，穩(wěn)定性范圍擴(kuò)大,熱穩(wěn)定性提高,同時(shí)底物乳糖在凝膠中擴(kuò)散不影響固定酶的反應(yīng)速度。使用該固定化酶處理脫脂牛奶,可以在保持原有風(fēng)味的條件下,增加甜度,飲用時(shí)可減少蔗糖用量。現(xiàn)在，多把固定化黑曲霉乳糖酶裝成酶柱，讓牛奶以一定的流速通過(guò)酶柱，以此生產(chǎn)脫乳糖的牛奶。固定化酶和細(xì)胞原理

在茶葉中含有種類繁多的酶,如多酚氧化酶、過(guò)氧化酶、單寧酶、果膠酶等,其對(duì)茶葉的加工或深加工有重要的意義。對(duì)重要酶類的固定化研究,可有效地改善茶葉的品質(zhì)、拓展茶葉深加工的領(lǐng)域和應(yīng)用范圍。而煙葉即使在處理后還是會(huì)有較高含量的淀粉殘留，這會(huì)影響煙質(zhì)，為此需要加酶來(lái)加速淀粉水解。同時(shí),對(duì)固定化酶乳狀液添