細(xì)胞表型實(shí)驗(yàn)介紹第1頁/共24頁

細(xì)胞表型實(shí)驗(yàn)介紹20182018年8月30日第2頁/共24頁目錄研究內(nèi)容目的與意義實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)過程結(jié)果分析3第3頁/共24頁細(xì)胞表型實(shí)驗(yàn)定義：由基因型所產(chǎn)生的細(xì)胞的物理表觀和可觀察到的性質(zhì)。研究主要內(nèi)容：細(xì)胞凋亡、周期、遷移、侵襲、趨化、增殖、生長等。細(xì)胞表型分析目的意義：檢測細(xì)胞的表型，可以幫助了解相關(guān)基因、蛋白、藥物的機(jī)理，是科學(xué)研究不可或缺的手段。4第4頁/共24頁1.細(xì)胞凋亡、周期細(xì)胞周期（cellcycle）是指細(xì)胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，分為間期與分裂期兩個(gè)階段。依次經(jīng)過G1-S-G2/M，不同時(shí)期的細(xì)胞內(nèi)部經(jīng)歷精確的調(diào)控，反應(yīng)相應(yīng)的機(jī)理。研究細(xì)胞周期的變化，有利于了解基因、蛋白、藥物對細(xì)胞周期產(chǎn)生的影響，進(jìn)而指導(dǎo)科研工作。細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。細(xì)胞凋亡不僅是一種特殊的細(xì)胞死亡類型，而且具有重要的生物學(xué)意義及復(fù)雜的分子生物學(xué)機(jī)制。5第5頁/共24頁流式細(xì)胞術(shù)61定義：是以流式細(xì)胞儀為檢測手段的一項(xiàng)能快速、精確的對單個(gè)細(xì)胞理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的新技術(shù)。

2.特點(diǎn)測量速度快，每秒鐘能測數(shù)千個(gè)乃至上萬個(gè)細(xì)胞可進(jìn)行多參數(shù)測量在分析的同時(shí)可把具有指定特征的細(xì)胞分離出來，即分選技術(shù)。BD-CaliburBDFACSVantage第6頁/共24頁流式細(xì)胞作用機(jī)制7分析系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)液流系統(tǒng)檢測系統(tǒng)噴嘴FluorescencesignalsFocused

laserbeam鞘液第7頁/共24頁流式細(xì)胞儀可檢測到的細(xì)胞參數(shù)8非熒光信號前向角散射光（FSC）細(xì)胞相對大小及其表面積。

側(cè)向角散射光（SSC）細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的相對復(fù)雜性顆粒度細(xì)胞大小第8頁/共24頁熒光信號9熒光強(qiáng)度（FL）：細(xì)胞上的熒光染料被激光激發(fā)后發(fā)射出的熒光，不同的熒光染料其發(fā)射波長不同。有熒光標(biāo)記的細(xì)胞與無熒光標(biāo)記的區(qū)分開來（陰陽）高FL細(xì)胞與低FL細(xì)胞區(qū)分開來（強(qiáng)弱）一般的流式細(xì)胞儀只裝有一個(gè)激光光源（488nm），可測出三個(gè)FL，即FL1、FL2、FL3。第9頁/共24頁熒光信號與細(xì)胞特性10熒光染料被激發(fā)而發(fā)射的光信號。定量染色熒光信號大小被標(biāo)記組分含量的定量多熒光標(biāo)記胞內(nèi)多種組分，實(shí)現(xiàn)多參數(shù)測量第10頁/共24頁11二色鏡

123帶通濾波片光電倍增管激光束細(xì)胞收集透鏡前向散射光側(cè)向散射光，熒光第11頁/共24頁流式結(jié)果分析12散點(diǎn)圖

密度圖二維等高圖報(bào)告中常見的幾種流式細(xì)胞圖直方圖第12頁/共24頁細(xì)胞周期13流式細(xì)胞儀PI染色法檢測細(xì)胞周期細(xì)胞內(nèi)的DNA和RNA都可以和PI結(jié)合,實(shí)驗(yàn)前需用RNase將RNA消化后進(jìn)行檢測。細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞周期同步細(xì)胞加藥細(xì)胞固定PI染色流式上機(jī)數(shù)據(jù)分析PI：碘化丙啶第13頁/共24頁14細(xì)胞凋亡AnnexinV/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡UL：上左區(qū)；一般認(rèn)為是死亡細(xì)胞,UR：上右區(qū)；認(rèn)為是晚期凋亡細(xì)胞,LL：下左區(qū)；正常陰性細(xì)胞,LR：下右區(qū);早期凋亡細(xì)胞,ps:磷脂酰絲氨酸Annexin-V:Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白第14頁/共24頁2.細(xì)胞遷移劃痕實(shí)驗(yàn):細(xì)胞劃痕法是測定了腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動特性的方法之一。在體外培養(yǎng)的單層細(xì)胞上，劃痕致傷，然后在加入藥物等實(shí)驗(yàn)條件下觀察其對腫瘤細(xì)胞遷移的影響。15①第15頁/共24頁16②③④第16頁/共24頁3.細(xì)胞侵襲

細(xì)胞侵襲:研究腫瘤細(xì)胞的侵襲能力或特定情況下腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。在聚碳酸酯膜上涂上一層基質(zhì)膠，模仿細(xì)胞外基質(zhì)，上室種腫瘤細(xì)胞，下室加入FBS或?qū)嶒?yàn)設(shè)定的藥物或者影響因子，腫瘤細(xì)胞在侵襲能力較強(qiáng)的情況下，會分泌相關(guān)酶類消化基質(zhì)膠，從而從上室遷移到下室，通過計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量測定細(xì)胞的侵襲能力。17第17頁/共24頁Transwell18這是一類有通透性的杯狀的裝置，杯子底層的一張有通透性的膜，這層膜帶有微孔，孔徑大小有0.1－12.0μm，根據(jù)不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonatemembrane）。Transwell小室第18頁/共24頁細(xì)胞侵襲19實(shí)驗(yàn)實(shí)例：孵育24h第19頁/共24頁4.細(xì)胞增殖（克隆形成）20單個(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上（時(shí)間約1周以上），其后代所組成的細(xì)胞群體，成為集落或克隆。每個(gè)克隆含有50個(gè)以上的細(xì)胞，大小在0.3-1.0mm之間。集落形成率表示細(xì)胞的獨(dú)立生存能力強(qiáng)弱。細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的改變或藥物、基因等外源性因素的作用能導(dǎo)致細(xì)胞克隆形成能力以及細(xì)胞集落的大小發(fā)生改變。細(xì)胞感染克隆形成細(xì)胞固定細(xì)胞染色克隆計(jì)數(shù)第20頁/共24頁5.細(xì)胞生長（MTT法）MTT甲瓚SDHDMSO490nm測定OD值MTT法原理MTT比色法：是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。原理：活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀490nm波長處測定其吸光值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。第21頁/共24頁MTT實(shí)驗(yàn)22