細胞分離與破碎第1頁/共44頁第2頁/共44頁第3頁/共44頁2.2.1細胞的結(jié)構(gòu)

細菌：肽聚糖，多糖，磷壁酸，主要阻力來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白質(zhì)，主要阻力來自于壁結(jié)構(gòu)交換的緊密程度和厚度。真菌：多糖，蛋白質(zhì)，脂類，葡聚糖，幾丁質(zhì)，主要阻力來自于壁強度和聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。細胞壁的組成和破碎阻力第4頁/共44頁第5頁/共44頁第6頁/共44頁各種微生物細胞壁的結(jié)構(gòu)與組成

第7頁/共44頁動物細胞第8頁/共44頁植物細胞模式圖第9頁/共44頁細胞對破碎的敏感度第10頁/共44頁2.2.2細胞破碎和產(chǎn)物釋放原理

物理法化學法固體剪切法(珠磨法)酶溶法液體剪切法化學降解法（酸堿法）撞擊法表面活性劑法超聲法有機溶劑膨脹法滲透法萃取法第11頁/共44頁細胞破碎理論

1)、細胞破碎A壓撞B剪切Ca滲透Cb凍脹D破壁破膜第12頁/共44頁剪切力F:假定細胞直徑為d(in:m)，維持球體所需的綜合維持力為σ(in:N/m)，則破碎細胞所需F(in:Pa)為如利用流體剪切力(Pa)的作用，則在牛頓流體中則破碎細胞所需的速度梯度為：意義：細胞直徑，所需壓力或剪切力，破碎難度。細胞破碎理論第13頁/共44頁細胞破碎理論滲透壓法：滲透壓差()為c=細胞內(nèi)外小分子的濃度差，R=氣體常數(shù)，T=絕對溫度。2)、產(chǎn)物釋放如細胞破碎速度與未破碎細胞濃度x成正比，則有kB為細胞破碎常數(shù)第14頁/共44頁細胞破碎理論如破碎cell產(chǎn)物釋放的速度與cell內(nèi)外的濃度差成正比，則有cin為破碎的細胞內(nèi)產(chǎn)物濃度，cm為產(chǎn)物的最大釋放濃度，x0為起始細胞濃度，從上三式得上式為兩步釋放的速度方程，如細胞破碎或產(chǎn)物釋放的其中一步很快，則表現(xiàn)為一級動力學釋放過程，此時方程為破碎速度控制過程：釋放速度控制方程：第15頁/共44頁2.2.3 細胞破碎技術(shù)

2.2.3.1機械破碎主要有高壓勻漿、珠磨、撞擊破碎和超聲波破碎等方法第16頁/共44頁2.2.3 細胞破碎技術(shù)

1)、固體剪切法(珠磨法,c最有效的物理破碎法)操作簡介第17頁/共44頁2.2.3 細胞破碎技術(shù)

計算破碎遵循一級動力學定律,即

對上述方程積分得

對于n次連續(xù)攪拌研磨操作，則得蛋白質(zhì)的物料平衡式

k破碎速率常數(shù)，：平均停留時間，V：磨腔的總體積，Q：發(fā)酵液的流量。第18頁/共44頁2.2.3 細胞破碎技術(shù)影響因素a)轉(zhuǎn)盤外緣速度(見下圖)： 適合條件：圓盤外緣速度<20m/s,一般在5-15m/s。b)珠粒添量和大小 添量：(見上圖，添量體積一般占總體積的80-90%)

粒徑：一般在0.2mm(實驗室),<0.4mm(工業(yè))。最終由實驗確定第19頁/共44頁通常選用的微珠粒徑與目標細胞的直徑比應(yīng)在30-100之間第20頁/共44頁2.2.3 細胞破碎技術(shù)c)溫度：溫度在5-40C范圍內(nèi)對破碎影響較小。但研磨產(chǎn)熱，功率，溫度。如產(chǎn)物熱不穩(wěn)定，必須控溫。d)細胞濃度x：最佳x由實驗確定。一般產(chǎn)熱量隨細胞濃度的降低而下降，但單位細胞重量的能耗。通常懸液中細菌細胞質(zhì)量濃度在60-120g/L、酵母細胞質(zhì)量濃度在140-10g/L時破碎效果較理想e)破碎效率：

R：每kg成品細胞(如酵母)釋放的蛋白量，Q：物料流量，P’：珠磨機消耗的功率。f)流量Q：破碎為一級反應(yīng)。Q, E，R；Q，E，R。第21頁/共44頁2.2.3 細胞破碎技術(shù)

不同流量和攪拌速度下的效率。-20，-50，-10010-6m3/s流量；1–8，2–10，3–15，4–20m/s外緣速度第22頁/共44頁第23頁/共44頁2.2.3 細胞破碎技術(shù)2)、液體剪切法(最常用的方法之一)操作第24頁/共44頁高壓勻漿器第25頁/共44頁2.2.3 細胞破碎技術(shù)計算服從一級反應(yīng)定律式中，R為protein釋放量，Rm為pro最大釋放量.影響因素操作壓力p：p,R;相反,R

。溫度

2C/10MPa。破碎次數(shù)N：N，R。溫度：比速度k與溫度有關(guān)，溫度25C，k1.5倍。細胞抗破碎系數(shù)a：a酵母=2.9，a大腸桿菌=2.1。細胞種類：影響k值。細胞濃度：Z：常數(shù)，p0：破碎所需的最低壓力，：細胞濃度的參數(shù)。第26頁/共44頁2.2.3 細胞破碎技術(shù)閥門底座：刃緣閥座，平邊閥座優(yōu)點A、在大規(guī)模cell破碎中，高壓勻漿機和珠磨機用得最多;B、高壓勻漿機最適合于酵母和細菌;C、珠磨機可用于酵母和細菌，但對真菌菌絲和藻類更合適.第27頁/共44頁2.2.3 細胞破碎技術(shù)3)撞擊破碎法操作：細胞噴霧高速凍結(jié)

300m/s氮氣流

優(yōu)點：A、細胞破碎僅發(fā)生在撞擊的一瞬間，破碎程度均勻，避免反復和過度破碎；B、破碎的程度可無級調(diào)節(jié)，避免細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞，特別適合于細胞器的回收；C、實驗室和工業(yè)規(guī)模均可應(yīng)用，細胞濃度在10-20%，實驗室規(guī)模的間歇處理能力在50-500mL/h，工業(yè)規(guī)模的連續(xù)處理在10,000mL/h以上。第28頁/共44頁2.2.3 細胞破碎技術(shù)4)超聲破碎法(15—25kHz)第29頁/共44頁超聲波破碎法（Ultrasonication)利用超聲波振蕩器發(fā)射的15-25kHz的超聲波探頭處理細胞懸浮液。超聲波振蕩器有不同的類型，常用的為電聲型，它是由發(fā)生器和換能器組成，發(fā)生器能產(chǎn)生高頻電流，換能器的作用是把電磁振蕩轉(zhuǎn)換成機械振動。超聲波振蕩器以可分為槽式和探頭直接插入介質(zhì)兩種型式，一般破碎效果后者比前者好。第30頁/共44頁2.2.3 細胞破碎技術(shù)機理 在超聲作用下產(chǎn)生的空穴化作用(cavitation)，空穴的形成和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力。優(yōu)點：適合于多種細胞的破碎缺點：A、影響因素多，如振幅、黏度、表面張力、液體體積和流速、探頭材料和形狀；B、超聲產(chǎn)生超氧離子毒害作用；C、有效能量的利用率低；D、產(chǎn)熱大，需控溫；E、不易放大，僅應(yīng)用于實驗室規(guī)模的細胞破碎。第31頁/共44頁2.2.3 細胞破碎技術(shù)2.2.3.2化學破碎法酶溶法、酸堿法、有機溶劑胞溶法、表面活性劑法酶溶法：利用酶分解細胞壁上的化學鍵，使細胞壁破碎。優(yōu)點：A、產(chǎn)品釋放的選擇性；B、提取速度和收效高；C、產(chǎn)品的破壞小；D、對外界環(huán)境，如pH和溫度等要求低；E、不殘留細胞碎片。第32頁/共44頁2.2.3 細胞破碎技術(shù)酶解（酶溶法Enymaticlysis)利用溶解細胞壁的酶處理菌體細胞，使細胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細胞膜，進一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性。溶菌酶（lysozyme)適用于革蘭氏陽性菌細胞的分解，應(yīng)用于革蘭氏陰性菌時，需輔以EDTA使之更有效地作用于細胞壁。真核細胞的細胞壁不同于原核細胞，需采用不同的酶。第33頁/共44頁

自溶作用是酶解的另一種方法，利用生物體自身產(chǎn)生的酶來溶胞，而不需外加其他的酶。在微生物代謝過程中，大多數(shù)都能產(chǎn)生一種能水解細胞壁上聚合物的酶，以便生長過程繼續(xù)下去?？墒?，改變其生長環(huán)境，可以誘發(fā)產(chǎn)生過剩的這種酶或激發(fā)產(chǎn)生其它的自溶酶，以達到自溶目的。2.2.3 細胞破碎技術(shù)第34頁/共44頁酸處理可以使蛋白質(zhì)水解成氨基酸，通常采用6mol/LHCl。堿和表面活性劑能溶解細胞壁上脂類物質(zhì)或使某些組分從細胞內(nèi)滲漏出來。天然的表面活性劑有膽酸鹽和磷脂等合成的表面活性劑可分離子型和非離子型，離子型如十二烷基硫酸鈉（SDS，陰離子型）；十六烷基三甲基溴化銨（陽離子型）。非離子型如TritonX-100和吐溫（Tween）等有機溶劑可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等2.2.3 細胞破碎技術(shù)第35頁/共44頁2.2.3.3物理滲透法滲透壓沖擊法滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，將細胞放在高滲透壓的溶液中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），由于滲透壓的作用，細胞內(nèi)水分便向外滲出，細胞發(fā)生收縮，當達到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋，或?qū)⒓毎D(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，胞外的水迅速滲入胞內(nèi)，引起細胞快速膨脹而破裂。2.2.3 細胞破碎技術(shù)第36頁/共44頁凍結(jié)-融化法將細胞放在低溫下冷凍（約-15℃），然后在室溫中融化，反復多次而達到破壁作用。由于冷凍，一方面能使細胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加細胞的親水性能，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，形成冰晶粒，引起細胞膨脹而破裂。對于細胞壁較脆弱的菌體，可采用此法。2.2.3 細胞破碎技術(shù)第37頁/共44頁機械法和化學法的比較

機械破碎法缺點：A、高能、高溫、高噪音、高剪切力(四高)，易使產(chǎn)品變性失活；B、非專一性，胞內(nèi)產(chǎn)物均釋放，分離純化困難；C、細胞碎片大小不一，難分離。

化學破碎法缺點：A、費用高；B、引起新的污染，尤其是其他化學方法；C、一般只有有限的破碎，常需與其他物理法連用。第38頁/共44頁破碎方法的選擇選擇的一般原則A、提取產(chǎn)物在細胞質(zhì)內(nèi)，用機械法破碎B、提取產(chǎn)物在細胞膜附近，用化學法C、提取產(chǎn)物與細胞膜和細胞壁結(jié)合，可采用化學法和機械法結(jié)合的方法破碎技術(shù)雜交研究應(yīng)注意的問題A、雜交技術(shù)可產(chǎn)生很大優(yōu)勢。B、破碎技術(shù)對下游分離技術(shù)的影響。破碎顆粒清除，產(chǎn)物的分離純化C、在發(fā)酵階段，考慮到發(fā)酵過程和環(huán)境對破碎難易程度的影響D、菌種的培育，胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物第39頁/共44頁細胞破碎的評價

破碎率定義

N0：原細胞數(shù)，N：破碎后殘存的正常細胞。N0和N的可通過直接計數(shù)和間接計數(shù)法得到。直接計數(shù)法方法：樣本稀釋---染色---上樣計數(shù)。計算：同上。優(yōu)點：方法簡單。缺點：A、計數(shù)時間長，B、只有活細胞才被計數(shù)，誤差大，C、細胞聚集時，不利計數(shù)，D、染色誤差。第40頁/共44頁細胞破碎的評價間接計數(shù)法方法：樣本離心

---取上清液

---測特定蛋白質(zhì)或酶

---與理論的最大值比較。計算：

Rm：理論最大值，R：實驗測得值。優(yōu)點：A、方法客觀可靠，尤其對蛋白質(zhì)和酶，B、有多種選擇的指標，胞內(nèi)位置(如胞膜、胞壁、近胞膜蛋白等)，靈活性大。缺點：影響因素多，如溫度、pH值、剪切力、溶液的稀釋等。解決辦法：篩選相對穩(wěn)定和恒定的指標。第41頁/共44頁2.2.4目標產(chǎn)物的選擇性釋放利用珠磨法破碎酵母細胞時，酵母內(nèi)各種酶的釋放速率常數(shù)不同。一般靠近細胞壁和細胞