血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的測定（King法）【目的要求】1.掌握血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測定的基本原理。2.熟悉血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測定的具體操作方法。3.了解血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測定的臨床意義?！驹怼可餀C體內(nèi)轉(zhuǎn)氨基作用是α-氨基酸的氨基通過酶促作用轉(zhuǎn)移到α－酮酸的酮基位置上，生產(chǎn)相應(yīng)的酮酸和氨基酸的化學反應(yīng)。催化這反應(yīng)的酶稱為轉(zhuǎn)氨酶（transaminase），其輔酶為磷酸吡哆醛。轉(zhuǎn)氨酶廣泛存在于機體的各種組織中，在肝、心、腎等組織中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamicpyruvictransaminase,GPT），谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamicoxalacetictransaminase,GOT）活性較高。在正常的新陳代謝過程中，血清內(nèi)維持一定水平的轉(zhuǎn)氨酶活性（即正常值）。當肝、心、腎等組織發(fā)生病變時，由于組織細胞腫脹，壞死導致大量的酶釋放至血流中，從而引起血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活性顯著升高。因此測定這些酶的活性對某些疾病的臨場診斷具有重要的參考價值。

生成的丙酮酸可與起終止和顯色作用的2,4二硝基苯肼發(fā)生加成反應(yīng)，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，進而在堿性環(huán)境中生成紅棕色的苯腙硝醌化合物，其顏色的深淺在一定范圍內(nèi)與丙酮酸的生成量，亦即與ALT活性的高低成正比關(guān)系。據(jù)此與同樣處理的丙酮酸標準液相比較，便可算出或通過標準曲線查出血清中ALT的活性。

King氏法谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性單位：每毫升血清在37℃與pH7.4的基質(zhì)液作用60min，生成1μmol丙酮酸為一個單位。臨床檢驗取血清量為0.1mL，報告數(shù)據(jù)以100mL血清計算，因此實際測得結(jié)果乘1000即可。例如0.1mL丙酮酸標準液中丙酮酸含量為0.2μmol，即相當GPT200U/100mL。試劑與器材1、樣品動物或人血清2試劑1)甲液（1/15mol/L磷酸氫二鈉溶液）稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4，A.R.）9.47g或含十二水磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O，A.R.）23.87g溶于蒸餾水中定容至1000mL。2)乙液（1/15mol/L磷酸二氫鉀溶液）稱取磷酸二氫鉀（KH2PO4，A.R.）9.078g溶于蒸餾水中定容至1000mL。取甲液825mL，乙液175mL混合，此液PH應(yīng)為7.4。3)GPT基質(zhì)液稱取α－酮戊二酸29.2mg（2mmol/L）及α－DL－丙氨酸1.78g（200mmol/L）溶于50mLpH7.4的磷酸緩沖液中，加0.1mol/LNaOH溶液約0.5mL，調(diào)節(jié)pH為7.4，然后加磷酸緩沖液定容至100mL。加少許氯仿防腐，置冰箱中保存。實驗內(nèi)容和步驟1)制備標準曲線2)繪制標準曲線以光吸收值為縱坐標，酶活性單位數(shù)為橫坐標，在坐標紙上繪制各測得A520值與對應(yīng)的酶活性單位數(shù)的標準曲線。3)樣品測定結(jié)果計算標準曲線測定法根據(jù)樣品管A520值（已減去空白管A520）查標準曲線，即得每100mL血清中轉(zhuǎn)氨酶活性單位數(shù)。標準管測定法每次測定酶活性時，同時用丙酮酸標準液（2μmol/mL）0.1mL，平行操作，即按上表操作，不做標準曲線，測定A520按下公式計算：

比色測定法，如：金氏法（King法）、穆氏法（Mohun法）和賴氏法（Reitman-Frankel法）。其原理、試劑、操作步驟及作用溫度等完全相同。不同之處在于作用時間：King法60min，Mohun法和Reiman法30min。因此它們的單位定義和標準曲線制備也不同。King法單位定義是：每1ml血清在37℃條件下與底物作用60min，生成1μmol丙酮酸稱為一個單位。Mohun法單位定義是：每毫升血清在pH=7.4，37℃條件下與底物作用30min，每生成2.5微克丙酮酸為1單位。賴氏法沒有制定自身的單位定義，而是以實驗數(shù)據(jù)套用速率法的卡門氏單位作表示的。1個卡門氏單位的定義是：在溫度25℃，pH7.4，波長340nm，光徑1cm的條件下，1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的轉(zhuǎn)氨酶活性?？梢娍ㄩT氏單位不是用物質(zhì)的量濃度，而是用物質(zhì)的吸光度表示酶的活性單位的。若將卡門氏單位的定義條件代入國際單位計算公式，即得卡門氏單位與國際單位的換算關(guān)系：1卡門氏單位=0.4821IU/L(25℃)，便可將卡門氏單位兌換成國際單位。注意事項1)為防止溶血及其他因素對酶活性測定的影響，實驗過程所用的一切器皿（注射器、試管等）應(yīng)清洗干凈，干燥后方能使用。2)空腹取血，避免血脂干擾。迅速分出血清，及時測定。3)作為標準物質(zhì)的丙酮酸鈉極易變質(zhì)。配試劑時應(yīng)選擇外觀潔白干燥者。若顏色變黃或潮解，則應(yīng)重結(jié)晶，干燥至衡重后再用。丙酮酸鈉重結(jié)晶：取純丙酮8份與蒸餾水2份混合，加入變質(zhì)的丙酮酸鈉使其達到飽和。此時溶液上層無色，下層有棕黃色油狀物。取出上層無色液體置燒杯中，加入兩倍體積的丙酮（無水）混勻后，置冰箱中數(shù)小時，則有白色丙酮酸鈉析出，用布氏漏斗收集沉淀，并用純丙酮洗滌兩次，抽干后，置干燥器內(nèi)，保存、備用。4)轉(zhuǎn)氨酶只能作用于α－L－氨基酸（L－天冬氨酸，L－丙氨酸），對D－氨基酸無催化作用。實驗室多用α－DL氨基酸（因較L－氨基酸價廉），如采用α―L―氨基酸,則需按α－DL氨基酸的用量減半。5)為保證操作結(jié)果可靠，測定酶活性時應(yīng)恒定PH