病毒的分離鑒定第1頁/共22頁一、病毒的分離標本的處理蚊蟲；蜱；蠓等；血清；腦脊液等；動物組織標本（腦，肺，脾等）病毒的分離動物接種組織培養(yǎng)雞胚培養(yǎng)蚊蟲飼養(yǎng)分離病毒“全程冷鏈”第2頁/共22頁1．動物接種動物分離病毒法：乳小白鼠（3日齡）優(yōu)點：很敏感，易掌握；病毒可隨傳代次數(shù)的增加而增強，有利于病毒分離；缺點：小白鼠本身存在多種病毒性疾病，往往會影響結(jié)果；小鼠也可能存在個體差異；接種途徑：腦內(nèi)接種皮下接種皮內(nèi)接種腹腔接種肌肉接種靜脈接種實驗動物的觀察：動物的發(fā)育、活動力、食欲和糞便特殊癥狀：震顫、弓背、不安、嗜睡、癱瘓、抽搐等直至死亡有些實驗還需測量動物的體溫和體重第3頁/共22頁（1）原代和次代細胞培養(yǎng)（2）二倍體細胞培養(yǎng)（3）傳代細胞培養(yǎng)

（4）病毒在培養(yǎng)細胞中增殖的指標

1）細胞病變

2）紅細胞吸附

3）干擾現(xiàn)象

4）細胞代謝的改變組織培養(yǎng)分離法：沒有隱性感染沒有免疫能力的抵抗力接種量大培養(yǎng)條件易于控制加速病毒的分離過程漢坦病毒敏感的培養(yǎng)細胞首先發(fā)現(xiàn)人肺癌細胞（A549）其他敏感細胞：Vero-E6、2BS、RL、CEC等2．組織培養(yǎng)第4頁/共22頁細胞病變（CPE）：1、分布均勻的小顆粒狀破壞病變；2、局灶狀小顆粒狀破壞；3、細胞圓化，呈局灶性葡萄狀的堆積；4、細胞融合。圓縮；脫落；聚集；破碎；第5頁/共22頁3．雞胚培養(yǎng)優(yōu)點：對大多數(shù)病毒均較敏感，其病毒繁殖量較高；來源方便、經(jīng)濟，管理方便；缺點：操作不當污染，導致胚胎死亡；4．蚊蟲分離病毒法經(jīng)口感染胸腔接種優(yōu)點：病毒可長時間保存在蚊體內(nèi)；蚊蟲飼養(yǎng)較實驗動物容易，數(shù)量大；缺點：必須經(jīng)常了解蚊子體內(nèi)是否確已帶毒；第6頁/共22頁強調(diào)點：實驗室生物安全實驗室安全是重中之重，如果實驗室的條件不具備，建議不要開展病毒分離工作；在進行相關(guān)實驗的時候一定要嚴格按步驟操作；實驗過程中一定要做好嚴格防護。第7頁/共22頁1）蝕斑（plaque）測定

可進行病毒的分離純化；蝕斑形成單位（plaqueformingunit,PFU）

2）50%感染量或50%組織感染量（ID50或TCID50）測定（一）病毒的數(shù)量與感染性測定

二、病毒的鑒定結(jié)晶紫染色中性紅染色第8頁/共22頁

1）病毒核酸類型的測定

2）理化性狀的檢測：大小及結(jié)構(gòu)、衣殼對稱類型、有無包膜等

3）血清學鑒定ELISA；IFA；（二）病毒理化性質(zhì)及血清學鑒定第9頁/共22頁陽性分離物上清提取總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA直接測序或克隆測序PCR擴增（三）病毒分子生物學鑒定第10頁/共22頁什么是聚合酶鏈式反應(yīng)聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）是一種在體外特異地擴增已知基因的方法；由K.Mullis于1983年建立；可用于分析基因及其產(chǎn)物的水平變化；可進行實時、定量分析；可結(jié)合免疫沉淀的方法確定蛋白質(zhì)與DNA序列的相互作用。

第11頁/共22頁PCR技術(shù)的工作原理PCR操作過程1、預變性（Initialdenaturation）：

模板DNA完全變性對PCR能否成功至關(guān)重要，一般95℃加熱3-5分鐘；2、引物退火（Primerannealing）：退火溫度一般需要憑實驗經(jīng)驗決定，退火溫度對PCR的特異性有較大影響；3、引物延伸（Primerelongation）：引物延伸一般在72℃進行（Taq酶最適溫度），延伸時間隨擴增片段長短而定；4、循環(huán)中的變性步驟：循環(huán)中一般95℃，30秒足已使各種靶DNA序列完全變性，變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴增失??；5、循環(huán)數(shù)：大多數(shù)PCR含25-35個循環(huán)，過多易產(chǎn)生非特異條帶；6、最后延伸：在最后一個循環(huán)后，反應(yīng)在72℃維持5-15分鐘，使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。第12頁/共22頁PCR的各種變體反向PCR（InversePCR，IPCR）不對稱PCR（AsymmetricPCR）多重PCR熒光定量PCR（Q-PCR）反轉(zhuǎn)錄PCR（ReversetranscriptionPCR，RT-PCR）巢式PCR（NESTPCR）遞減PCR（TouchdownPCR）第13頁/共22頁可用于mRNA的半定量分析

反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscription-PCR，RT-PCR)是一種簡單、快捷地對RNA進行定性、定量分析的方法。它是以mRNA為模板，體外擴增cDNA，再以cDNA為模板進行特定基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的PCR擴增。RT-PCR技術(shù)一般用于RNA的定性分析；如果設(shè)置陽性參照，則可對待測RNA樣品進行半定量分析。該方法適合對待測樣品進行初步篩選，目前已廣泛被實時定量PCR替代。1．反轉(zhuǎn)錄PCRTrans反轉(zhuǎn)錄酶系列第14頁/共22頁常用于mRNA的定量分析實時定量PCR(Real-timeQuantitativePolymerasechainReaction,RQ-PCR)是定量分析mRNA的最通用、最快速、最簡便的方法，該方法是對PCR反應(yīng)進行實時監(jiān)測，具有很高的靈敏度和特異性。2．實時定量PCRSYBRGreen實時定量PCR分析原理示意圖第15頁/共22頁*目前有5種技術(shù)用于實時定量PCR

其中最經(jīng)濟、簡便的技術(shù)是利用熒光染料（如SYBRGreen

）與雙鏈DNA分子結(jié)合發(fā)光的特性，指示擴增產(chǎn)物的增加；其他4種方法都是以熒光染料標記的寡核苷酸為探針與正確的擴增子雜交，包括5’核酸酶法（即人們熟知的TaqManTM）、分子信標、ScropionsTM和探針雜交法，它們擁有更強的特異性，可以避免對PCR后溶解曲線的需求，以及后續(xù)的Southern雜交或?qū)U增子的測序鑒定，但是成本較高。第16頁/共22頁3.DNA芯片技術(shù)DNA芯片（DNAchip）在固相支持物上有序固化寡核苷酸或DNA探針，與待測熒光標記樣品進行雜交；通過對雜交信號的檢測、比較和分析，得出樣品的遺傳信息(基因序列及表達)；亦被稱作DNA微陣列(DNAmicroarray)?；蛐酒ぷ髁鞒痰?7頁/共22頁三、生物信息學是預測基因組結(jié)構(gòu)和功能的重要手段數(shù)據(jù)庫的建設(shè)：匯集了大量DNA序列、蛋白質(zhì)信息預測基因、基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、功能；分析基因-基因、基因-產(chǎn)物、產(chǎn)物-產(chǎn)物之間的相互作用或聯(lián)系；描述細胞或整體水平的基因表達譜；推測系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。人類X染色體圖譜第18頁/共22頁NCBI數(shù)據(jù)庫NCBI首先創(chuàng)建GenBank數(shù)據(jù)庫

于1991年開發(fā)了Entrez數(shù)據(jù)庫檢索系統(tǒng)，該系統(tǒng)整合了GenBank、EMBL、PIR和SWISS-PROT等數(shù)據(jù)庫的序列信息以及MEDLINE有關(guān)序列的文獻信息，并通過相關(guān)鏈接，將他們有機地結(jié)合在一起NCBI還提供了其他數(shù)據(jù)庫，包括在線人類孟德爾遺傳(OMIM）、三維蛋白結(jié)構(gòu)的分子模型數(shù)據(jù)庫（MMDB）、人類基因序列集成（UniGene）、人類基因組基因圖譜（GMHG）、生物門類（Toxonomy）等數(shù)據(jù)庫第19頁/共22頁

引物設(shè)計-PrimerPremier5.0PCR擴增和序列測定

序列拼接DNAS