第4章

蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu)1蛋白質(zhì)通論1.1形狀和大小按形狀和溶解度分類：纖維狀蛋白質(zhì)：角蛋白、絲蛋白、膠原蛋白不溶于水和稀鹽溶液；結(jié)構(gòu)作用。球狀蛋白質(zhì)：溶解性較好；功能多樣。相對(duì)分子質(zhì)量：6000到1x1061.2構(gòu)象和組織層次構(gòu)型：具有相同結(jié)構(gòu)式的立體異構(gòu)體中取代基在空間的相對(duì)取向。不同的構(gòu)型間的轉(zhuǎn)變需要共價(jià)鍵的斷裂和重新形成。構(gòu)象：具有相同結(jié)構(gòu)式和相同構(gòu)型的分子在空間里可能的多種狀態(tài)。不同的構(gòu)象間轉(zhuǎn)變不需要共價(jià)鍵的斷裂和重新形成。結(jié)構(gòu)層次：一級(jí)結(jié)構(gòu)（1°）（primarystructure)二級(jí)結(jié)構(gòu)（2°）（secondarystructure）超二級(jí)結(jié)構(gòu)（supersecondarystructure）結(jié)構(gòu)域（structuraldomain）三級(jí)結(jié)構(gòu)（3°）（tertiarystructure）四級(jí)結(jié)構(gòu)（4°）（quarternarystructure）各個(gè)結(jié)構(gòu)層次之間的關(guān)系可以作下列表示：一級(jí)結(jié)構(gòu)→二級(jí)結(jié)構(gòu)→超二級(jí)結(jié)構(gòu)→結(jié)構(gòu)域→三級(jí)結(jié)構(gòu)→四級(jí)結(jié)構(gòu)1.3蛋白質(zhì)功能的多樣性催化(酶)調(diào)節(jié)(激素、激活劑）轉(zhuǎn)運(yùn)（血紅蛋白、膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）貯存（卵清蛋白）運(yùn)動(dòng)（肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白）結(jié)構(gòu)成分（角蛋白、膠原蛋白）防御和進(jìn)攻（免疫球蛋白、蛇毒的溶血蛋白）P161-162熒光素酶角蛋白2蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu)（primarystructure):多肽鏈的氨基酸的序列。主要連接鍵：肽鍵肽鍵：反式構(gòu)型二肽三肽四肽寡肽（oligopeptide）

12個(gè)以上，20個(gè)以下氨基酸縮合而成多肽（Polypeptide）20個(gè)以上氨基酸縮合而成肽（peptide）

：由兩個(gè)或兩個(gè)以上的氨基酸通過肽鍵連接而形成的化合物。肽鏈：氨基酸通過肽鍵連接起來而形成的鏈。氨基酸殘基氨基酸殘基N端（游離的氨基）C端（游離的羧基）肽健肽健2.2肽的化學(xué)性質(zhì)雙縮脲反應(yīng)：肽和蛋白質(zhì)特有的。含有兩個(gè)或兩個(gè)以上的肽鍵化合物與CuSO4堿性溶液生成紫紅色或藍(lán)紫色的復(fù)合物。用分光光度計(jì)測定蛋白質(zhì)含量。2.3天然存在的活性肽活性肽（activepeptide）:有許多分子量比較小的多肽以游離狀態(tài)存在，通常都具有特殊的生理功能。①

多肽激素

L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val

L-OrnL-Orn

L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu

短桿菌肽S(環(huán)十肽)

由細(xì)菌分泌的多肽，有時(shí)也都含有D-氨基酸和一些非蛋白氨基酸。如鳥氨酸（Ornithine,縮寫為Orn）。

+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-Met-腦啡肽+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Leu-腦啡肽③腦啡肽與真核生物的RNA聚合酶和牢固結(jié)合④鵝膏蕈堿3蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測定①測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目②拆分蛋白質(zhì)的多肽鏈③斷開多肽鏈內(nèi)的二硫橋④分析每一多肽鏈的氨基酸組成⑤鑒定多肽鏈的N-末端和C-末端殘基⑥裂解多肽鏈成較小的片段⑦測定個(gè)肽段的氨基酸序列⑧重建完整多肽鏈的一級(jí)結(jié)構(gòu)⑨確定半胱氨酸殘基間形成的S-S交聯(lián)橋位置Sanger于1953年第一個(gè)測定氨基酸序列---牛胰島素（insulin）(獲1958年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng))DNFB(2,4-二硝基氟苯)——N末端2130水解破壞肽健氨基酸混合物柱層析分離測定氨基酸（主要是酸水解，同時(shí)輔以堿水解）3.3氨基酸組成的分析氨基酸組成：用每摩爾蛋白質(zhì)中含有氨基酸殘基的摩爾數(shù)，或每100g蛋白質(zhì)中含有氨基酸的克數(shù)來表示。3.4N末端和C末端氨基酸殘基的鑒定

(1)N末端

①2，4-二硝基氟苯（DNFB)法***②丹磺酰氯（DNS)法③苯異硫氰酸酯（PITC)法*****④氨肽酶法DNFB弱堿性溶液中（DNP-蛋白質(zhì)）黃色化合物（Sanger試劑）與蛋白質(zhì)氨基發(fā)生反應(yīng)酸水解肽健斷開，DNP-基不脫落DNP-氨基酸能溶于有機(jī)溶劑而與其他aa分離層析鑒定DNP-氨基酸①2，4-二硝基氟苯（DNFB)法DNFBDNP-蛋白質(zhì)DNP-氨基酸②丹磺酰氯法（DNS法）

原理與DNFB法相同丹磺?；袕?qiáng)熒光，靈敏度比DNFB法高100倍水解后DNS-氨基酸不需提取直接用層析鑒定。(DNS-氨基酸)③苯異硫氰酸(酯)法（PITC法、Edman降解法）PITC弱堿性條件下與末端氨基反應(yīng)PTC-肽PTH-氨基酸酸性有機(jī)溶劑加熱層析鑒定特點(diǎn)：剩下的肽鏈仍是完整的。每次只從蛋白質(zhì)的N端解離和鑒定一個(gè)aa殘基還可用來測定氨基酸序列④氨肽酶法肽鏈外切酶，從肽鏈N-末端逐個(gè)降解，釋放出游離氨基酸。AlaValGlyAla-Val-Gly局限性：酶對(duì)各種肽鍵敏感性不一樣，常常難以判斷氨基酸殘基的順序。(2)C末端

①還原法②肼解法③羧肽酶法C末端氨基酸硼氫化鋰還原α氨基醇肽鏈水解層析法鑒定①硼氫化鋰還原法

②肼解法

多肽與肼在無水條件下加熱，可斷裂所有的肽鍵，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的酰肼化合物。肼解下來的C末端氨基酸可用層析鑒定。③羧肽酶法

肽鏈外切酶，從肽鏈C-末端逐個(gè)降解，釋放出游離氨基酸。反應(yīng)時(shí)間氨基酸釋放量3.5多肽鏈的部分裂解和肽段混合物的分離純化①酶裂解法**：（酶的專一性）A胰蛋白酶(Trypsin）：R1=賴氨酸、精氨酸但R2=脯氨酸抑制B胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）：R1=苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸但R2=脯氨酸抑制C嗜熱蛋白酶：R2=亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸D胃蛋白酶:R1和R2=苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸

溴化氰（CNBr）:只斷裂Met的羧基形成的肽健Met殘基高絲氨酸內(nèi)酯殘基②化學(xué)裂解法：3.6肽段氨基酸序列的測定肽部分水解后，降解成長短不一的小肽段，用層析或電泳分離，然后測序。①Edman化學(xué)降解法（PITC）1950年EdmanP.首先提出多肽的游離末端NH2+PITC→PTC-多肽→(PTC-氨基酸)（環(huán)化）→PTH-氨基酸+減少一個(gè)殘基的肽②根據(jù)核苷酸序列的推定法多用兩種水解方法降解，得到兩套肽段，經(jīng)兩套肽段序列的重疊拼接得到整個(gè)肽鏈全長序列。3.7肽段在多肽鏈中次序的決定氨基末端殘基H羧基末端殘基S第一套肽段OUSPS

EOVERLAHOWT第二套肽段SEOWTOU

VERLAPSHO末端殘基HS末端肽段

HOWT

APS第一套肽段第二套肽段HOWTHOWTOUOUSSEOEOVEVERLRLAAPSPS溴化氰胰蛋白酶DNFB38N:(E)

Glu斷開二硫鍵K：LysR：ArgM：MetC:(D)Asp3.8二硫橋位置的確定胃蛋白酶水解(專一性低，切點(diǎn)多；作用pH（~2）防止二硫鍵發(fā)生交換反應(yīng)）Brown及Hartlay的對(duì)角線電泳技術(shù)（過甲酸斷裂二硫鍵）對(duì)角線電泳4蛋白質(zhì)的氨基酸序列與生物功能同源蛋白質(zhì)的物種差異與生物進(jìn)化同源蛋白質(zhì)：在不同生物體中行使相同或相似功能的蛋白質(zhì)。氨基酸序列同源，如血紅蛋白。不變殘基、可變殘基細(xì)胞色素c：含血紅素的電子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。存在于所有真核生物的線粒體中。28個(gè)不變殘基。兩個(gè)物種的同源蛋白質(zhì)的序列間的氨基酸差異數(shù)目與這些物種間系統(tǒng)發(fā)生差異是成比例的。細(xì)胞色素c人與黑猩猩——0；人與其他哺乳動(dòng)物——10；人與酵母——40以上。系統(tǒng)樹：分析細(xì)胞色素c序列并找出連接分支的最小突變殘基數(shù)的方法。5肽和蛋白質(zhì)的人工合成1958年，北京大學(xué)生物系在國內(nèi)首次合成具有生物活性的八肽----催產(chǎn)素。1965年9月，中國科學(xué)院生物化學(xué)研究所、有機(jī)化學(xué)研究所和北京大學(xué)化學(xué)系協(xié)作，在世界上首次人工合成了結(jié)晶牛胰島素。肽的人工合成①液相合成法N端→C端氨基和羧基保護(hù)劑及激活劑②固相肽合成①液相合成法（1）一個(gè)氨基酸的氨基和另一個(gè)氨基酸的羧基被保護(hù)基封閉羧基保護(hù)基(Z)：甲酯（CH3O-）、乙酯（C2H5O-）

在室溫下皂化除去保護(hù)基：接肽時(shí)起保護(hù)作用，接肽后容易除去，又不引起肽健斷裂。氨基保護(hù)基(Y)：芐氧甲?；–bz）可用催化加氫或用金屬鈉在液氨中處理除去（2）在縮合劑作用下縮合形成二肽(肽鍵不能自發(fā)形成)縮合劑：N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）（3）接肽完成后除去保護(hù)基缺點(diǎn)：步驟多，產(chǎn)率低②

固相肽合成（1）第一個(gè)氨基酸(N端被保護(hù))的羧基端先和(氯甲基聚苯乙烯)樹脂反應(yīng)，形成芐酯。（3）第二個(gè)氨基酸（氨基預(yù)先用叔丁氧甲?；Ｗo(hù)）,以DCC為縮合劑，接在第一個(gè)氨基酸的氨基上。重復(fù)這個(gè)方法。（4）最后使多肽與樹脂分離，同時(shí)除去保護(hù)基。（2）除去該氨基酸N端的保護(hù)基固相肽合成掛接去保護(hù)活化羧基氨基保護(hù)縮合斷裂與去保護(hù)Exercise由下列信息求八肽的序列。（a）酸水解得Ala，Arg，Leu，Met，Phe，Thr，2Val；（b）Sanger試劑處理得DNP-Ala；（c）胰蛋白酶處理得Ala，Arg，Thr和Leu，Met，Phe，2Val，當(dāng)以Sanger試劑處理時(shí)分別得到DNP-Ala和DNP-Val；（d）溴化氰處理得Ala，Arg，高絲氨酸內(nèi)酯，Thr，2Val，和Leu，Phe，當(dāng)用Sanger試劑處理時(shí)，分別得DNP-Ala和DNP-Leu。答：（1）酸水解得Ala，Arg，Leu，Met，Phe，Thr，2Val；可知氨基酸的種類和數(shù)量（2）

Sanger試劑處理得DNP-Ala由于Sanger試劑(DNFB)反應(yīng)可鑒定N末端氨基酸殘基，所以Ala位于此八肽的N端。N末端:Ala(3)胰蛋白酶處理→以Sanger試劑處理,胰蛋白酶：水解Lys和Arg的羧基形成的肽健Ala，Arg，Thr和DNP-AlaN末端:Ala三肽順序?yàn)锳la-Thr-ArgLeu，Met，Phe，2Val，和DNP-ValN末端:ValAla-Thr-Arg–Val…..(4)溴化氰處理→Sanger試劑處理由于溴化氰（CNBr）斷裂Met的羧基形成的肽健Ala，Arg，高絲氨酸內(nèi)酯，Thr，2Val和DNP-AlaN